Name: subcutaneous administration of muscarinic antagonists and triple-immunostaining of the levator auris longus muscle in mice
Uploaded: 2011-09-08T13:00:00
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Este trabalho foi financiado pela Muscular Dystrophy Association, NIH (NS062320).

1. Administração subcutânea de acetilcolina muscarínicos receptor (mAChR) antagonistas <ol><li> Prepare sob condições assépticas, a dose apropriada de antagonista mAChR, (cf., Tabela) pela dissolução da droga no soro fisiológico estéril, em tubo de reação 1,5 ml. Os antagonistas foram utilizados os seguintes: atropina, Methoctramine, 4-DAMP, AFDX-116, AFDX-384, MT 7. </li><li> Desenhe 50μl de solução em seringa de insulina a1cc e usar uma seringa separada para cada rato. Também preparar seringas conte...

<ol>
	<li>Wright, M. C., Son, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliary+neurotrophic+factor+is+not+required+for+terminal+sprouting+and+compensatory+reinnervation+of+neuromuscular+synapses:+re-evaluation+of+CNTF+null+mice.">Ciliary neurotrophic factor is not required for terminal sprouting and compensatory reinnervation of neuromuscular synapses: re-evaluation of CNTF null mice.</a> Exp Neurol. 205, 437-448 (2007).</li><li>Gurney, M. E., Yamamoto, H., Kwon, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+motor+neuron+sprouting+in+vivo+by+ciliary+neurotrophic+factor+and+basic+fibroblast+growth+factor.">Induction of motor neuron sprouting in vivo by ciliary neurotrophic factor and basic fibroblast growth factor.</a> J Neurosci. 12, 3241-3247 (1992).</li><li>Caroni, P., Aigner, L., Schneider, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+neuronal+determinants+locally+regulate+extrasynaptic+and+synaptic+growth+at+the+adult+neuromuscular+junction.">Intrinsic neuronal determinants locally regulate extrasynaptic and synaptic growth at the adult neuromuscular junction.</a> J Cell Biol. 136, 679-692 (1997).</li><li>Witzemann, V., Brenner, H. R., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+factors+regulate+AChR+subunit+mRNAs+at+rat+neuromuscular+synapses.">Neural factors regulate AChR subunit mRNAs at rat neuromuscular synapses.</a> J Cell Biol. 114, 125-141 (1991).</li><li>Angaut-Petit, D., Molgo, J., Connold, A. L., Faille, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+levator+auris+longus+muscle+of+the+mouse:+a+convenient+preparation+for+studies+of+short-+and+long-term+presynaptic+effects+of+drugs+or+toxins.">The levator auris longus muscle of the mouse: a convenient preparation for studies of short- and long-term presynaptic effects of drugs or toxins.</a> Neurosci Lett. 82, 83-88 (1987).</li><li>Lanuza, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-+and+postsynaptic+maturation+of+the+neuromuscular+junction+during+neonatal+synapse+elimination+depends+on+protein+kinase.">Pre- and postsynaptic maturation of the neuromuscular junction during neonatal synapse elimination depends on protein kinase.</a> C. J Neurosci Res. 67, 607-617 (2002).</li><li>Garcia, N., Santafe, M. M., Tomas, M., Lanuza, M. A., Tomas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+effects+of+beta-amyloid25-35+peptide+aggregates+on+transmitter+release+in+neuromuscular+synapses.">Short-term effects of beta-amyloid25-35 peptide aggregates on transmitter release in neuromuscular synapses.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 67, 250-259 (2008).</li><li>Wright, M. C., Cho, W. J., Son, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+patterns+of+motor+nerve+terminal+sprouting+induced+by+ciliary+neurotrophic+factor+vs.+botulinum+toxin.">Distinct patterns of motor nerve terminal sprouting induced by ciliary neurotrophic factor vs. botulinum toxin.</a> J Comp Neurol. 504, 1-16 (2007).</li><li>Wright, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+muscarinic+acetylcholine+receptor+subtypes+contribute+to+stability+and+growth,+but+not+compensatory+plasticity,+of+neuromuscular+synapses.">Distinct muscarinic acetylcholine receptor subtypes contribute to stability and growth, but not compensatory plasticity, of neuromuscular synapses.</a> J Neurosci. 29, 14942-14955 (2009).</li><li>Voss, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+ATP+inhibits+chloride+channels+in+mature+mammalian+skeletal+muscle+by+activating+P2Y1+receptors.">Extracellular ATP inhibits chloride channels in mature mammalian skeletal muscle by activating P2Y1 receptors.</a> J Physiol. 587, 5739-5752 (2009).</li><li>Murray, L. M., Gillingwater, T. H., Parson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+mouse+cranial+muscles+to+investigate+neuromuscular+pathology+in+vivo.">Using mouse cranial muscles to investigate neuromuscular pathology in vivo.</a> Neuromuscul Disord. 20, 740-743 (2009).</li><li>Dorje, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonist+binding+profiles+of+five+cloned+human+muscarinic+receptor+subtypes.">Antagonist binding profiles of five cloned human muscarinic receptor subtypes.</a> J Pharmacol Exp Ther. 256, 727-733 (1991).</li><li>Caulfield, M. P., Birdsall, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+Union+of+Pharmacology.+XVII.+Classification+of+muscarinic+acetylcholine+receptors.">International Union of Pharmacology. XVII. Classification of muscarinic acetylcholine receptors.</a> Pharmacol Rev. 50, 279-290 (1998).</li></ol>

O método aqui apresentado permite a investigação de papéis previamente não reconhecido do subtipo específico mAChR sinalização na estabilidade e manutenção de NMJs mamíferos. Este método será útil também para testar os efeitos de fatores neurotróficos e agentes farmacológicos. Por exemplo, nosso laboratório constatou que fator neurotrófico ciliar (CNTF) provocou surgimento de quase todos os terminais nervosos LAL em ratos adultos <a>1</a> . Este resultado contrasta com estudos anteriores de CNTF trata...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários </th></tr><tr><td> ketamina </td><td> Hospira </td><td> NDC0409-2051-05 </td><td> Dose: 120mg/kg </td></tr><tr><td> xilazina </td><td> Lloyd Laboratories </td><td> LA33806 </td><td> Dose: 8mg/kg </td></tr><tr><td> atropina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A0132 </td><td> (&gt; 98% de pureza); Dose: 0.2mg/kg - 20mg/kg </td></tr><tr><td> atropina </td><td> Voigt Global Distribution </td><td> AT105 </td><td> Grau farmacêutico </td></tr><tr><td> Methoctramine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M105 </td><td> Dose: 100 - 400M </td></tr><tr><td> 4-DAMP </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D142 </td><td> Dose: 2.5mg/kg </td></tr><tr><td> AFDX-116 </td><td> Tocris Bioscience </td><td> 1105 </td><td> 250M </td></tr><tr><td> AFDX-384 </td><td> Tocris Bioscience </td><td> 1345 </td><td> 50M - 500M </td></tr><tr><td> MT 7 </td><td> Peptídeos Internacional </td><td> PMT-4340-s </td><td> 0,1 M - 1M </td></tr><tr><td> Phosphate Buffered 1X pH, solução salina 7,4 </td><td> Invitrogen </td><td> 10010049 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldeído </td><td> Pescador </td><td> T353-500 </td><td> Faça solução a 10% no primeiro dissolvendo água deionizada 10g/100mL destilada; fazer 4% com 1X PBS, ajustar o pH para 7,4 </td></tr><tr><td> Sódio pentobarbitol </td><td> Virbac Saúde Animal </td><td> NDC-051311-050-01 </td><td> Dose: 390mg/kg </td></tr><tr><td> Sylgard </td><td> Dow Corning </td><td> Parte # 184 </td><td> Siga as instruções que vêm com o kit, pode usar placa de cultura múltiplas empresas (30mm, 60mm, 100mm), dependendo das necessidades </td></tr><tr><td> 0,1 M Glycine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G-7126 </td><td> Adicionar 0.185g de 25 ml de 2% BSA / PBS </td></tr><tr><td> 2% albumina sérica bovina (BSA 2%) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A3059-100g </td><td> Dissolver 2g BSA em 100mL de PBS 1X </td></tr><tr><td> X100 Triton 0,2% em 2% BSA / PBS (tampão de bloqueio) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T9284-100mL </td><td> Dissolver 0.2ml/100mL 2% BSA / PBS </td></tr><tr><td> α-bungarotoxin </td><td> Invitrogen </td><td> T1175 </td><td> Use na concentração de 1:200 </td></tr><tr><td> SMI-312 </td><td> Monoclonais Sternberger </td><td> SMI312 </td><td> Use na concentração de 1:1000 </td></tr><tr><td> SV2 </td><td> Estudos do Banco de desenvolvimento Hibridoma </td><td> SV2-sobrenadante </td><td> Use a concentração de 1:10 </td></tr><tr><td> S100 </td><td> Dako </td><td> Z0311 </td><td> Use na concentração de 1:400 </td></tr><tr><td> FITC-cabra anti-rato IgG1 </td><td> Roche </td><td> 03117731001 </td><td> Use na concentração de 1:200, mas se o fundo é alto, tente 1:400 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor-cabra 647 conjugado anti-coelho </td><td> Invitrogen </td><td> A21244 </td><td> Use na concentração de 1:200 </td></tr><tr><td> Vectashield fluorescentes montar mídia </td><td> Vector laboratórios </td><td> H-1000 </td><td> Esta não é uma mídia de hard-set, você vai precisar para assegurar a lamínula com unhas polonês claro. </td></tr><tr><td> Tesoura pequena Primavera </td><td> Multa Ferramentas Ciência </td><td> 15002-08 </td><td></td></tr><tr><td> Pinça de dissecção </td><td> Multa Ferramentas Ciência </td><td> 11295-51 </td><td></td></tr></tbody></table>

subcutaneous administration of muscarinic antagonists and triple-immunostaining of the levator auris longus muscle in mice

Músculos dos membros posteriores de roedores, como o gastrocnêmio e tibial anterior, são freqüentemente usados ​​para estudos farmacológicos in vivo dos sinais essenciais para a formação e manutenção de NMJs mamíferos. No entanto, a penetração de drogas para esses músculos após subcutânea ou intramuscular é muitas vezes incompleta ou irregular e NMJs muitos podem permanecer inalteradas. Embora a administração sistêmica com dispositivos como mini-bombas podem melhorar os efeitos espaço-temporais, a natureza invasiva deste método pode causar confusão respostas inflamatórias e / ou lesão muscular direta. Além disso, a análise completa do NMJs em um músculo dos membros posteriores é desafiador porque requer demorado seccionamento serial e imunocoloração extensiva. A LAL mouse é uma folha, fino e liso do músculo localizado superficialmente no dorso do pescoço. É um músculo de contração rápida, que funciona para mover o pavilhão auricular. Ele contém porções rostral e caudal que se originam a partir da linha média do crânio e se estendem lateralmente à porção cartilaginosa de cada pavilhão. O músculo é fornecida por um ramo do nervo facial que os projetos caudalmente à medida que sai do forame stylomastoid. Nós e os outros descobriram LAL ser uma preparação conveniente que oferece vantagens para a investigação de curto e longo prazo os efeitos in vivo de drogas em NMJs e músculos. Em primeiro lugar, a sua localização superficial facilita múltiplas aplicações locais de medicamentos sob anestesia luz. Segundo, sua magreza (2-3 camadas de fibras musculares) permite a visualização e análise de quase todos os NMJs dentro do músculo. Em terceiro lugar, a facilidade de dissecando-a com a sua intacta nervo, juntamente com o padrão de sua inervação permite análise suplementar eletrofisiológicos in vitro 9,5. Por último, e talvez mais importante, um pequeno volume aplicado (~ 50μl) facilmente cobre a superfície do músculo inteiro, fornece uma exposição uniforme e prolongado de todos os seus NMJs à droga e elimina a necessidade de uma abordagem sistêmica 1,8.

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Subcutaneous Administration of Muscarinic Antagonists and Triple-Immunostaining of the Levator Auris Longus Muscle in Mice

Descrevemos os procedimentos para a administração repetida de inibidores da sinalização muscarínicos ao longus levantador auris (LAL) muscular de ratos adultos jovens e para a imunocoloração subseqüente de sua junções neuromusculares (NMJs) em wholemounts. O músculo LAL tem vantagens exclusivas para revelar<em&gt; In vivo</em&gt; Efeitos farmacológicos NMJs.

A administração subcutânea de antagonistas muscarínicos e Triple-A imunocoloração do músculo Longus Levator Auris em Ratos

Hind limb muscles of rodents, such as gastrocnemius and tibialis anterior, are frequently used for in vivo  pharmacological studies of the signals ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Assessment of Ultrasonic Vocalizations During Drug Self-administration in Rats

Avaliação de vocalizações ultra-som durante Drogas auto-administração em ratos

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Neurociência

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Administração oral de rotenona usando um Gavage e Análise de Imagem de Alpha-sinucleína Inclusões no sistema nervoso entérico

In Parkinson's disease (PD) patients, the associated pathology follows a characteristic pattern involving inter alia the enteric nervous system (ENS) 1,2, ...

Spectral Confocal Imaging of Fluorescently tagged Nicotinic Receptors in Knock-in Mice with Chronic Nicotine Administration

Imagem Confocal Espectral de fluorescência com a tag receptores nicotínicos na Knock-em camundongos com a administração de nicotina crônica

Ligand-gated ion channels in the central nervous system (CNS) are implicated in numerous conditions with serious medical and social consequences.  For ...

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Visualização de Propriocepção em<em&gt; Drosophila</em&gt; As larvas e pupas

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