Name: subcutaneous administration of muscarinic antagonists and triple-immunostaining of the levator auris longus muscle in mice
Uploaded: 2011-09-08T13:00:00
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Questo lavoro è stato sostenuto da Distrofia Muscolare Association, NIH (NS062320).

1. Somministrazione sottocutanea di recettori muscarinici dell&#39;acetilcolina (mAChR) antagonisti <ol><li> Preparare in condizioni asettiche la dose appropriata di antagonista mAChR, (cfr. Tabella) dissolvendo il farmaco in soluzione fisiologica sterile in tubo di reazione 1,5 ml. Gli antagonisti sono stati utilizzati: atropina, Methoctramine, 4-UMIDO, AFDX-116, AFDX-384, MT 7. </li><li> Disegna 50μl di soluzione in siringa da insulina a1cc e utilizzare una siringa separato per ogni mouse. Anche preparare siringhe ...

<ol>
	<li>Wright, M. C., Son, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliary+neurotrophic+factor+is+not+required+for+terminal+sprouting+and+compensatory+reinnervation+of+neuromuscular+synapses:+re-evaluation+of+CNTF+null+mice.">Ciliary neurotrophic factor is not required for terminal sprouting and compensatory reinnervation of neuromuscular synapses: re-evaluation of CNTF null mice.</a> Exp Neurol. 205, 437-448 (2007).</li><li>Gurney, M. E., Yamamoto, H., Kwon, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+motor+neuron+sprouting+in+vivo+by+ciliary+neurotrophic+factor+and+basic+fibroblast+growth+factor.">Induction of motor neuron sprouting in vivo by ciliary neurotrophic factor and basic fibroblast growth factor.</a> J Neurosci. 12, 3241-3247 (1992).</li><li>Caroni, P., Aigner, L., Schneider, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+neuronal+determinants+locally+regulate+extrasynaptic+and+synaptic+growth+at+the+adult+neuromuscular+junction.">Intrinsic neuronal determinants locally regulate extrasynaptic and synaptic growth at the adult neuromuscular junction.</a> J Cell Biol. 136, 679-692 (1997).</li><li>Witzemann, V., Brenner, H. R., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+factors+regulate+AChR+subunit+mRNAs+at+rat+neuromuscular+synapses.">Neural factors regulate AChR subunit mRNAs at rat neuromuscular synapses.</a> J Cell Biol. 114, 125-141 (1991).</li><li>Angaut-Petit, D., Molgo, J., Connold, A. L., Faille, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+levator+auris+longus+muscle+of+the+mouse:+a+convenient+preparation+for+studies+of+short-+and+long-term+presynaptic+effects+of+drugs+or+toxins.">The levator auris longus muscle of the mouse: a convenient preparation for studies of short- and long-term presynaptic effects of drugs or toxins.</a> Neurosci Lett. 82, 83-88 (1987).</li><li>Lanuza, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-+and+postsynaptic+maturation+of+the+neuromuscular+junction+during+neonatal+synapse+elimination+depends+on+protein+kinase.">Pre- and postsynaptic maturation of the neuromuscular junction during neonatal synapse elimination depends on protein kinase.</a> C. J Neurosci Res. 67, 607-617 (2002).</li><li>Garcia, N., Santafe, M. M., Tomas, M., Lanuza, M. A., Tomas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+effects+of+beta-amyloid25-35+peptide+aggregates+on+transmitter+release+in+neuromuscular+synapses.">Short-term effects of beta-amyloid25-35 peptide aggregates on transmitter release in neuromuscular synapses.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 67, 250-259 (2008).</li><li>Wright, M. C., Cho, W. J., Son, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+patterns+of+motor+nerve+terminal+sprouting+induced+by+ciliary+neurotrophic+factor+vs.+botulinum+toxin.">Distinct patterns of motor nerve terminal sprouting induced by ciliary neurotrophic factor vs. botulinum toxin.</a> J Comp Neurol. 504, 1-16 (2007).</li><li>Wright, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+muscarinic+acetylcholine+receptor+subtypes+contribute+to+stability+and+growth,+but+not+compensatory+plasticity,+of+neuromuscular+synapses.">Distinct muscarinic acetylcholine receptor subtypes contribute to stability and growth, but not compensatory plasticity, of neuromuscular synapses.</a> J Neurosci. 29, 14942-14955 (2009).</li><li>Voss, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+ATP+inhibits+chloride+channels+in+mature+mammalian+skeletal+muscle+by+activating+P2Y1+receptors.">Extracellular ATP inhibits chloride channels in mature mammalian skeletal muscle by activating P2Y1 receptors.</a> J Physiol. 587, 5739-5752 (2009).</li><li>Murray, L. M., Gillingwater, T. H., Parson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+mouse+cranial+muscles+to+investigate+neuromuscular+pathology+in+vivo.">Using mouse cranial muscles to investigate neuromuscular pathology in vivo.</a> Neuromuscul Disord. 20, 740-743 (2009).</li><li>Dorje, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonist+binding+profiles+of+five+cloned+human+muscarinic+receptor+subtypes.">Antagonist binding profiles of five cloned human muscarinic receptor subtypes.</a> J Pharmacol Exp Ther. 256, 727-733 (1991).</li><li>Caulfield, M. P., Birdsall, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+Union+of+Pharmacology.+XVII.+Classification+of+muscarinic+acetylcholine+receptors.">International Union of Pharmacology. XVII. Classification of muscarinic acetylcholine receptors.</a> Pharmacol Rev. 50, 279-290 (1998).</li></ol>

The method presented here permits investigation of previously unrecognized roles of subtype-specific mAChR signaling in the stability and maintenance of mammalian NMJs. This method will also be useful to test the effects of neurotrophic factors and pharmacological agents. For example, our laboratory found that Ciliary Neurotrophic Factor (CNTF) elicited sprouting from nearly all LAL nerve terminals in adult mice1. This result contrasted with prior studies of CNTF-treated hind limb muscles, which reported moder...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti </th></tr><tr><td> ketamina </td><td> Hospira </td><td> NDC0409-2051-05 </td><td> Dose: 120mg/kg </td></tr><tr><td> xylazina </td><td> Lloyd Laboratori </td><td> LA33806 </td><td> Dose: 8mg/kg </td></tr><tr><td> atropina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A0132 </td><td> (Purezza&gt; 98%); Dose: 0.2mg/kg - 20mg/kg </td></tr><tr><td> atropina </td><td> Voigt Global Distribution </td><td> AT105 </td><td> Di grado farmaceutico </td></tr><tr><td> Methoctramine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M105 </td><td> Dosi: 100 - 400M </td></tr><tr><td> 4-UMIDO </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D142 </td><td> Dose: 2,5 mg </td></tr><tr><td> AFDX-116 </td><td> Bioscience Tocris </td><td> 1105 </td><td> 250M </td></tr><tr><td> AFDX-384 </td><td> Bioscience Tocris </td><td> 1345 </td><td> 50M - 500M </td></tr><tr><td> MT 7 </td><td> Peptidi internazionale </td><td> PMT-4340-s </td><td> 0,1 M - 1M </td></tr><tr><td> Soluzione salina tamponata con fosfato 1X, pH 7,4 </td><td> Invitrogen </td><td> 10010049 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldeide </td><td> Pescatore </td><td> T353-500 </td><td> Prova del 10% prima soluzione sciogliendo 10g/100mL deionizzata acqua distillata; fare 4% con PBS 1X, regolare il pH a 7,4 </td></tr><tr><td> Sodio pentobarbitol </td><td> Virbac Animal Health </td><td> NDC-051311-050-01 </td><td> Dose: 390mg/kg </td></tr><tr><td> Sylgard </td><td> Dow Corning </td><td> Part # 184 </td><td> Seguire le istruzioni fornite con il kit, è possibile utilizzare più piatto cultura dimensioni (30mm, 60mm, 100 mm) a seconda delle esigenze </td></tr><tr><td> 0,1 M glicina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G-7126 </td><td> Aggiungi 0.185g a 25mL del 2% BSA / PBS </td></tr><tr><td> 2% di albumina sierica bovina (2% BSA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A3059-100g </td><td> Sciogliere 2 g in 100 ml di BSA PBS 1X </td></tr><tr><td> X100 Triton 0,2% nel 2% BSA / PBS (tampone di bloccaggio) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T9284-100 ml </td><td> Sciogliere 0.2ml/100mL 2% BSA / PBS </td></tr><tr><td> α-bungarotossina </td><td> Invitrogen </td><td> T1175 </td><td> L&#39;uso a una concentrazione di 1:200 </td></tr><tr><td> SMI-312 </td><td> Sternberger monoclonali </td><td> SMI312 </td><td> L&#39;uso a una concentrazione di 1:1000 </td></tr><tr><td> SV2 </td><td> Developmental Studies Ibridoma Banca </td><td> SV2-supernatante </td><td> L&#39;uso alla concentrazione di 1:10 </td></tr><tr><td> S100 </td><td> Dako </td><td> Z0311 </td><td> L&#39;uso a una concentrazione di 1:400 </td></tr><tr><td> FITC-capra anti-topo IgG1 </td><td> Roche </td><td> 03117731001 </td><td> L&#39;uso a una concentrazione di 1:200, ma se lo sfondo è elevata, provare 1:400 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 647-capra coniugato anti-coniglio </td><td> Invitrogen </td><td> A21244 </td><td> L&#39;uso a una concentrazione di 1:200 </td></tr><tr><td> Vectashield fluorescenti montaggio di mezzi </td><td> Vector laboratori </td><td> H-1000 </td><td> Questo non è un hard-set di supporti, è necessario assicurare la polizza di copertura con smalto trasparente. </td></tr><tr><td> Forbici Primavera piccoli </td><td> Strumenti Scienza multa </td><td> 15002-08 </td><td></td></tr><tr><td> Dissezione forcipe </td><td> Strumenti Scienza multa </td><td> 11295-51 </td><td></td></tr></tbody></table>

subcutaneous administration of muscarinic antagonists and triple-immunostaining of the levator auris longus muscle in mice

Muscoli dell&#39;arto posteriore di roditori, come il gastrocnemio e tibiale anteriore, sono frequentemente utilizzati in vivo per studi farmacologici dei segnali indispensabili per la formazione e la manutenzione di NMJs mammiferi. Tuttavia, la penetrazione della droga in questi muscoli dopo somministrazione sottocutanea o intramuscolare è spesso incompleta o irregolare e NMJs molti possono rimanere inalterati. Sebbene la somministrazione sistemica con dispositivi come i mini-pompe in grado di migliorare gli effetti spazio-temporali, la natura invasiva di questo approccio può causare confusione risposte infiammatorie e / o danno muscolare diretto. Inoltre, l&#39;analisi completa del NMJs in un muscolo dell&#39;arto posteriore è impegnativo, perché richiede tempi lunghi sezionamento seriale e immunocolorazione estesa. Il LAL mouse è un sottile foglio piatto di muscoli situati superficialmente sul dorso del collo. Si tratta di uno dei muscoli a contrazione rapida che funzioni per spostare il padiglione auricolare. Esso contiene porzioni rostrali e caudali che provengono dalla linea mediana del cranio e si estendono lateralmente alla porzione cartilaginea di ogni padiglione auricolare. Il muscolo è alimentato da un ramo del nervo facciale che i progetti caudalmente non appena esce dal forame stilo-mastoideo. Noi e altri hanno trovato LAL essere una preparazione conveniente che offre vantaggi per l&#39;indagine sia a breve che a lungo termine in vivo gli effetti delle droghe sul NMJs e muscoli. In primo luogo, la sua posizione superficiale facilita molteplici applicazioni locali di farmaci in anestesia luce. In secondo luogo, la sua magrezza (2-3 strati di fibre muscolari) permette la visualizzazione e l&#39;analisi di quasi tutti i NMJs all&#39;interno del muscolo. In terzo luogo, la facilità di analizzarlo con la sua intatta nervo insieme con il modello della sua innervazione permette analisi elettrofisiologiche supplementari in vitro 9,5. Ultimo, e forse più importante, un piccolo volume applicato (~ 50μl) copre facilmente l&#39;intera superficie muscolare, fornisce una esposizione uniforme e prolungato di tutti i suoi NMJs al farmaco ed elimina la necessità di un approccio sistemico 1,8.

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Subcutaneous Administration of Muscarinic Antagonists and Triple-Immunostaining of the Levator Auris Longus Muscle in Mice

Si descrivono le modalità di somministrazione ripetuta di inibitori di segnalazione muscarinici a lungo del muscolo elevatore dell&#39;ano Auris (LAL), muscolo di topi adulti giovani e per immunocolorazione successive delle sue giunzioni neuromuscolari (NMJs) in wholemounts. Il muscolo LAL ha vantaggi unici per rivelare<em&gt; In vivo</em&gt; Effetti farmacologici su NMJs.

Somministrazione sottocutanea di antagonisti muscarinici e Triple-immunocolorazione del lungo muscolo elevatore Auris in topi

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