Name: subcutaneous administration of muscarinic antagonists and triple-immunostaining of the levator auris longus muscle in mice
Uploaded: 2011-09-08T13:00:00
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この作品は、筋ジストロフィー協会、NIH（NS062320）によってサポートされていました。

1。ムスカリン性アセチルコリン受容体（mAChR）拮抗薬の皮下投与<ol><li> 1.5mlの反応チューブに滅菌生理食塩水で薬物を溶解することにより無菌条件下でmAChR拮抗薬、（参照、表）の適切な投与量を準備します。以下の拮抗薬を使用した：アトロピン、Methoctramine、4 - DAMP、AFDX - 116、AFDX - 384、MT 7。 </li><li> a1ccインスリン注射器に溶液の50μlのを描き、それぞれのマウスに別々のシリンジを使用?...

<ol>
	<li>Wright, M. C., Son, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliary+neurotrophic+factor+is+not+required+for+terminal+sprouting+and+compensatory+reinnervation+of+neuromuscular+synapses:+re-evaluation+of+CNTF+null+mice.">Ciliary neurotrophic factor is not required for terminal sprouting and compensatory reinnervation of neuromuscular synapses: re-evaluation of CNTF null mice.</a> Exp Neurol. 205, 437-448 (2007).</li><li>Gurney, M. E., Yamamoto, H., Kwon, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+motor+neuron+sprouting+in+vivo+by+ciliary+neurotrophic+factor+and+basic+fibroblast+growth+factor.">Induction of motor neuron sprouting in vivo by ciliary neurotrophic factor and basic fibroblast growth factor.</a> J Neurosci. 12, 3241-3247 (1992).</li><li>Caroni, P., Aigner, L., Schneider, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+neuronal+determinants+locally+regulate+extrasynaptic+and+synaptic+growth+at+the+adult+neuromuscular+junction.">Intrinsic neuronal determinants locally regulate extrasynaptic and synaptic growth at the adult neuromuscular junction.</a> J Cell Biol. 136, 679-692 (1997).</li><li>Witzemann, V., Brenner, H. R., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+factors+regulate+AChR+subunit+mRNAs+at+rat+neuromuscular+synapses.">Neural factors regulate AChR subunit mRNAs at rat neuromuscular synapses.</a> J Cell Biol. 114, 125-141 (1991).</li><li>Angaut-Petit, D., Molgo, J., Connold, A. L., Faille, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+levator+auris+longus+muscle+of+the+mouse:+a+convenient+preparation+for+studies+of+short-+and+long-term+presynaptic+effects+of+drugs+or+toxins.">The levator auris longus muscle of the mouse: a convenient preparation for studies of short- and long-term presynaptic effects of drugs or toxins.</a> Neurosci Lett. 82, 83-88 (1987).</li><li>Lanuza, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-+and+postsynaptic+maturation+of+the+neuromuscular+junction+during+neonatal+synapse+elimination+depends+on+protein+kinase.">Pre- and postsynaptic maturation of the neuromuscular junction during neonatal synapse elimination depends on protein kinase.</a> C. J Neurosci Res. 67, 607-617 (2002).</li><li>Garcia, N., Santafe, M. M., Tomas, M., Lanuza, M. A., Tomas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+effects+of+beta-amyloid25-35+peptide+aggregates+on+transmitter+release+in+neuromuscular+synapses.">Short-term effects of beta-amyloid25-35 peptide aggregates on transmitter release in neuromuscular synapses.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 67, 250-259 (2008).</li><li>Wright, M. C., Cho, W. J., Son, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+patterns+of+motor+nerve+terminal+sprouting+induced+by+ciliary+neurotrophic+factor+vs.+botulinum+toxin.">Distinct patterns of motor nerve terminal sprouting induced by ciliary neurotrophic factor vs. botulinum toxin.</a> J Comp Neurol. 504, 1-16 (2007).</li><li>Wright, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+muscarinic+acetylcholine+receptor+subtypes+contribute+to+stability+and+growth,+but+not+compensatory+plasticity,+of+neuromuscular+synapses.">Distinct muscarinic acetylcholine receptor subtypes contribute to stability and growth, but not compensatory plasticity, of neuromuscular synapses.</a> J Neurosci. 29, 14942-14955 (2009).</li><li>Voss, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+ATP+inhibits+chloride+channels+in+mature+mammalian+skeletal+muscle+by+activating+P2Y1+receptors.">Extracellular ATP inhibits chloride channels in mature mammalian skeletal muscle by activating P2Y1 receptors.</a> J Physiol. 587, 5739-5752 (2009).</li><li>Murray, L. M., Gillingwater, T. H., Parson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+mouse+cranial+muscles+to+investigate+neuromuscular+pathology+in+vivo.">Using mouse cranial muscles to investigate neuromuscular pathology in vivo.</a> Neuromuscul Disord. 20, 740-743 (2009).</li><li>Dorje, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonist+binding+profiles+of+five+cloned+human+muscarinic+receptor+subtypes.">Antagonist binding profiles of five cloned human muscarinic receptor subtypes.</a> J Pharmacol Exp Ther. 256, 727-733 (1991).</li><li>Caulfield, M. P., Birdsall, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+Union+of+Pharmacology.+XVII.+Classification+of+muscarinic+acetylcholine+receptors.">International Union of Pharmacology. XVII. Classification of muscarinic acetylcholine receptors.</a> Pharmacol Rev. 50, 279-290 (1998).</li></ol>

ここで紹介する方法は、哺乳類NMJsの安定と維持におけるシグナル伝達サブタイプ固有のmAChRの以前に認識されていない役割の調査を可能にします。また、このメソッドは、神経栄養因子および薬理学的作用物質の効果をテストするために有用であろう。例えば、私たちの研究室では、毛様体神経栄養因子（CNTF）は、成体マウスのほぼすべてのLAL神経末端から発芽誘発されることがわかった<a>...

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント</th></tr><tr><td>ケタミン</td><td>ホスピーラ</td><td> NDC0409 - 2051〜05 </td><td>用量：120mg/kg </td></tr><tr><td>キシラジン</td><td>ロイド研究所</td><td> LA33806 </td><td>用量：8mg/kg </td></tr><tr><td>アトロピン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> A0132 </td><td> （&gt; 98％純度）、投与量：0.2mg/kg - 20mg/kg </td></tr><tr><td>アトロピン</td><td>フォイクトグローバルディストリビューション</td><td> AT105 </td><td>医薬品グレード</td></tr><tr><td> Methoctramine </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> M105 </td><td>用量：100 - 400M </td></tr><tr><td> 4 - DAMP </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> D142 </td><td>投与量：2.5mg/kg </td></tr><tr><td> AFDX - 116 </td><td>バイオサイエンスTocris </td><td> 1105 </td><td> 250M </td></tr><tr><td> AFDX - 384 </td><td>バイオサイエンスTocris </td><td> 1345 </td><td> 50M - 500M </td></tr><tr><td> MT 7 </td><td>国際ペプチド</td><td> PMT - 4340 - S </td><td> 0.1M - 1M </td></tr><tr><td> 1Xリン酸緩衝生理食塩水、pH7.4のバッファ付き</td><td>インビトロジェン</td><td> 10010049 </td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>フィッシャー</td><td> T353 - 500 </td><td> 10g/100mL脱イオン蒸留水に溶解することによって最初の10％溶液を作る; 7.4にpHを調整し、1X PBSで4％を作る</td></tr><tr><td> pentobarbitolナトリウム</td><td> Virbacアニマルヘルス</td><td> NDC - 051311 - 050 - 01 </td><td>用量：390mg/kg </td></tr><tr><td> Sylgard </td><td>ダウコーニング</td><td>パート＃184 </td><td>キットに付属の指示に​​従って、ニーズに応じて複数のサイズの培養皿を（30ミリメートル、60ミリメートル、100ミリメートル）を使用することができます</td></tr><tr><td> 0.1Mグリシン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> G - 7126 </td><td> 2％BSA / PBSの0.185グラムに25mLを追加します。 </td></tr><tr><td> 2％ウシ血清アルブミン（2％BSA） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> A3059 - 100G </td><td> 1X PBS 100mLの中に2グラムBSAを溶解する</td></tr><tr><td> 2％0.2％トリトンX100 BSA / PBS（ブロッキングバッファー） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> T9284 - 100mLの</td><td> 0.2ml/100mL 2％BSA / PBSを溶かす</td></tr><tr><td> α-ブンガロトキシン</td><td>インビトロジェン</td><td> T1175 </td><td> 1:200の濃度で使用</td></tr><tr><td> SMI - 312 </td><td>シュテルンベルガーのモノクローナル抗体</td><td> SMI312 </td><td> 1:1000の濃度で使用</td></tr><tr><td> SV2 </td><td>発達研究ハイブリドーマバンク</td><td> SV2 -上清</td><td> 1:10の濃度で使用</td></tr><tr><td> S100 </td><td>ダコ</td><td> Z0311 </td><td> 1:400の濃度で使用</td></tr><tr><td> FITC -ヤギ抗マウスIgG1 </td><td>ロッシュ</td><td> 03117731001 </td><td> 1:200の濃度で使用しますが、バックグラウンドが高い場合には、1:400を試してみてください</td></tr><tr><td>アレクサ - フルーア647結合ヤギ抗ウサギ</td><td>インビトロジェン</td><td> A21244 </td><td> 1:200の濃度で使用</td></tr><tr><td> Vectashield蛍光マウンティングメディア</td><td>ベクターラボラトリーズ</td><td> H - 1000 </td><td>これはハードセットのメディアではない、あなたは明確なマニキュアでカバーガラスを固定する必要があります。 </td></tr><tr><td>小さな春のはさみ</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 15002〜08 </td><td></td></tr><tr><td>解剖の鉗子</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 11295〜51 </td><td></td></tr></tbody></table>

subcutaneous administration of muscarinic antagonists and triple-immunostaining of the levator auris longus muscle in mice

このような腓腹筋と前脛骨筋などのげっ歯類の後肢の筋肉が、、頻繁に哺乳類NMJsの形成と維持に不可欠なシグナルの in vivo薬理試験で使用されます。しかし、皮下または筋肉内投与後にこれらの筋肉への薬物の浸透は、しばしば不完全または不均一であり、多くのNMJsは影響を受けませんができます。このようなミニポンプなどの機器との全身投与は、時空間の効果を向上させることができるが、このアプローチの侵襲的な性質は、交絡炎症応答および/または直接筋肉の損傷を引き起こす可能性があります。それは時間のかかるシリアルセクショニングと豊富な免疫染色​​を必要とするためまた、後肢の筋肉におけるNMJsの完全な分析は困難です。 マウスLALは首の背部に表面的にある筋肉の薄い、平らなシートです。それは、関数が耳介を移動することが速筋筋肉です。それは頭蓋骨の正中線に由来し、それぞれの耳介の軟骨部に横方向に拡張する吻側および尾側部分が含まれています。筋肉は、それが終了する茎乳突孔を次のように尾側に投影する顔面神経の枝によって供給される。我々と他の人がNMJsと筋肉での薬物の in vivo効果で短期と長期の両方の調査のための利点を提供する便利な準備であることがLAL発見した。最初に、その表面的な場所は軽い麻酔下での薬剤の複数のローカルアプリケーションを容易にします。第二に、その薄さ（筋線維の2-3層）は、筋肉内のほぼすべてのNMJsの可視化と分析を可能にします。第三に、その神経支配のパターンと一緒に無傷の神経でそれを解剖しやすさは、 試験管 9,5 の補足的な電気生理学的解析を可能にします。おそらく最後の、そして最も重要な、小さなappliedボリューム（〜50μlのは）簡単に、全体の筋肉の表面を覆って薬剤へのすべてのNMJsの制服と長期の暴露を提供し、体系的なアプローチ1,8が不要になります。

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Subcutaneous Administration of Muscarinic Antagonists and Triple-Immunostaining of the Levator Auris Longus Muscle in Mice

我々は、挙筋オーリス筋（LAL）若い成体マウスの筋肉にムスカリン性シグナル伝達の阻害剤の反復投与のためとwholemountsにおける神経筋接合部のその後の免疫染色（NMJs）するための手順を説明します。 LAL筋肉は明らかにするためのユニークな利点があります<em&gt; in vivoで</emNMJs上&gt;薬理作用。

皮下ムスカリン拮抗薬の管理およびマウスにおける挙筋オーリスの筋筋のトリプル免疫染色

Hind limb muscles of rodents, such as gastrocnemius and tibialis anterior, are frequently used for in vivo  pharmacological studies of the signals ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Assessment of Ultrasonic Vocalizations During Drug Self-administration in Rats

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神経科学

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腸神経系ではα-シヌクレインの介在物の強制経口および画像解析を用いたロテノンの経口投与

In Parkinson's disease (PD) patients, the associated pathology follows a characteristic pattern involving inter alia the enteric nervous system (ENS) 1,2, ...

Spectral Confocal Imaging of Fluorescently tagged Nicotinic Receptors in Knock-in Mice with Chronic Nicotine Administration

慢性ニコチン投与によるマウスノックインで蛍光標識ニコチン性受容体のスペクトル共焦点イメージング

Ligand-gated ion channels in the central nervous system (CNS) are implicated in numerous conditions with serious medical and social consequences.  For ...

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でProprioceptorsの可視化<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫および蛹

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