Name: imaging g-protein coupled receptor (gpcr)-mediated signaling events that control chemotaxis of dictyostelium discoideum
Uploaded: 2011-09-20T12:00:00
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Diese Arbeit wird durch die intramuralen Fonds von NIAID, NIH unterstützt.

1. Vorbereitung der chemotaktischen kompetente Zellen von Dictyostelium discoideum <ol><li> Zur Erzeugung von D. discoideum-Zellen, die chemotaktisch auf die chemoattractant cAMP, Ernte wachsenden Zellen in D3-T Rich-Media aus einer Schüttelkultur bei 22 ° C sind </li><li> Waschen Sie die Zellen zweimal in non-Nährstoff-Entwicklungs-Puffer (DB-Puffer mit 5 mM Na 2 HPO 4, 5 mM KH 2 PO 4, 2 mM MgCl 2 und 0,1 mM CaCl 2). </li><li> Re-suspend-Ze...

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	<li>Lijima, M., Huang, Y. E., Devreotes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+and+spatial+regulation+of+chemotaxis.">Temporal and spatial regulation of chemotaxis.</a> Dev Cell. 3, 469-469 (2002).</li><li>Murphy, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+biology+of+leukocyte+chemoattractant+receptors.">The molecular biology of leukocyte chemoattractant receptors.</a> Annu Rev Immunol. 12, 593-593 (1994).</li><li>Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein-linked+signaling+pathways+control+the+developmental+program+of+Dictyostelium.">G protein-linked signaling pathways control the developmental program of Dictyostelium.</a> Neuron. 12, 235-235 (1994).</li><li>Jin, T., Xu, X., Hereld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis,+chemokine+receptors+and+human+disease.">Chemotaxis, chemokine receptors and human disease.</a> Cytokine. 44, 1-1 (2008).</li><li>Meier-Schellersheim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Key+role+of+local+regulation+in+chemosensing+revealed+by+a+new+molecular+interaction-based+modeling+method.">Key role of local regulation in chemosensing revealed by a new molecular interaction-based modeling method.</a> PLoS Comput Biol. 2, e82-e82 (2006).</li><li>Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+mechanism+of+a+GPCR+and+a+heterotrimeric+G+protein+during+chemoattractant+gradient+sensing+in+Dictyostelium.">Coupling mechanism of a GPCR and a heterotrimeric G protein during chemoattractant gradient sensing in Dictyostelium.</a> Sci Signal. 3, 71-71 (2010).</li><li>Xu, X., Meier-Schellersheim, M., Jiao, X., Nelson, L. E., Jin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+imaging+of+single+live+cells+reveals+spatiotemporal+dynamics+of+multistep+signaling+events+of+chemoattractant+gradient+sensing+in+Dictyostelium.">Quantitative imaging of single live cells reveals spatiotemporal dynamics of multistep signaling events of chemoattractant gradient sensing in Dictyostelium.</a> Mol Biol Cell. 16, ra71-ra71 (2005).</li><li>Xu, X., Meier-Schellersheim, M., Yan, J., Jin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locally+controlled+inhibitory+mechanisms+are+involved+in+eukaryotic+GPCR-mediated+chemosensing.">Locally controlled inhibitory mechanisms are involved in eukaryotic GPCR-mediated chemosensing.</a> J. Cell Biol. 178, 141-141 (2007).</li><li>Jin, T., Zhang, N., Long, Y., Parent, C. A., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+the+G+protein+betagamma+complex+in+living+cells+during+chemotaxis.">Localization of the G protein betagamma complex in living cells during chemotaxis.</a> Science. 287, 1034-1034 (2000).</li><li>Janetopoulos, C., Jin, T., Devreotes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor-mediated+activation+of+heterotrimeric+G-proteins+in+living+cells.">Receptor-mediated activation of heterotrimeric G-proteins in living cells.</a> Science. 291, 2408-2408 (2001).</li><li>Funamoto, S., Milan, K., Meili, R., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+phosphatidylinositol+3'+kinase+and+a+downstream+pleckstrin+homology+domain-containing+protein+in+controlling+chemotaxis+in+dictyostelium.">Role of phosphatidylinositol 3' kinase and a downstream pleckstrin homology domain-containing protein in controlling chemotaxis in dictyostelium.</a> J. Cell Biol. 153, 795-795 (2001).</li><li>Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+PLC-beta2+and+-beta3+and+PI3Kgamma+in+chemoattractant-mediated+signal+transduction.">Roles of PLC-beta2 and -beta3 and PI3Kgamma in chemoattractant-mediated signal transduction.</a> Science. 287, 1046-1046 (2000).</li><li>Sasaki, A. T., Chun, C., Takeda, K., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+Ras+signaling+at+the+leading+edge+regulates+PI3K,+cell+polarity,+and+directional+cell+movement.">Localized Ras signaling at the leading edge regulates PI3K, cell polarity, and directional cell movement.</a> J. Cell Biol. 167, 505-505 (2004).</li><li>Meili, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoattractant-mediated+transient+activation+and+membrane+localization+of+Akt/PKB+is+required+for+efficient+chemotaxis+to+cAMP+in+Dictyostelium.">Chemoattractant-mediated transient activation and membrane localization of Akt/PKB is required for efficient chemotaxis to cAMP in Dictyostelium.</a> EMBO J. 18, 2092-2092 .</li><li>Parent, C. A., Blacklock, B. J., Froehlich, W. M., Murphy, D. B., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G+protein+signaling+events+are+activated+at+the+leading+edge+of+chemotactic+cells.">G protein signaling events are activated at the leading edge of chemotactic cells.</a> Cell. 95, 81-81 (1998).</li><li>Funamoto, S., Meili, R., Lee, S., Parry, L., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+regulation+of+3-phosphoinositides+by+PI+3-kinase+and+PTEN+mediates+chemotaxis.">Spatial and temporal regulation of 3-phosphoinositides by PI 3-kinase and PTEN mediates chemotaxis.</a> Cell. 109, 611-611 (2002).</li><li>Iijima, M., Devreotes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+suppressor+PTEN+mediates+sensing+of+chemoattractant+gradients.">Tumor suppressor PTEN mediates sensing of chemoattractant gradients.</a> Cell. 109, 599-599 (2002).</li><li>Haastert, P. J. V. a. n., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis:+signalling+the+way+forward.">Chemotaxis: signalling the way forward.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 5, 626-626 (2004).</li></ol>

Die Prozesse der chemotaktischen kompetente Stadium von Zellen Für Wildtyp D. discoideum Zellen, dauert es etwa 5 ~ 6 Stunden pulsierende Entwicklung bei Raumtemperatur, um sie in einem gut chemotaktische kompetente Stadium, in dem Zellen zeigen eine gut polarisiert zelluläre Morphologie und schnelle Zellmigration (Abb. 1) zu induzieren. Mehrere Faktoren, wie zum Beispiel cAMP-Konzentration für die Taktung, Temperatur und verschiedenen genetischen Hintergründen, kann sich auf den P...

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare </th></tr><tr><td> D3-T Growth Medien </td><td> KD Medical </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Koffein </td><td> Sigma </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Latrunculin B </td><td> Molecular Probes </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Alexa 594 </td><td> Molecular Probes </td><td></td><td></td></tr><tr><td> cAMP </td><td> Sigma </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ChronTrol XT programmierbaren Timer </td><td> ChronTrol Corp </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Miniplus 3 Schlauchpumpe </td><td> Gilbson </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Platform Rotationsschüttler </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> FemtoJet Mikrokapillare Druckversorgung </td><td> Eppendorf </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Einzel-und vier-und Lab-Tek II Deckglas Kammern </td><td> Nalge Nunc International </td><td></td><td></td></tr><tr><td> LSM 510 META oder gleichwertig Fluoreszenzmikroskop </td><td> Zeiss </td><td></td><td> einem 40X 1,3 NA oder 60X 1.4 NA Öl DIC Plan-Neofluar Objektiv </td></tr><tr><td> Olympus X81 oder gleichwertig </td><td> Olymp </td><td></td><td> Benötigt ein 100X 1,47 NA TIRF Objektiv </td></tr></tbody></table>

imaging g-protein coupled receptor (gpcr)-mediated signaling events that control chemotaxis of dictyostelium discoideum

Viele eukaryotischen Zellen können Steigungen von chemischen Signalen in ihrer Umgebung erkennen und wandern entsprechend 1. Diese geführte Zellmigration als Chemotaxis, die wesentlich für verschiedene Zellen zur Erfüllung ihrer Funktionen wie Handel von Immunzellen und Strukturierung von neuronalen Zellen 2, 3 bezeichnet wird. Eine große Familie von G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) erkennt variable kleine Peptide, wie Chemokine bekannt, die Zellmigration in vivo 4 Direktwahltasten. Das Endziel der Chemotaxis Forschung ist zu verstehen, wie ein GPCR Maschinen Sinne Chemokin-Gradienten und steuert Ereignisse, die zu Chemotaxis-Signalisierung. Zu diesem Zweck haben wir bildgebende Techniken verwenden, um zu überwachen, in Echtzeit, räumlich-zeitliche Konzentrationen von Lockstoffen, Zellbewegung in einem Gefälle von Lockstoff, vermittelt GPCR Aktivierung heterotrimerer G-Protein-und intrazellulären Signalwege in Chemotaxis von eukaryotischen Zellen 5-8 beteiligt . Die einfache eukaryotischen Organismus, Dictyostelium discoideum, zeigt chemotaxic Verhaltensweisen, die ähnlich denen der Leukozyten, und D. discoideum ist ein wichtiges Modellsystem für die Untersuchung eukaryotischer Chemotaxis. Wie frei lebenden Amöben, D. discoideum Zellen teilen in Vollmedium. Bei Hunger, in die Zellen eine Entwicklungsstörung Programm, in dem sie durch cAMP-vermittelte Chemotaxis Aggregat multicullular Strukturen zu bilden. Viele Komponenten in Chemotaxis auf cAMP beteiligt haben in D. identifiziert discoideum. Die Bindung von cAMP an einem GPCR (car1) induziert Dissoziation heterotrimerer G-Proteine ​​in Gγ und Gβγ-Untereinheiten 7, 9, 10. Gβγ-Untereinheiten aktivieren Ras, was wiederum aktiviert PI3K, Konvertieren PIP 2 in PIP 3 auf der Zellmembran 11-13. PIP 3 dienen als Bindungsstellen für Proteine ​​mit Pleckstrin Homologie (PH)-Domänen, wodurch Rekrutierung dieser Proteine ​​auf die Membran 14, 15. Die Aktivierung der Rezeptoren car1 steuert auch die Membran Verbände der PTEN, die PIP 3 dephosphoryliert PIP 2 16, 17. Die molekularen Mechanismen sind evolutionär in Chemokin GPCR-vermittelte Chemotaxis von humanen Zellen wie Neutrophile 18 erhalten. Wir präsentieren folgende Methoden zur Untersuchung von Chemotaxis von D. discoideum Zellen. 1. Vorbereitung der chemotaktische Komponente Zellen. 2. Imaging Chemotaxis von Zellen in einem cAMP-Gradienten. 3. Überwachung eines GPCR induzierte Aktivierung von heterotrimeren G-Protein in einzelnen lebenden Zellen. 4. Imaging chemoattractant ausgelösten dynamischen PIP 3 Antworten in einzelnen lebenden Zellen in Echtzeit. Unsere entwickelten bildgebenden Verfahren angewendet, um Chemotaxis von humanen Leukozyten zu studieren.

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Imaging G-protein Coupled Receptor GPCR-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Hier beschreiben wir detailliert Live Cell Imaging Verfahren zur Untersuchung Chemotaxis. Wir präsentieren fluoreszenzmikroskopische Methoden zur raum-zeitlichen Dynamik der Signalwege bei der Migration von Zellen zu überwachen. Die Messung der Signal-Ereignisse ermöglicht es uns, besser zu verstehen, wie ein GPCR-Signalisierung Netzwerk Gradienten Erfassung Lockstoffe und steuert direktionale Migration von eukaryotischen Zellen erreicht.

Imaging G-Protein-gekoppelten Rezeptor (GPCR)-vermittelten Signaltransduktion, die Steuerung der Chemotaxis Dictyostelium discoideum</em

Many eukaryotic cells can detect gradients of chemical signals in their environments and migrate accordingly 1.  This guided cell migration is referred as ...

Research

JoVE Journal

Biology

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

In vivo Quantifizierung der G Protein-gekoppelten Rezeptor-Wechselwirkungen mit spektral aufgelöste Zwei-Photonen-Mikroskopie

The study of protein interactions in living cells is an important area of research because the information accumulated both benefits industrial ...

Forschung

Biologie

Quantifying Agonist Activity at G Protein-coupled Receptors

Die Quantifizierung der Wirkung als Agonist am G-Protein-gekoppelte Rezeptoren

When an agonist activates a population of G protein-coupled receptors (GPCRs), it elicits a signaling pathway that culminates in the response of the cell ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

FRET-Mikroskopie zur Echtzeit-Überwachung der Signalisierung Events in lebenden Zellen mit unimolekularen Biosensors

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

Genetically-encoded Molecular Probes to Study G Protein-coupled Receptors

Genetisch kodierte Molecular Probes, um G-Protein-gekoppelte Rezeptoren Studieren

To facilitate structural and dynamic studies of G protein-coupled receptor (GPCR) signaling complexes, new approaches are required to introduce ...

Characterization of G Protein-coupled Receptors by a Fluorescence-based Calcium Mobilization Assay

Charakterisierung von G-Protein gekoppelten Rezeptoren durch eine Fluoreszenz-basierte Calciummobilisierungsassay

For more than 20 years, reverse pharmacology has been the preeminent strategy to discover the activating ligands of orphan G protein-coupled receptors ...

Visualizing Clathrin-mediated Endocytosis of G Protein-coupled Receptors at Single-event Resolution via TIRF Microscopy

Visualisierung Clathrin-vermittelte Endozytose von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren an Einzelereignis Resolution über TIRF-Mikroskopie

Many important signaling receptors are internalized through the well-studied process of clathrin-mediated endocytosis (CME). Traditional cell biological ...

Investigating the Function of Coronin A in the Early Starvation Response of Dictyostelium discoideum by Aggregation Assays

Investigating the Function of Coronin A in the Early Starvation Response of Dictyostelium discoideum by Aggregation Assays

Die Untersuchung der Funktion von Coronin A in der frühen Starvation Reaktion von<em&gt; Dictyostelium discoideum</em&gt; Durch Aggregationstests

Dictyostelium discoideum amoeba are found in soil, feeding on bacteria. When food sources become scarce, they secrete factors to initiate a multicellular ...

Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells

Imaging G Protein-gekoppelten Rezeptor-vermittelte Chemotaxis und seine Signalereignisse in Neutrophilen-like HL60-Zellen

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many ...

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

Die Untersuchung der Proteinqualitätskontrolle System der<em&gt; D. discoideum</em&gt; Verwendung von Temperaturgesteuerte Live Cell Imaging

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we ...