Name: an allelotyping pcr for identifying salmonella enterica serovars enteritidis, hadar, heidelberg, and typhimurium
Uploaded: 2011-07-22T13:00:00
Duration: 12 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Allelotyping PCR for Identifying Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium at JoVE.com

Эта работа была поддержана Министерством сельского хозяйства США Гранты 1999-35212-8680, 2005-01378, и 2010-04288-01, USDA Формула фондов и государства ветеринарной медицины Грузии грант сельскохозяйственных исследований. Протокол, описанный в этой публикации был разработан для использования студентами в рамках исследования направлены курсы: MIBO 4900L, GENE 4960H, BCMB 4960L и БИОЛ 4960H в Университете Джорджии и используются студентами на нескольких молекулярных исследовательских проектов эпидемиологии в Маурер лаборатории. Мы хотели бы поблагодарить многих студентов, которые выполняются исследования в Маурер и Ли лабораториях, и наш отдел стул, Джон Глиссона за поддержку наших усилий по интеграции студентов с инструкцией исследований.

<ol>
	<li>Dauga, C., Zabrovskaia, A., Grimont, P. A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restriction+fragment+length+polymorphism+analysis+of+some+flagellin+genes+of+Salmonella+enterica.">Restriction fragment length polymorphism analysis of some flagellin genes of Salmonella enterica.</a> J. Clin. Microbiol. 36, 2835-2843 .</li><li>Hong, Y., Liu, T., Lee, M. D., Hofacre, C. L., Maier, M., White, D. G., Ayers, S., Wang, L., Berghaus, R., Maurer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+screen+of+broth+enrichments+for+Salmonella+enterica+serovars+Enteritidis,+Hadar,+Heidelberg,+and+Typhimurium+using+an+allelotyping+multiplex+PCR+that+targets+O+and+H+antigen+alleles.">A rapid screen of broth enrichments for Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium using an allelotyping multiplex PCR that targets O and H antigen alleles.</a> J. Food Prot. 72, 2198-2201 (2009).</li><li>Hong, Y., Liu, T., Lee, H. o. f. a. c. r. e., Maier, C. L., White, M., Ayers, D. G., Wang, S., Berghaus, L., R, M. a. u. r. e. r. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=J.Rapid+screening+of+Salmonella+enterica+serovars+Enteritidis,+Hadar,+Heidelberg+and+Typhimurium+using+a+serologically-correlative+allelotyping+PCR+targeting+the+O+and+H+antigen+alleles.">J.Rapid screening of Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg and Typhimurium using a serologically-correlative allelotyping PCR targeting the O and H antigen alleles.</a> BMC Microbiol. , (2008).</li><li>Liu, T., Liljebjelke, K., Bartlett, E., Hofacre, C. L., Sanchez, S., Maurer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+nested+PCR+to+detection+of+Salmonella+in+poultry+environments.">Application of nested PCR to detection of Salmonella in poultry environments.</a> J. Food Prot. 65, 1227-1232 (2002).</li><li>Maurer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+and+limitation+of+molecular+techniques.">Rapid detection and limitation of molecular techniques.</a> Ann. Rev. Food Sci. Tech. 2, 259-279 (2011).</li><li>Moscoso, H., Alvarado, I., Hofacre, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+analysis+of+infectious+bursal+disease+virus+from+bursal+tissues+collected+on+FTA+filter+paper.">Molecular analysis of infectious bursal disease virus from bursal tissues collected on FTA filter paper.</a> Avian Dis. 50, 391-396 (2006).</li><li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: a laboratory. , (1989).</li><li>Wittwer, C. T., Fillmore, G. C., Hillyard, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+polymerase+chain+reaction+capillary+tubes+with+hot+air.">Automated polymerase chain reaction capillary tubes with hot air.</a> Nucleic Acids Res. 17, 4353-4357 (1989).</li></ol>

Нет конфликта интересов объявлены.

Большинство имеющихся в продаже тестов PCR для обнаружения сальмонеллы цели генов уникальны для рода (например, Инва). Однако, не все Salmonella равны в их способности вызывать заболевания людей или распространенность в популяции животных. Раннее распознавание антигенных различий в Salmonella ЛПС О-антиген и flagellinH1 и H2 антигенов привела к дифференциации сальмонелл в более 2500 сероваров на основе этих антигенных различий. Есть 46 различных антигенов O и 86 различных флагеллин (H) антигены, определенные в роду Salmonella. Сальмонеллы могут иметь один (H1) или двух разных (H1 и H2) flagellins. Различные комбинации O, H1, H2 и антигенов составляет 2500 сероваров сальмонелл признал сегодня. Серовар присваивается на основании антигенной формулой, выведенной из идентификации отдельных O и H антигенов. Антигенной формулой записывается как O: H1: Н2, а где &quot;-&quot;, ссылается на отсутствие H1 или H2 флагеллин и &quot;NT&quot; (не typeable) для сальмонелл отрицательной О-антиген. Например, Typhimurium серовар назначен С. enterica изолировать с антигенной формулой B: я: 1,2 в то время как Enteritidis уделяется изоляции с формулой D1: г, м: -. Это изменение антигенного Salmonella населения внешнее проявление различий в нуклеотидных уровня, который может быть легко взломано с помощью ПЦР. Мы выявили генетические различия, связанные с конкретными О и Н аллелей развивать allelotyping ПЦР для выявления С. enterica сероваров: Enteritidis, Хадар, Гейдельберг, и Typhimurium (3). Правильное назначение и отчетности сальмонеллы серовар требует тестирования для всех аллелей связанных с O: H1: H2 антигенной формулы для Enteritidis (D1: г, м: -), Адар (C2: z10: е, п, х), Гейдельберга (B : г: 1,2) и Typhimurium (B: я: 1,2). Без знания о аллель или антиген, нахождение H1 G, M аллелей само по себе не обязательно будет определяться Salmonella изолировать как Enteritidis других сероваров сальмонелл: Агона, штат Калифорния, и Монтевидео, также обладают этим же аллель. Хотя allelotyping ПЦР был первоначально предназначен для обнаружения сальмонеллы Поэтому упомянутые сероваров, этот тест может определить дополнительные 19 сероваров (табл. 3). Наши allelotyping ПЦР был первоначально предназначен для обнаружения О и Н аллелей. На практике, он стал более практичным и экономически эффективным для нас, для определения О-антигена слайд агглютинации, используя О-специфической антисыворотки, а не выполнять O allelotyping ПЦР при работе с изолированными культур сальмонелл. Однако, мы рекомендуем использовать O allelotyping ПЦР, если ваша лаборатория использует эту ПЦР в качестве экрана (2) или для набора Salmonella штаммов представлены на FTA карты (6), и включают в себя Salmonella-специфической ПЦР с первым экраном образцов (4 ). Предельная allelotyping ПЦР только те образцы, которые определены как Salmonella методом ПЦР или биохимических / антигенные тесты. Протокол, описанный в этой статье, была оптимизирована для использования с Айдахо технологии Rapidcycler, горячего воздуха амплификаторе, что позволяет уменьшать реакцию объемах и условиях проходит реакция за меньшее время, чем многие thermocyclers блока нагрева. Чтобы адаптировать этот протокол для использования с амплификаторе блок отопления может потребовать оптимизации условий реакции эмпирическим путем снижения / повышения температуры отжига; настройки грунтовки концентрации; или корректировке MgCl 2 концентрациях. Например, нам пришлось адаптировать протокол для MJ Research PTC-200 амплификаторе следующим образом. Работа с тех же объемах реакции, описанные в таблице 1, работающий фондовый concentrationof набор я грунтовку разбавляют до 2,5 мкм, температура отжига была снижена с 55 ° C до 45 ° С и времени инкубации при денатурации, отжига и расширение шаги была увеличена до 20 с для в / г, м allelotyping ПЦР. Имея соответствующие положительные и отрицательные контроли имеют важное значение в начальной до начала и оптимизацию для любого ПЦР, в том числе опубликованных протоколов. Мы рекомендуем приобретение известных сероваров сальмонелл, в частности Anatum (E1: е, ч: 1,6), Enteritidis (D1: г, м: -), Адар (C2: z10: е, п, х), Гейдельберга (B: г : 1,2), Монтевидео (C1: G, M, S: 1,2,7) и Typhimurium (B: я: 1,2), а палочка Escherichia K12 лаборатории штамма (DH5α, LE393, JM109, и т.д. ) как положительный и отрицательный контроль, соответственно, для allelotyping тестов ПЦР, описанные в этой статье. Некоторые из этих сероваров сальмонелл будет служить положительным или отрицательным контролем, в зависимости от аллель испытания. Некоторые меры предосторожности и руководящие принципы должны быть выполнены во время выполнения этой и любой другой диагностической ПЦР. Во-первых, физическое разделениешаблона подготовки, ПЦР настройки, и гель-электрофореза имеет решающее значение для предотвращения возможных ПЦР переноса загрязнения и ошибочные представления ложных срабатываний. Кроме того, включение соответствующих мер контроля необходимо в любой рутинной ПЦР, как эти элементы управления выявления проблем по мере их возникновения и помочь в интерпретации результатов (5). Самое главное, последовательность имеет важное значение, особенно в связи с электрофоретической условия для ампликона (ПЦР продукта) обнаружения andestimation из ампликона размера. Чтобы проиллюстрировать это, мы намеренно приостановлено электрофореза ранее запланированного на рисунке 1А. Молекулярный вес стандартов (дорожки 1 и 13) и положительного контроля (дорожка 2) не являются достаточно отделены точно оценить размеры или наблюдать разделение фрагментов ДНК, где Есть небольшие различия (~ 50 б.п.) в размерах. Адекватное разделение фрагментов ДНК, особенно молекулярного веса стандартам, имеет важное значение в качестве положительных отчетности зависит от точной оценки размера ампликона и отличительные &quot;истинный положительный результат&quot; от неспецифических ампликонов, которые иногда наблюдаются в повседневной работе любого ПЦР (5 ). Например, есть неспецифический ампликона на Рисунке 1B, переулок 7 (~ 700 б.п. в размере). Если бы электрофореза была прекращена слишком рано, когда краситель фронт только на пол-очка путь в агарозном геле, не было бы мало различий между 500 б.п. и 700 б.п. фрагментов ДНК. Таким образом, образец в переулок 7 было бы ошибочно сообщили, как положительные для обоих я и G, M аллелей. Наконец, нужно признать, ограничения, связанные с какой-либо тест. Некоторые из H1/H2 allelotyping ПЦР не имеют дискриминационный власти различить тонкие генетические различия в аллелей принадлежащих H2 1,2, 1,5, 1,6, 1,7 антиген комплекса, е, п, х / б , п, Z15 комплекса антиген и антиген H1 G комплекс, который включает в себя G, M аллеля. Один или два аминокислот изменения кислоты составляют различные эпитопы, присутствующие в этих жгутиковых антигенов. Поэтому было трудно для нас дизайн праймеров, которые может использовать эти иногда одиночные пары оснований различия в последовательности гена флагеллин (3). Например, сальмонеллы сероваров Дублин (D1: г, р: -) и Берта (D1: F, G, т: -) также ПЦР положительный с нашими г, mallelotyping праймеров. H2 allelotyping грунтовки не могут отличить Typhimurium (B: я: 1,2) из ​​Лагоса (B: я: 1,5), Гейдельберга (B: г: 1,2) Брэдфорд (B: г: 1,5), Виннебе (B: г: 1,6), или Ремо (B: г: 1,7), или Хадар (C2: z10: е, п, х) из Glostrup (C2: z10: е, п, Z15). Хотя вероятность столкновения некоторые из этих сероваров: Лагос, Брэдфорд, Виннебе, Ремо или Glustrup на удаленной машине, это возможность и требует либо предоставление оговорка о тестов ограничение или другого подтверждающего теста. В заключение этой основе ПЦР серотипирование быстро идентифицирует С. enterica сероваров Enteritidis, Хадар, Гейдельберге и Typhimurium, и О, H1, H2 и аллелей связано с дополнительными 19 сероваров. Этот анализ является быстрым, экономически эффективной альтернативой традиционным микробиологическим подход к серотипирование сальмонеллы.

<table border="1"><tbody><tr><th> Материал Имя </th><th> Тип </th><th> Компания </th><th> Номер по каталогу </th><th> Комментарий </th></tr><tr><td> Лурия Бертани </td><td></td><td> Рыболов </td><td></td><td> (Или любой другой аналогичный источник) </td></tr><tr><td> Микроцентрифужную труб </td><td> 1,5 мл емкость </td><td> Рыболов </td><td></td><td> (Или любой другой аналогичный источник) </td></tr><tr><td> Этанол </td><td> 200 доказательство </td><td> Рыболов </td><td></td><td> (Или любой другой аналогичный источник) </td></tr><tr><td> дН 2 O </td><td> Молекулярная биология класса </td><td> Сигма </td><td></td><td> (Или любой другой аналогичный источник; ПЦР только) </td></tr><tr><td> 10 х ПЦР-буфера: </td><td> 20 мМ MgCl 2 </td><td> Айдахо технологии </td><td></td><td> (Буфер поставляется с BSA, Ficoll и Тартразин) </td></tr><tr><td></td><td> 30 мМ MgCl 2 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 40 мМ MgCl 2 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> ПЦР праймеры </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> ДМСО </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> дНТФ </td><td></td><td> Roche </td><td></td><td> (Или любой другой аналогичный источник) </td></tr><tr><td> Taq-ДНК-полимераза </td><td></td><td> Денвилл </td><td></td><td> (Или любой другой аналогичный источник) </td></tr><tr><td> Капиллярные пипетки </td><td> 10 мкл </td><td> Айдахо технологии </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Быстрое Cycler </td><td></td><td> Айдахо технологии </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Агароза </td><td> Низкий РВЗ; молекулярной биологии класса </td><td> BioRad </td><td></td><td> (Или любой другой аналогичный источник) </td></tr><tr><td> 50 х TAE буфера или 5X буфера TBE </td><td></td><td> Рыболов </td><td></td><td> (Или любой другой аналогичный источник) </td></tr><tr><td> Бромистый этидий </td><td></td><td> BioRad </td><td></td><td> (Или любой другой аналогичный источник) </td></tr><tr><td> Горизонтальные, погружные гель-электрофореза камеры с гелем плесень </td><td></td><td> BioRad </td><td></td><td> (Или любой другой аналогичный источник) </td></tr><tr><td> Источник питания </td><td></td><td> BioRad </td><td></td><td> (Или любой другой аналогичный источник) </td></tr><tr><td> Молекулярная Imager Гель Doc системы </td><td></td><td> BioRad </td><td></td><td> (Или любой другой аналогичный источник) </td></tr></tbody></table> Таблица 4. Материалы

an allelotyping pcr for identifying salmonella enterica serovars enteritidis, hadar, heidelberg, and typhimurium

Текущий промышленные испытания ПЦР для выявления сальмонеллы генов-мишеней уникальных для этого рода. Тем не менее, Есть два вида, шесть подвидов и более 2500 различных сероваров сальмонелл, и не все равны по своему значению для общественного здоровья. Например, нахождение С. enterica подвидов IIIa Аризона на слое фермы яйца таблице незначительна по сравнению с изоляцией С. enterica подвидов я серовар Enteritidis, основной причиной сальмонеллеза, связанного с потреблением столового яйца. Сероваров опознаются по антигенные различия в липополисахарида (ЛПС) (О антиген) и флагеллин (H1 и H2 антигены). Эти антигенные различия внешнего вида разнообразия генов и аллелей генов, связанных с этим фенотипом. Мы разработали allelotyping, мультиплексной ПЦР, что клавиши на генетические различия между четырьмя основными С. enterica подвидов я сероваров обнаружены в домашней птице и связаны со значительными заболевания человека в США. Пары праймеров ПЦР были ориентированы на ключевых генов или последовательностей уникальна для конкретного серовар сальмонеллы и предназначена для производства ампликона с размером конкретного для этого гена или аллеля. Сальмонеллы серовар присваивается изоляции основана на сочетании результатов ПЦР для конкретных LPS и аллелей гена флагеллин. Мультиплексный ПЦР, описанные в этой статье, являются специфичными для обнаружения С. enterica подвидов я сероваров Enteritidis, Хадар, Гейдельберг, и Typhimurium. Здесь показано, как использовать мультиплекс ПЦР для выявления серовар для сальмонелл изолировать.

Watch this Scientific Journal Video about An Allelotyping PCR for Identifying Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium at JoVE.com

An Allelotyping PCR for Identifying Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium

Мы описываем мультиплексной ПЦР для быстрого обнаружения сальмонеллы enterica сероваров Enteritidis, Хадар, Гейдельберг, и Typhimurium. Конкретные сероваров сальмонелл могут быть идентифицированы путем охвата мультиплексной ПЦР на гены и последовательности уникальны для О-антиген кластера биосинтеза и флагеллин данного серовар. Серовар присваивается затем Salmonella изолировать на основе появления конкретных, размер ампликонов (ПЦР продукта), соответствующей целевой аллеля.

Allelotyping ПЦР для выявления Salmonella enterica Сероваров Enteritidis, Хадар, Гейдельберг, и Typhimurium

Current commercial PCRs tests for identifying Salmonella target genes unique to this genus.  However, there are two species, six subspecies, and over ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

An Allelotyping PCR for Identifying Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium

Identifying Dysregulated Genes Induced by Kaposi's Sarcoma-associated Herpesvirus (KSHV)

Identifying Dysregulated Genes Induced by Kaposi's Sarcoma-associated Herpesvirus KSHV

Определение дизрегуляции Гены индуцированные саркомы связанных герпеса Капоши (KSHV)

Currently KS is the most predominant HIV/AIDS related malignancy in Southern Africa and hence the world.1,2 It is characterized as an angioproliferative ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

<em&gt; В пробирке</em&gt; Модель для изучения гетерогенности человека дифференциации макрофагов и поляризация

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

Measuring Growth and Gene Expression Dynamics of Tumor-Targeted S. Typhimurium Bacteria

Measuring Growth and Gene Expression Dynamics of Tumor-Targeted S. Typhimurium Bacteria

Измерение экономического роста и динамика экспрессии генов опухолей, ориентированные<em&gt; С. Typhimurium</em&gt; Бактерии

The goal of these experiments is to generate quantitative time-course data on the growth and gene expression dynamics of attenuated S. typhimurium ...

Procedures for Identifying Infectious Prions After Passage Through the Digestive System of an Avian Species

Процедуры выявления инфекционных прионов после прохождения через пищеварительный тракт птичьего видов

Infectious prion (PrPRes) material is likely the cause of fatal, neurodegenerative transmissible spongiform encephalopathy (TSE) diseases1. Transmission ...

A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium

A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium

Протокол заразить<em&gt; Caenorhabditis Элеганс</em&gt; С<em&gt; Сальмонелла Typhimurium</em

In the last decade, C. elegans has emerged as an invertebrate organism to study interactions between hosts and pathogens, including the host defense ...

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

Высокая пропускная Анализ фенотипу<em&gt; Salmonella enterica</em&gt; Typhimurium Ассоциация, Нашествие, и репликации в макрофагах

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Создание установки с высокой пропускной способностью для скрининга малых молекул, которые модулируют с-ди-GMP Передача сигналов в<em&gt; Синегнойной</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR (RS-PCR)

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR RS-PCR

генотипирование<em&gt; Стафилококк</em&gt; рибосомальным Spacer ПЦР (RS-PCR)

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Изоляция Salmonella typhimurium-содержащих Phagosomes от макрофагов

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Высок объём платформы для проверки Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...