Name: an allelotyping pcr for identifying salmonella enterica serovars enteritidis, hadar, heidelberg, and typhimurium
Uploaded: 2011-07-22T13:00:00
Duration: 12 min 18 s
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Diese Arbeit wurde von USDA Grants 1999-35212-8680, 2005-01378 und 2010-04288-01, USDA Formula Funds und dem Staat Veterinärmedizin Georgiens Agricultural Research Grant unterstützt. Das Protokoll in dieser Publikation beschrieben wurde für den Einsatz von Studenten im Rahmen der gezielten Forschung Kurse entwickelt: MIBO 4900L, GENE 4960H, BCMB 4960L und BIOL 4960H an der University of Georgia und wird von den Schülern auf verschiedene molekulare Epidemiologie Forschungsprojekte in den Maurer Labor. Wir wollen die vielen Studenten, die Forschung geleistet haben, Maurer und Lee Labors und unserer Abteilung Stuhl, John Glisson für die Unterstützung unserer Bemühungen, Bachelor-Anweisung mit der Forschung zu integrieren danken.

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	<li>Dauga, C., Zabrovskaia, A., Grimont, P. A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restriction+fragment+length+polymorphism+analysis+of+some+flagellin+genes+of+Salmonella+enterica.">Restriction fragment length polymorphism analysis of some flagellin genes of Salmonella enterica.</a> J. Clin. Microbiol. 36, 2835-2843 .</li><li>Hong, Y., Liu, T., Lee, M. D., Hofacre, C. L., Maier, M., White, D. G., Ayers, S., Wang, L., Berghaus, R., Maurer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+screen+of+broth+enrichments+for+Salmonella+enterica+serovars+Enteritidis,+Hadar,+Heidelberg,+and+Typhimurium+using+an+allelotyping+multiplex+PCR+that+targets+O+and+H+antigen+alleles.">A rapid screen of broth enrichments for Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium using an allelotyping multiplex PCR that targets O and H antigen alleles.</a> J. Food Prot. 72, 2198-2201 (2009).</li><li>Hong, Y., Liu, T., Lee, H. o. f. a. c. r. e., Maier, C. L., White, M., Ayers, D. G., Wang, S., Berghaus, L., R, M. a. u. r. e. r. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=J.Rapid+screening+of+Salmonella+enterica+serovars+Enteritidis,+Hadar,+Heidelberg+and+Typhimurium+using+a+serologically-correlative+allelotyping+PCR+targeting+the+O+and+H+antigen+alleles.">J.Rapid screening of Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg and Typhimurium using a serologically-correlative allelotyping PCR targeting the O and H antigen alleles.</a> BMC Microbiol. , (2008).</li><li>Liu, T., Liljebjelke, K., Bartlett, E., Hofacre, C. L., Sanchez, S., Maurer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+nested+PCR+to+detection+of+Salmonella+in+poultry+environments.">Application of nested PCR to detection of Salmonella in poultry environments.</a> J. Food Prot. 65, 1227-1232 (2002).</li><li>Maurer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+and+limitation+of+molecular+techniques.">Rapid detection and limitation of molecular techniques.</a> Ann. Rev. Food Sci. Tech. 2, 259-279 (2011).</li><li>Moscoso, H., Alvarado, I., Hofacre, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+analysis+of+infectious+bursal+disease+virus+from+bursal+tissues+collected+on+FTA+filter+paper.">Molecular analysis of infectious bursal disease virus from bursal tissues collected on FTA filter paper.</a> Avian Dis. 50, 391-396 (2006).</li><li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: a laboratory. , (1989).</li><li>Wittwer, C. T., Fillmore, G. C., Hillyard, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+polymerase+chain+reaction+capillary+tubes+with+hot+air.">Automated polymerase chain reaction capillary tubes with hot air.</a> Nucleic Acids Res. 17, 4353-4357 (1989).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die meisten kommerziell verfügbaren PCR-Tests für den Nachweis von Salmonella Ziele Gene einzigartig für die Gattung (zB Invalidität). Allerdings sind nicht alle Salmonella gleich in ihrer Fähigkeit, Krankheiten an Menschen oder Prävalenz in Tierpopulationen verursachen. Frühzeitige Erkennung von antigenen Unterschiede in Salmonella LPS O-Antigen und flagellinH1 und H2-Antigene hat zur Differenzierung von Salmonella in mehr als 2.500 Serovare auf diesen antigene Unterschiede. Es gibt 46 verschiedene O-Antigene und 86 verschiedene Flagellin (H)-Antigene in der Gattung Salmonella identifiziert. Salmonella kann man (H1) oder zwei verschiedene (H1 &amp; H2) Flagellin besitzen. Die andere Kombination von O, H1, H2 und Antigenen für die 2.500 Salmonella-Serovare heute anerkannt. Ein Serovar wird auf Basis der antigenen Formel aus der Identifizierung der einzelnen O-und H-Antigene gewonnen zugeordnet. Die antigenen Formel ist wie O geschrieben: H1: H2, und wo &quot;-&quot;, bezieht sich auf das Fehlen von H1 oder H2 Flagellin und &quot;NT&quot; (nicht-typisierbaren) für Salmonellen negativ für die O-Antigen. Zum Beispiel ist der Serovar Typhimurium eine S. zugeordnet enterica Isolat mit der antigenen Formel B: i: 1,2, während Enteritidis eine mit der Formel D1 isolieren gegeben ist: g, m: -. Dieses Antigen-Variation in der Salmonella Bevölkerung ist die äußere Manifestation von Unterschieden bei der Nukleotid-Ebene, daher leicht durch PCR genutzt werden. Wir haben die genetischen Unterschiede mit spezifischen O-und H-Allele assoziiert zu einem allelotyping PCR zur ​​Identifizierung von S. zu entwickeln identifiziert enterica Serovare: Enteritidis, Hadar, Heidelberg, und Typhimurium (3). Die richtige Zuordnung und Berichterstattung von Salmonella Serovar erfordert die Prüfung für alle Allele, die mit O verbunden: H1: H2 antigenen Formeln für Enteritidis (D1: g, m: -), Hadar (C2: z10: e, n, x), Heidelberg (B : r: 1,2), und Typhimurium (B: i: 1,2). Ohne Kenntnis der O-Allels oder Antigen, die Feststellung des H1 g, hat m-Allels allein nicht unbedingt identifizieren Salmonella Enteritidis als andere Salmonella-Serovare isoliert: Agona, Kalifornien, und Montevideo, besitzen auch die gleiche Allel. Während die allelotyping PCR ursprünglich entworfen wurde, um zu erkennen in den Vordergrund genannten Salmonella-Serovare, kann dieser Test identifizieren zusätzliche 19 Serovare (Tabelle 3). Unsere allelotyping PCR wurde ursprünglich entwickelt, um O-und H-Allele zu erkennen. In der Praxis hat es sich mehr praktische und kostengünstige für uns die O-Antigen, das durch Objektträgeragglutination Test zu identifizieren, mit O-spezifischen Antiseren, anstatt die O allelotyping PCR bei der Arbeit mit isolierten Salmonella Kulturen. Aber wir empfehlen die Verwendung der O allelotyping PCR, wenn Ihr Labor verwendet diese PCR als Bildschirm (2) oder zur Eingabe von Salmonellen auf FTA-Karten (6) isoliert eingereicht, und verfügen über eine Salmonellen-spezifische PCR mit dem ersten Bildschirm von Proben (4 ). Begrenzen Sie die allelotyping PCRs, nur die Proben, die als Salmonella durch PCR oder biochemische / antigenen Tests identifiziert werden. Das Protokoll in diesem Artikel beschrieben wird ist für den Einsatz mit dem Idaho Technology Rapidcycler, ein Heißluft-Thermocycler, dass man zu verkleinern Reaktionsvolumina und läuft Reaktionsbedingungen in weniger Zeit als viele Heizblock Thermocycler ermöglicht optimiert. Zur Anpassung dieses Protokoll für die Verwendung mit einem Heizblock Thermocycler kann verlangen, Optimierung von Reaktionsbedingungen empirisch durch Absenken / Anheben Glühtemperaturen; Anpassung Primer-Konzentration oder Einstellung MgCl 2-Konzentrationen. Zum Beispiel mussten wir das Protokoll für die MJ Research PTC-200 Thermocycler wie folgt anzupassen. Arbeiten mit der gleichen Reaktion Bände in Tabelle 1 beschrieben, die Arbeiterklasse Lager concentrationof der i-Primer-Satzes auf 2,5 pM verdünnt war, wurde die Annealingtemperatur von 55 ° C bis 45 ° C und Inkubationszeiten bei der Denaturierung, Annealing und Extension Schritten gesenkt wurde auf 20 s für die i / g, m allelotyping PCR verlängert. Nach der entsprechenden positiven und negativen Kontrollen werden in der ersten Inbetriebnahme und Optimierung für jedes PCR, einschließlich veröffentlichten Protokollen von wesentlicher Bedeutung. Wir empfehlen den Erwerb bekannten Salmonella-Serovare, die speziell Anatum (E1: e, h: 1,6), Enteritidis (D1: g, m: -), Hadar (C2: z10: e, n, x), Heidelberg (B: r : 1,2), Montevideo (C1: g, m, s: 1,2,7) und Typhimurium (B: i: 1,2) sowie ein Labor Escherichia coli K12-Stamm (DH5a, LE393, JM109, etc. ) als positive und negative Kontrollen jeweils für die allelotyping PCR-Tests in diesem Artikel beschrieben. Mehrere dieser Salmonella-Serovare als entweder positiv oder negativ Kontrollen dienen, je nachdem, welches Allel getestet. Bestimmte Vorsichtsmaßnahmen und Richtlinien müssen befolgt während der Durchführung dieser und anderen diagnostischen PCR werden. Erstens die räumliche Trennungder Vorlage Vorbereitung, Aufbau PCR und Gelelektrophorese ist von entscheidender Bedeutung bei der Verhinderung möglich PCR carry-over Kontamination und fehlerhafte Berichterstattung der Falsch-Positiven. Darüber hinaus ist die Einbeziehung der entsprechenden Kontrollen notwendig in jeder Routine PCR wie diese Kontrollen Probleme zu identifizieren, wie sie entstehen und helfen bei der Interpretation der Ergebnisse (5). Am wichtigsten ist, ist die Konsistenz wichtig, insbesondere im Hinblick auf die elektrophoretische Bedingungen für Amplikons (PCR-Produkt) Detektion andestimation von Amplicongröße. Um dies zu verdeutlichen, haben wir absichtlich ausgesetzt Elektrophorese früher als in 1A gedacht. Das Molekulargewicht-Standards (Spuren 1 und 13) und der positiven Kontrolle (Spur 2) sind nicht ausreichend getrennt, um genau zu schätzen Größen oder beobachten Trennung von DNA-Fragmenten, wo es kleine Unterschiede (~ 50 bp) in den Größen. Ausreichende Trennung von DNA-Fragmenten, insbesondere das Molekulargewicht-Standards ist notwendig, da die Berichterstattung Positive ist abhängig von der genauen Schätzung der Amplikon Größe und die Unterscheidung zwischen &quot;richtig positiv&quot; aus nicht-spezifischen Amplikons, die manchmal in den täglichen Ablauf einer PCR (5 eingehalten werden ). Zum Beispiel gibt es eine nicht-spezifische Amplikon in Abbildung 1B, Spur 7 (~ 700 bp groß). Hätte Elektrophorese zu früh, abgesetzt werden, wenn der Farbstoff vor nur auf dem halben Weg Punkt im Agarosegel, gäbe es wenig Unterschied zwischen 500 bp und 700 bp DNA-Fragmente werden. Daher würde Probe in Spur 7 irrtümlich gemeldet haben, als positiv für beide i und g, m-Allele. Schließlich muss man die Grenzen bei jedem Test assoziiert zu erkennen. Mehrere der H1/H2 allelotyping PCR nicht die Trennschärfe, um subtile genetische Unterschiede in Allele aus der H2 1,2 erkennen; 1,5; 1,6; 1,7 Antigen-Komplex; e, n, x / e , n, z15 Antigen-Komplex und dem H1 G-Antigen-Komplex, der die g, m-Allel enthält. Ein oder zwei Aminosäure-Veränderungen Rechnung für die unterschiedliche Epitope in diesen Flagellen-Antigene zu präsentieren. Es war daher schwierig für uns, Grundierungen, dass diese manchmal einzigen Basenpaar Unterschiede in der Flagellin Gensequenz (3) ausgenutzt werden könnte, um Design. Zum Beispiel Salmonella-Serovare Dublin (D1: g, p: -) - sind auch PCR-positiv mit unserem g, mallelotyping Grundierungen und Berta (D1:: f, g, t). Die H2 allelotyping Primer nicht unterscheiden kann, Typhimurium (B: i: 1,2) aus Lagos (B: i: 1,5), Heidelberg (B: r: 1,2) aus Bradford (B: r: 1,5), Winneba (B: r: 1,6), oder Remo (B: r: 1,7), oder Hadar (C2: z10: e, n, x) aus Glostrup (C2: z10: e, n, z15). Zwar ist die Wahrscheinlichkeit der Begegnung mit einigen dieser Serovare: Lagos, Bradford, Winneba, Remo oder Glustrup remote ist, ist es eine Möglichkeit und erfordert entweder die Bereitstellung Disclaimer auf der Prüfungen &quot;Beschränkung oder anderen Bestätigungstest. Im Ergebnis dieser PCR-basierten Serotypisierung schnell identifiziert S. enterica Serovare Enteritidis, Hadar, Heidelberg und Typhimurium und O, H1 und H2-Allele mit 19 zusätzlichen Serotypen assoziiert. Dieser Assay ist eine schnelle, kostengünstige Alternative zu herkömmlichen mikrobiologischen Ansatz zur Serotypisierung Salmonella.

<table border="1"><tbody><tr><th> Material Name </th><th> Typ </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentar </th></tr><tr><td> Luria Bertani </td><td></td><td> Fischer </td><td></td><td> (Oder einem vergleichbaren Quelle) </td></tr><tr><td> Mikrozentrifugenröhrchen </td><td> 1,5 ml Kapazität </td><td> Fischer </td><td></td><td> (Oder einem vergleichbaren Quelle) </td></tr><tr><td> Ethanol </td><td> 200 Proof </td><td> Fischer </td><td></td><td> (Oder einem vergleichbaren Quelle) </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> Molecular Biology Grade </td><td> Sigma </td><td></td><td> (Oder einem vergleichbaren Quelle; PCR nur) </td></tr><tr><td> 10 x PCR-Puffer: </td><td> 20 mM MgCl 2 </td><td> Idaho Technology </td><td></td><td> (Puffer wird mit BSA, Ficoll und Tartrazin) </td></tr><tr><td></td><td> 30 mM MgCl 2 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 40 mM MgCl 2 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> PCR-Primer </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMSO </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> dNTP </td><td></td><td> Roche </td><td></td><td> (Oder einem vergleichbaren Quelle) </td></tr><tr><td> Taq DNA Polymerase </td><td></td><td> Denville </td><td></td><td> (Oder einem vergleichbaren Quelle) </td></tr><tr><td> Kapillarpipetten </td><td> 10 pl Volumen </td><td> Idaho Technology </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Schnelle Cycler </td><td></td><td> Idaho Technology </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Agarose </td><td> Low EBO; Molecular Biology Grade </td><td> BioRad </td><td></td><td> (Oder einem vergleichbaren Quelle) </td></tr><tr><td> 50 X TAE-Puffer oder 5X TBE Buffer </td><td></td><td> Fischer </td><td></td><td> (Oder einem vergleichbaren Quelle) </td></tr><tr><td> Ethidiumbromid </td><td></td><td> BioRad </td><td></td><td> (Oder einem vergleichbaren Quelle) </td></tr><tr><td> Horizontal, Tauch-Gel-Elektrophorese Kammer mit Gelform </td><td></td><td> BioRad </td><td></td><td> (Oder einem vergleichbaren Quelle) </td></tr><tr><td> Stromversorgung </td><td></td><td> BioRad </td><td></td><td> (Oder einem vergleichbaren Quelle) </td></tr><tr><td> Molecular Imager Gel Doc-System </td><td></td><td> BioRad </td><td></td><td> (Oder einem vergleichbaren Quelle) </td></tr></tbody></table> Tabelle 4. Materialien

an allelotyping pcr for identifying salmonella enterica serovars enteritidis, hadar, heidelberg, and typhimurium

Aktuelle kommerzielle PCRs Tests zur Identifizierung von Salmonella Zielgene einzigartig zu dieser Gattung. Allerdings gibt es zwei Arten, sechs Unterarten und über 2.500 verschiedene Salmonella Serovare, und nicht alle sind gleich in ihrer Bedeutung für die öffentliche Gesundheit. Zum Beispiel finden S. enterica Subspezies IIIa Arizona auf einem Tisch Ei-Schicht Betrieb ist unbedeutend im Vergleich zu der Isolierung von S. enterica Subspezies I Serovar Enteritidis, die führende Ursache von Salmonellose Zusammenhang mit dem Konsum von Konsumeiern. Serovare sind basierend auf antigene Unterschiede in Lipopolysaccharid (LPS) (O-Antigen) und Flagellin (H1 und H2-Antigene) identifiziert. Diese antigenen Unterschiede sind das äußere Erscheinungsbild der Vielfalt der Gene und Gen-Allele, die mit diesem Phänotyp assoziiert. Wir haben eine allelotyping entwickelt, Multiplex-PCR, die Tasten auf genetische Unterschiede zwischen vier großen S. enterica Subspezies I Serovare bei Geflügel gefunden und verbunden mit erheblichen menschlichen Erkrankungen in den USA. Die PCR-Primerpaare wurden die wichtigsten Gene oder Sequenzen nur an einem bestimmten Salmonella Serovar und entwickelt, um ein Amplikon mit einer Größe spezifisch für das Gen oder Allel produzieren ausgerichtet. Salmonella Serovar ist es, eine auf der Kombination von PCR-Test-Ergebnisse für spezifische LPS-Isolat zugeordnet und Flagellin-Gen-Allele. Die Multiplex-PCRs in diesem Artikel beschrieben werden für den Nachweis von S. spezifischen enterica Subspezies I Serovare Enteritidis, Hadar, Heidelberg, und Typhimurium. Hier zeigen wir, wie die Multiplex-PCRs zu verwenden, um Serovar für eine Salmonellen identifizieren, isolieren.

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An Allelotyping PCR for Identifying Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium

Wir beschreiben eine Multiplex-PCR zum schnellen Nachweis von Salmonella enterica Serovare Enteritidis, Hadar, Heidelberg, und Typhimurium. Spezifische Salmonella-Serovare können, indem sie auf einer Multiplex-PCR, um Gene und Sequenzen einzigartig für die O-Antigen-Biosynthese-Cluster und Flagellin eines bestimmten Serovar identifiziert werden. Serovar wird dann auf eine Salmonellen zugeordnet isolieren über das Auftreten von bestimmten, Größe Amplikons (PCR-Produkt), entsprechend dem Ziel Allel auf.

Ein Allelotyping PCR zur Identifizierung Salmonella enterica Serovare Enteritidis, Hadar, Heidelberg, und Typhimurium

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