Name: subcutaneous administration of muscarinic antagonists and triple-immunostaining of the levator auris longus muscle in mice
Uploaded: 2011-09-08T13:00:00
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Diese Arbeit wurde von Muscular Dystrophy Association, NIH (NS062320) unterstützt.

1. Die subkutane Verabreichung von Muskarin Acetylcholin-Rezeptor (mAChR)-Antagonisten <ol><li> Bereiten Sie unter aseptischen Bedingungen die entsprechende Dosis von mAChR-Antagonist, (vgl. Tabelle), indem man das Medikament in steriler physiologischer Kochsalzlösung in 1,5 ml Reaktionsgefäß. Die folgenden Antagonisten wurden verwendet: Atropin, Methoctramin, 4-DAMP, AFDX-116, AFDX-384, MT 7. </li><li> Draw 50 ul Lösung in a1cc Insulinspritze und eine separate Spritze für jede Maus. Auch bereiten Spritzen mit ph...

<ol>
	<li>Wright, M. C., Son, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliary+neurotrophic+factor+is+not+required+for+terminal+sprouting+and+compensatory+reinnervation+of+neuromuscular+synapses:+re-evaluation+of+CNTF+null+mice.">Ciliary neurotrophic factor is not required for terminal sprouting and compensatory reinnervation of neuromuscular synapses: re-evaluation of CNTF null mice.</a> Exp Neurol. 205, 437-448 (2007).</li><li>Gurney, M. E., Yamamoto, H., Kwon, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+motor+neuron+sprouting+in+vivo+by+ciliary+neurotrophic+factor+and+basic+fibroblast+growth+factor.">Induction of motor neuron sprouting in vivo by ciliary neurotrophic factor and basic fibroblast growth factor.</a> J Neurosci. 12, 3241-3247 (1992).</li><li>Caroni, P., Aigner, L., Schneider, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+neuronal+determinants+locally+regulate+extrasynaptic+and+synaptic+growth+at+the+adult+neuromuscular+junction.">Intrinsic neuronal determinants locally regulate extrasynaptic and synaptic growth at the adult neuromuscular junction.</a> J Cell Biol. 136, 679-692 (1997).</li><li>Witzemann, V., Brenner, H. R., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+factors+regulate+AChR+subunit+mRNAs+at+rat+neuromuscular+synapses.">Neural factors regulate AChR subunit mRNAs at rat neuromuscular synapses.</a> J Cell Biol. 114, 125-141 (1991).</li><li>Angaut-Petit, D., Molgo, J., Connold, A. L., Faille, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+levator+auris+longus+muscle+of+the+mouse:+a+convenient+preparation+for+studies+of+short-+and+long-term+presynaptic+effects+of+drugs+or+toxins.">The levator auris longus muscle of the mouse: a convenient preparation for studies of short- and long-term presynaptic effects of drugs or toxins.</a> Neurosci Lett. 82, 83-88 (1987).</li><li>Lanuza, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-+and+postsynaptic+maturation+of+the+neuromuscular+junction+during+neonatal+synapse+elimination+depends+on+protein+kinase.">Pre- and postsynaptic maturation of the neuromuscular junction during neonatal synapse elimination depends on protein kinase.</a> C. J Neurosci Res. 67, 607-617 (2002).</li><li>Garcia, N., Santafe, M. M., Tomas, M., Lanuza, M. A., Tomas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+effects+of+beta-amyloid25-35+peptide+aggregates+on+transmitter+release+in+neuromuscular+synapses.">Short-term effects of beta-amyloid25-35 peptide aggregates on transmitter release in neuromuscular synapses.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 67, 250-259 (2008).</li><li>Wright, M. C., Cho, W. J., Son, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+patterns+of+motor+nerve+terminal+sprouting+induced+by+ciliary+neurotrophic+factor+vs.+botulinum+toxin.">Distinct patterns of motor nerve terminal sprouting induced by ciliary neurotrophic factor vs. botulinum toxin.</a> J Comp Neurol. 504, 1-16 (2007).</li><li>Wright, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+muscarinic+acetylcholine+receptor+subtypes+contribute+to+stability+and+growth,+but+not+compensatory+plasticity,+of+neuromuscular+synapses.">Distinct muscarinic acetylcholine receptor subtypes contribute to stability and growth, but not compensatory plasticity, of neuromuscular synapses.</a> J Neurosci. 29, 14942-14955 (2009).</li><li>Voss, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+ATP+inhibits+chloride+channels+in+mature+mammalian+skeletal+muscle+by+activating+P2Y1+receptors.">Extracellular ATP inhibits chloride channels in mature mammalian skeletal muscle by activating P2Y1 receptors.</a> J Physiol. 587, 5739-5752 (2009).</li><li>Murray, L. M., Gillingwater, T. H., Parson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+mouse+cranial+muscles+to+investigate+neuromuscular+pathology+in+vivo.">Using mouse cranial muscles to investigate neuromuscular pathology in vivo.</a> Neuromuscul Disord. 20, 740-743 (2009).</li><li>Dorje, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonist+binding+profiles+of+five+cloned+human+muscarinic+receptor+subtypes.">Antagonist binding profiles of five cloned human muscarinic receptor subtypes.</a> J Pharmacol Exp Ther. 256, 727-733 (1991).</li><li>Caulfield, M. P., Birdsall, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+Union+of+Pharmacology.+XVII.+Classification+of+muscarinic+acetylcholine+receptors.">International Union of Pharmacology. XVII. Classification of muscarinic acetylcholine receptors.</a> Pharmacol Rev. 50, 279-290 (1998).</li></ol>

Die hier vorgestellte Methode ermöglicht die Untersuchung von bisher nicht Rollen von Subtyp-spezifischen mAChR Signalisierung in die Stabilität und die Wartung von Säugetieren NMJs. Diese Methode wird auch nützlich sein, um die Auswirkungen von neurotrophen Faktoren und pharmakologische Wirkstoffe zu testen. Zum Beispiel fand unser Labor, dass Ciliary neurotrophen Faktor (CNTF) sprießen aus nahezu allen LAL Nervenendigungen in erwachsenen Mäusen hervorgerufen <a>1</a> . Dieses Ergebnis mit früheren Studien von C...

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare </th></tr><tr><td> Ketamin </td><td> Hospira </td><td> NDC0409-2051-05 </td><td> Dosis: 120mg/kg </td></tr><tr><td> Xylazin </td><td> Lloyd Laboratories </td><td> LA33806 </td><td> Dosis: 8mg/kg </td></tr><tr><td> Atropin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A0132 </td><td> (&gt; 98% Reinheit); Dosis: 0.2mg/kg - 20mg/kg </td></tr><tr><td> Atropin </td><td> Voigt Global Distribution </td><td> AT105 </td><td> Pharmazeutischer Qualität </td></tr><tr><td> Methoctramin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M105 </td><td> Dosis: 100 - 400M </td></tr><tr><td> 4-DAMP </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D142 </td><td> Dosis: 2.5mg/kg </td></tr><tr><td> AFDX-116 </td><td> Tocris Bioscience </td><td> 1105 </td><td> 250M </td></tr><tr><td> AFDX-384 </td><td> Tocris Bioscience </td><td> 1345 </td><td> 50M - 500M </td></tr><tr><td> MT 7 </td><td> Peptide Internationalen </td><td> PMT-4340-s </td><td> 0,1 - 1M </td></tr><tr><td> 1X Phosphate Buffered Saline, pH 7,4 </td><td> Invitrogen </td><td> 10010049 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehyd </td><td> Fischer </td><td> T353-500 </td><td> Machen Sie 10% Lösung zunächst durch Auflösen 10g/100mL entionisiertes destilliertes Wasser; machen 4% mit 1X PBS, pH-Wert einstellen auf 7,4 </td></tr><tr><td> Sodium pentobarbitol </td><td> Virbac Tiergesundheit </td><td> NDC-051311-050-01 </td><td> Dosis: 390mg/kg </td></tr><tr><td> Sylgard </td><td> Dow Corning </td><td> Part # 184 </td><td> Befolgen Sie die Anweisungen, die mit Kit kommen, können mehrere große Kulturschale verwenden (30mm, 60mm, 100mm) je nach Bedarf </td></tr><tr><td> 0,1 M Glycin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G-7126 </td><td> Add 0.185g bis 25 mL von 2% BSA / PBS </td></tr><tr><td> 2% Rinderserumalbumin (2% BSA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A3059-100g </td><td> Lösen 2g BSA in 100 ml 1X PBS </td></tr><tr><td> 0,2% Triton X100 in 2% BSA / PBS (Blocking Buffer) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T9284-100 mL </td><td> Lösen Sie 0.2ml/100mL 2% BSA / PBS </td></tr><tr><td> α-Bungarotoxin </td><td> Invitrogen </td><td> T1175 </td><td> Verwenden Sie bei einer Konzentration von 1:200 </td></tr><tr><td> SMI-312 </td><td> Sternberger Monoklonale Antikörper </td><td> SMI312 </td><td> Verwenden Sie bei einer Konzentration von 1:1000 </td></tr><tr><td> SV2 </td><td> Developmental Studies Hybridoma der Bank </td><td> SV2-Überstand </td><td> Verwenden Sie bei einer Konzentration von 1:10 </td></tr><tr><td> S100 </td><td> Dako </td><td> Z0311 </td><td> Verwenden Sie bei einer Konzentration von 1:400 </td></tr><tr><td> FITC-Ziege-anti-Maus-IgG1 </td><td> Roche </td><td> 03117731001 </td><td> Verwenden Sie bei einer Konzentration von 1:200, aber wenn Hintergrund ist hoch, versuchen 1:400 </td></tr><tr><td> Alexa-Fluor 647 konjugierten Ziege anti-Kaninchen </td><td> Invitrogen </td><td> A21244 </td><td> Verwenden Sie bei einer Konzentration von 1:200 </td></tr><tr><td> Vectashield fluoreszierenden Eindeckmittel </td><td> Vector Laboratories </td><td> H-1000 </td><td> Dies ist keine Hard-Set-Medium, müssen Sie das Deckglas mit klarem Nagellack zu sichern. </td></tr><tr><td> Kleine Frühling Schere </td><td> Feine Science Tools </td><td> 15002-08 </td><td></td></tr><tr><td> Dissektionszangen </td><td> Feine Science Tools </td><td> 11295-51 </td><td></td></tr></tbody></table>

subcutaneous administration of muscarinic antagonists and triple-immunostaining of the levator auris longus muscle in mice

Hinterbein Muskeln von Nagetieren, wie gastrocnemius und tibialis anterior, werden häufig für in vivo pharmakologische Studien der Signale für die Bildung und Pflege von Säugetieren NMJs verwendet. Allerdings ist eine medikamentöse Eindringen in diese Muskeln nach subkutaner oder intramuskulärer Verabreichung häufig unvollständig oder ungleichmäßig und viele NMJs können, bleiben unberührt. Obwohl die systemische Verabreichung von Geräten wie Mini-Pumpen der raum-zeitlichen Wirkungen verbessern kann, kann die invasive Natur dieses Ansatzes Ursache zu verwechseln entzündliche Reaktionen und / oder direkte Schädigung der Muskulatur. Darüber hinaus ist eine vollständige Analyse der NMJs in einem Hinterbein Muskeln schwierig, weil es zeitaufwendig serielle Schnitte und umfangreiche Immunfärbung erfordert. Die Maus LAL ist ein dünnes, flaches Blatt Muskel oberflächlich auf dem Rücken des Halses befindet. Es ist eine schnell zuckenden, dass die Funktionen auf der Ohrmuschel zu bewegen. Es enthält rostralen und kaudalen Abschnitte, die von der Mittellinie des Schädels stammen und erstrecken sich seitlich auf die knorpeligen Teil jeder Ohrmuschel. Der Muskel wird durch einen Zweig des Nervus facialis, die kaudal Projekte beim Verlassen des Foramen stylomastoideum geliefert. Wir und andere haben herausgefunden, LAL, um eine bequeme Zubereitung, die Vorteile für die Untersuchung von kurz-und langfristigen In-vivo-Wirkungen von Drogen auf NMJs und Muskeln bietet. Erstens erleichtert ihre oberflächliche Lage mehrere lokale Applikationen von Medikamenten unter leichter Betäubung. Zweitens ermöglicht seine Dünnheit (2-3 Schichten von Muskelfasern) Visualisierung und Analyse von fast allen NMJs innerhalb des Muskels. Drittens erlaubt die einfache seziert er mit seinen Nerven intakt zusammen mit dem Muster seiner Innervation ergänzende elektrophysiologische Untersuchungen in vitro 9,5. Last, und vielleicht am wichtigsten, eine kleine applizierte Volumen (~ 50 ul) leicht deckt den gesamten Muskel-Oberfläche sorgt für eine gleichmäßige und bei längerer Exposition aller NMJs auf das Medikament und eliminiert die Notwendigkeit für einen systemischen Ansatz 1,8.

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Subcutaneous Administration of Muscarinic Antagonists and Triple-Immunostaining of the Levator Auris Longus Muscle in Mice

Wir beschreiben Verfahren für die wiederholte Gabe von Inhibitoren der Muskarin-Signalisierung an die levator auris longus (LAL) Muskel junger erwachsener Mäuse und für die anschließende Immunfärbung der neuromuskulären Synapsen (NMJs) in wholemounts. Der LAL-Muskel hat einzigartige Vorteile für die Entdeckung<em&gt; In vivo</em&gt; Pharmakologische Wirkungen auf NMJs.

Subkutane Verabreichung von Muscarinic Antagonisten und Triple-Immunfärbung der Levator Auris longus in Mäuse

Hind limb muscles of rodents, such as gastrocnemius and tibialis anterior, are frequently used for in vivo  pharmacological studies of the signals ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Assessment of Ultrasonic Vocalizations During Drug Self-administration in Rats

Beurteilung der Ultraschall-Vocalizations Während Drug Selbstverwaltung in Ratten

Drug self-administration procedures are commonly used to study behavioral and neurochemical changes associated with human drug abuse, addiction and ...

Forschung

Neurowissenschaften

Oral Administration of Rotenone using a Gavage and Image Analysis of Alpha-synuclein Inclusions in the Enteric Nervous System

Die orale Verabreichung von Rotenon mit einem Gavage und Bildanalyse von Alpha-Synuclein Einschlüsse in den enterischen Nervensystem

In Parkinson's disease (PD) patients, the associated pathology follows a characteristic pattern involving inter alia the enteric nervous system (ENS) 1,2, ...

Spectral Confocal Imaging of Fluorescently tagged Nicotinic Receptors in Knock-in Mice with Chronic Nicotine Administration

Spectral konfokale Bildgebung von fluoreszenzmarkierten Nikotinrezeptoren in Knock-in Mäusen mit chronischer Gabe von Nikotin

Ligand-gated ion channels in the central nervous system (CNS) are implicated in numerous conditions with serious medical and social consequences.  For ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Visualisierung von Propriozeptoren in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven und Puppen

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Microdialysis of Ethanol During Operant Ethanol Self-administration and Ethanol Determination by Gas Chromatography

Microdialysis Ethanol während operante Ethanol Selbstverwaltung und Ethanol Bestimmung durch Gaschromatographie

Operant self-administration methods are commonly used to study the behavioral and pharmacological effects of many drugs of abuse, including ethanol.  ...

Proprioception and Tension Receptors in Crab Limbs: Student Laboratory Exercises

Propriozeption und Spannungsrezeptoren in Crab Gliedmassen: Schülerlabor Übungen

The primary purpose of these procedures is to demonstrate for teaching and research purposes how to record the activity of living primary sensory neurons ...

A Simple and Inexpensive Method for Determining Cold Sensitivity and Adaptation in Mice

Eine einfache und kostengünstige Methode zur Bestimmung der Überempfindlichkeit auf Kälte und Anpassung an der Maus

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life.  The cold ...

Video Imaging and Spatiotemporal Maps to Analyze Gastrointestinal Motility in Mice

Video Imaging und Raum-Zeit-Karten zur Analyse Gastrointestinale Motilität bei Mäusen

The enteric nervous system (ENS) plays an important role in regulating gastrointestinal (GI) motility and can function independently of the central ...

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Ein Protokoll für die Verwaltung von Real-Time-fMRT Neurofeedback Training

Neurologic disorders are characterized by abnormal cellular-, molecular-, and circuit-level functions in the brain. New methods to induce and control ...

Recording Brain Electromagnetic Activity During the Administration of the Gaseous Anesthetic Agents Xenon and Nitrous Oxide in Healthy Volunteers

Aufnahme elektromagnetische Aktivität des Gehirns während der Verabreichung von Lachgas bei gesunden Probanden und gasförmiger Anästhetika Xenon

Anesthesia arguably provides one of the only systematic ways to study the neural correlates of global consciousness/unconsciousness. However to date most ...