Name: subcutaneous administration of muscarinic antagonists and triple-immunostaining of the levator auris longus muscle in mice
Uploaded: 2011-09-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Subcutaneous Administration of Muscarinic Antagonists and Triple-Immunostaining of the Levator Auris Longus Muscle in Mice at JoVE.com

Detta arbete stöddes av muskeldystrofi Association, NIH (NS062320).

1. Subkutan administrering av muskarina (mAChR) acetylkolin receptor antagonister <ol><li> Förbered under aseptiska förhållanden lämplig dos av mAChR antagonist, (jfr tabell) genom att lösa upp läkemedlet i steril fysiologisk koksaltlösning i 1,5 mL reaktionsrör. Följande antagonister har använts: atropin, Methoctramine, 4-DAMP, AFDX-116, AFDX-384, MT 7. </li><li> Rita 50μl lösning i a1cc insulin spruta och använda en separat spruta för varje mus. Också förbereda sprutor innehållande fysiologisk koksa...

<ol>
	<li>Wright, M. C., Son, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliary+neurotrophic+factor+is+not+required+for+terminal+sprouting+and+compensatory+reinnervation+of+neuromuscular+synapses:+re-evaluation+of+CNTF+null+mice.">Ciliary neurotrophic factor is not required for terminal sprouting and compensatory reinnervation of neuromuscular synapses: re-evaluation of CNTF null mice.</a> Exp Neurol. 205, 437-448 (2007).</li><li>Gurney, M. E., Yamamoto, H., Kwon, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+motor+neuron+sprouting+in+vivo+by+ciliary+neurotrophic+factor+and+basic+fibroblast+growth+factor.">Induction of motor neuron sprouting in vivo by ciliary neurotrophic factor and basic fibroblast growth factor.</a> J Neurosci. 12, 3241-3247 (1992).</li><li>Caroni, P., Aigner, L., Schneider, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+neuronal+determinants+locally+regulate+extrasynaptic+and+synaptic+growth+at+the+adult+neuromuscular+junction.">Intrinsic neuronal determinants locally regulate extrasynaptic and synaptic growth at the adult neuromuscular junction.</a> J Cell Biol. 136, 679-692 (1997).</li><li>Witzemann, V., Brenner, H. R., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+factors+regulate+AChR+subunit+mRNAs+at+rat+neuromuscular+synapses.">Neural factors regulate AChR subunit mRNAs at rat neuromuscular synapses.</a> J Cell Biol. 114, 125-141 (1991).</li><li>Angaut-Petit, D., Molgo, J., Connold, A. L., Faille, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+levator+auris+longus+muscle+of+the+mouse:+a+convenient+preparation+for+studies+of+short-+and+long-term+presynaptic+effects+of+drugs+or+toxins.">The levator auris longus muscle of the mouse: a convenient preparation for studies of short- and long-term presynaptic effects of drugs or toxins.</a> Neurosci Lett. 82, 83-88 (1987).</li><li>Lanuza, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-+and+postsynaptic+maturation+of+the+neuromuscular+junction+during+neonatal+synapse+elimination+depends+on+protein+kinase.">Pre- and postsynaptic maturation of the neuromuscular junction during neonatal synapse elimination depends on protein kinase.</a> C. J Neurosci Res. 67, 607-617 (2002).</li><li>Garcia, N., Santafe, M. M., Tomas, M., Lanuza, M. A., Tomas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+effects+of+beta-amyloid25-35+peptide+aggregates+on+transmitter+release+in+neuromuscular+synapses.">Short-term effects of beta-amyloid25-35 peptide aggregates on transmitter release in neuromuscular synapses.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 67, 250-259 (2008).</li><li>Wright, M. C., Cho, W. J., Son, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+patterns+of+motor+nerve+terminal+sprouting+induced+by+ciliary+neurotrophic+factor+vs.+botulinum+toxin.">Distinct patterns of motor nerve terminal sprouting induced by ciliary neurotrophic factor vs. botulinum toxin.</a> J Comp Neurol. 504, 1-16 (2007).</li><li>Wright, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+muscarinic+acetylcholine+receptor+subtypes+contribute+to+stability+and+growth,+but+not+compensatory+plasticity,+of+neuromuscular+synapses.">Distinct muscarinic acetylcholine receptor subtypes contribute to stability and growth, but not compensatory plasticity, of neuromuscular synapses.</a> J Neurosci. 29, 14942-14955 (2009).</li><li>Voss, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+ATP+inhibits+chloride+channels+in+mature+mammalian+skeletal+muscle+by+activating+P2Y1+receptors.">Extracellular ATP inhibits chloride channels in mature mammalian skeletal muscle by activating P2Y1 receptors.</a> J Physiol. 587, 5739-5752 (2009).</li><li>Murray, L. M., Gillingwater, T. H., Parson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+mouse+cranial+muscles+to+investigate+neuromuscular+pathology+in+vivo.">Using mouse cranial muscles to investigate neuromuscular pathology in vivo.</a> Neuromuscul Disord. 20, 740-743 (2009).</li><li>Dorje, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonist+binding+profiles+of+five+cloned+human+muscarinic+receptor+subtypes.">Antagonist binding profiles of five cloned human muscarinic receptor subtypes.</a> J Pharmacol Exp Ther. 256, 727-733 (1991).</li><li>Caulfield, M. P., Birdsall, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+Union+of+Pharmacology.+XVII.+Classification+of+muscarinic+acetylcholine+receptors.">International Union of Pharmacology. XVII. Classification of muscarinic acetylcholine receptors.</a> Pharmacol Rev. 50, 279-290 (1998).</li></ol>

Den metod som presenteras här tillåter undersökning av tidigare okänd roller av subtyp-specifika mAChR signalering i stabilitets-och underhåll av däggdjur NMJs. Denna metod kommer också att vara användbar för att testa effekterna av neurotrofa faktorer och farmakologiska agenter. Till exempel, hittade vårt laboratorium som ciliär Neurotrophic Factor (CNTF) framkallade groning från nästan alla LAL nervändslut i vuxna möss <a>1</a> . Detta resultat jämförs med tidigare studier av CNTF behandlade bakbenen ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reagensets namn </th><th> Företag </th><th> Katalognummer </th><th> Kommentarer </th></tr><tr><td> ketamin </td><td> Hospira </td><td> NDC0409-2051-05 </td><td> Dos: 120mg/kg </td></tr><tr><td> xylazin </td><td> Lloyd Laboratories </td><td> LA33806 </td><td> Dos: 8mg/kg </td></tr><tr><td> atropin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A0132 </td><td> (&gt; 98% renhet) Dos: 0.2mg/kg - 20mg/kg </td></tr><tr><td> atropin </td><td> Voigt Global Distribution </td><td> AT105 </td><td> Farmaceutisk kvalitet </td></tr><tr><td> Methoctramine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M105 </td><td> Dos: 100 - 400 miljoner </td></tr><tr><td> 4-DAMP </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D142 </td><td> Dos: 2.5mg/kg </td></tr><tr><td> AFDX-116 </td><td> Tocris Bioscience </td><td> 1105 </td><td> 250M </td></tr><tr><td> AFDX-384 </td><td> Tocris Bioscience </td><td> 1345 </td><td> 50M - 500M </td></tr><tr><td> MT 7 </td><td> Peptider International </td><td> PMT-4340-S </td><td> 0,1 miljoner - 1M </td></tr><tr><td> 1X Fosfatbuffrad saltlösning, pH 7,4 </td><td> Invitrogen </td><td> 10010049 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehyd </td><td> Fisher </td><td> T353-500 </td><td> Gör 10% lösningen först genom att lösa 10g/100mL avjoniserat vatten, göra 4% med 1X PBS, justera pH till 7,4 </td></tr><tr><td> Natrium pentobarbitol </td><td> Virbac djurhälsa </td><td> NDC-051311-050-01 </td><td> Dos: 390mg/kg </td></tr><tr><td> Sylgard </td><td> Dow Corning </td><td> Del # 184 </td><td> Följ instruktionerna som följer med kit, kan använda flera stora kultur skålen (30mm, 60mm, 100mm) beroende på behov </td></tr><tr><td> 0,1 miljoner Glycine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G-7126 </td><td> Lägg 0.185g till 25 ml 2% BSA / PBS </td></tr><tr><td> 2% bovint serumalbumin (2% BSA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A3059-100g </td><td> Lös 2g BSA till 100 mL 1X PBS </td></tr><tr><td> 0,2% Triton X100 hos 2% BSA / PBS (blockerande buffert) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T9284-100mL </td><td> Lös 0.2ml/100mL 2% BSA / PBS </td></tr><tr><td> α-bungarotoxin </td><td> Invitrogen </td><td> T1175 </td><td> Använd vid koncentration av 1:200 </td></tr><tr><td> SMI-312 </td><td> Sternberger Monoclonals </td><td> SMI312 </td><td> Använd vid koncentration av 1:1000 </td></tr><tr><td> SV2 </td><td> Utvecklingsstudier Hybridoma Bank </td><td> SV2-supernatant </td><td> Använd vid koncentration av 1:10 </td></tr><tr><td> S100 </td><td> Dako </td><td> Z0311 </td><td> Använd vid koncentration av 1:400 </td></tr><tr><td> FITC-get-anti-mus IgG1 </td><td> Roche </td><td> 03117731001 </td><td> Använd vid koncentration av 1:200, men om bakgrunden är hög, försök 1:400 </td></tr><tr><td> Alexa-Fluor 647 konjugerat get-anti-kanin </td><td> Invitrogen </td><td> A21244 </td><td> Använd vid koncentration av 1:200 </td></tr><tr><td> Vectashield fluorescerande montering medier </td><td> Vector laboratorier </td><td> H-1000 </td><td> Detta är inte en hård som media behöver du för att säkra överdraget glida med tydliga nagellack. </td></tr><tr><td> Små våren Saxar </td><td> Fine Science Tools </td><td> 15.002-08 </td><td></td></tr><tr><td> Dissection pincett </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11.295-51 </td><td></td></tr></tbody></table>

subcutaneous administration of muscarinic antagonists and triple-immunostaining of the levator auris longus muscle in mice

Bakbenen muskler av gnagare, såsom gastrocnemius och tibialis anterior, används ofta för in vivo-farmakologiska studier av signaler viktiga för bildandet och underhållet av däggdjur NMJs. Det är dock drog inträngande i dessa muskler efter subkutan eller intramuskulär administrering ofta ofullständiga eller ojämn och många NMJs kan inte påverkas. Även systemisk behandling med enheter som mini-pumpar kan förbättra Spatiotemporal effekter, kan invasiv art detta tillvägagångssätt leda till felkällor inflammatoriska reaktioner och / eller direkt muskelskada. Dessutom är fullständig analys av NMJs i bakbenen muskel utmanande eftersom det kräver tidskrävande seriell sektionering och omfattande immunfärgning. Musen LAL är en tunn, platt ark muskeln ligger ytligt på dorsum av halsen. Det är en snabbt muskelfibrerna som fungerar för att flytta ytterörat. Den innehåller rostralt och stjärtfenan delar som kommer från mittlinjen av kraniet och utöka sidled till brosk del av varje ytterörat. Muskeln tillhandahålls av en gren av ansiktsnerven att projekt caudally när det lämnar stylomastoid foramen. Vi och andra har funnit LAL vara en bekväm beredning som erbjuder fördelar för utredning av både kort-och långsiktiga in vivo effekter av läkemedel på NMJs och muskler. Först underlättar dess ytliga läge flera lokala tillämpningar av narkotika i lätt narkos. För det andra medger dess tunn (2-3 lager av muskelfibrer) visualisering och analys av nästan alla NMJs i muskeln. Tredje, tillåter enkel dissekera den med sitt Nerve intakt tillsammans med mönstret för sin innervation kompletterande elektrofysiologiska analys in vitro 9,5. Sist, och kanske viktigast, täcker en liten tillämpas volym (~ 50μl) enkelt hela muskeln yta, ger en enhetlig och långvarig exponering av alla dess NMJs på läkemedlet och eliminerar behovet av en systematisk strategi 1,8.

Watch this Scientific Journal Video about Subcutaneous Administration of Muscarinic Antagonists and Triple-Immunostaining of the Levator Auris Longus Muscle in Mice at JoVE.com

Subcutaneous Administration of Muscarinic Antagonists and Triple-Immunostaining of the Levator Auris Longus Muscle in Mice

Vi beskriver förfaranden för upprepad administrering av hämmare av muskarina signalerar till levator auris longus (LAL) muskler för unga vuxna möss och för efterföljande immunfärgning av neuromuskulära korsningar (NMJs) i wholemounts. Lal muskeln har unika fördelar för att avslöja<em&gt; In vivo</em&gt; Farmakologiska effekter på NMJs.

Subkutan administrering av muskarina antagonister och Triple-immunfärgning av levator Auris longus muskel i Möss

Hind limb muscles of rodents, such as gastrocnemius and tibialis anterior, are frequently used for in vivo  pharmacological studies of the signals ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Assessment of Ultrasonic Vocalizations During Drug Self-administration in Rats

Bedömning av ultraljud vocalizations Under Drug Self-råttor

Drug self-administration procedures are commonly used to study behavioral and neurochemical changes associated with human drug abuse, addiction and ...

Oral Administration of Rotenone using a Gavage and Image Analysis of Alpha-synuclein Inclusions in the Enteric Nervous System

Oral administrering av Rotenon med en sondmatning och bildanalys av alfa-synuklein införanden i det enteriska nervsystemet

In Parkinson's disease (PD) patients, the associated pathology follows a characteristic pattern involving inter alia the enteric nervous system (ENS) 1,2, ...

Spectral Confocal Imaging of Fluorescently tagged Nicotinic Receptors in Knock-in Mice with Chronic Nicotine Administration

Spektral Confocal avbildning av fluorescensmärkta nikotinreceptorer i Knock-in Möss med kronisk Nikotin Administration

Ligand-gated ion channels in the central nervous system (CNS) are implicated in numerous conditions with serious medical and social consequences.  For ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Visualisering av proprioceptorer i<em&gt; Drosophila</em&gt; Larver och puppor

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Microdialysis of Ethanol During Operant Ethanol Self-administration and Ethanol Determination by Gas Chromatography

Mikrodialys av etanol under operant etanol självadministrering och etanol bestämning med gaskromatografi

Operant self-administration methods are commonly used to study the behavioral and pharmacological effects of many drugs of abuse, including ethanol.  ...

Proprioception and Tension Receptors in Crab Limbs: Student Laboratory Exercises

Proprioception och Tension receptorer i Crab Limbs: Student Laborationer

The primary purpose of these procedures is to demonstrate for teaching and research purposes how to record the activity of living primary sensory neurons ...

A Simple and Inexpensive Method for Determining Cold Sensitivity and Adaptation in Mice

En enkel och billig metod för bestämning Cold Känslighet och anpassning hos möss

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life.  The cold ...

Video Imaging and Spatiotemporal Maps to Analyze Gastrointestinal Motility in Mice

Video Imaging Kartor Spatiotemporal Analysera gastrointestinal motilitet hos möss

The enteric nervous system (ENS) plays an important role in regulating gastrointestinal (GI) motility and can function independently of the central ...

A Protocol for the Administration of Real-Time fMRI Neurofeedback Training

Ett protokoll för den Administration av Real-Time fMRI Neurofeedback träning

Neurologic disorders are characterized by abnormal cellular-, molecular-, and circuit-level functions in the brain. New methods to induce and control ...

Recording Brain Electromagnetic Activity During the Administration of the Gaseous Anesthetic Agents Xenon and Nitrous Oxide in Healthy Volunteers

Inspelning elektromagnetisk hjärnaktivitet under administreringen av den gasformiga bedövningsmedel Xenon och Nitrous Oxide hos friska frivilliga

Anesthesia arguably provides one of the only systematic ways to study the neural correlates of global consciousness/unconsciousness. However to date most ...