Name: an allelotyping pcr for identifying salmonella enterica serovars enteritidis, hadar, heidelberg, and typhimurium
Uploaded: 2011-07-22T13:00:00
Duration: 12 min 18 s
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Este trabajo ha sido subvencionado por el USDA 1999-35212-8680, 2005-01378, y 2010-04288-01, Fondos USDA Fórmula y el Estado de Beca de Investigación Veterinaria de Georgia Medicina Agrícola. El protocolo descrito en esta publicación se ha desarrollado para su uso por los estudiantes como parte de los cursos de investigación dirigido: MIBO 4900L, 4960H GENE, BCMB 4960L, y BIOL 4960H en la Universidad de Georgia y utilizados por los estudiantes en varios proyectos de investigación de epidemiología molecular en el Maurer laboratorio. Queremos agradecer a los muchos estudiantes de pregrado que se han realizado investigaciones en los laboratorios de Maurer y Lee, y nuestro jefe de departamento, John Glisson por apoyar nuestros esfuerzos para integrar la enseñanza de pregrado con la investigación.

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	<li>Dauga, C., Zabrovskaia, A., Grimont, P. A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restriction+fragment+length+polymorphism+analysis+of+some+flagellin+genes+of+Salmonella+enterica.">Restriction fragment length polymorphism analysis of some flagellin genes of Salmonella enterica.</a> J. Clin. Microbiol. 36, 2835-2843 .</li><li>Hong, Y., Liu, T., Lee, M. D., Hofacre, C. L., Maier, M., White, D. G., Ayers, S., Wang, L., Berghaus, R., Maurer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+screen+of+broth+enrichments+for+Salmonella+enterica+serovars+Enteritidis,+Hadar,+Heidelberg,+and+Typhimurium+using+an+allelotyping+multiplex+PCR+that+targets+O+and+H+antigen+alleles.">A rapid screen of broth enrichments for Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium using an allelotyping multiplex PCR that targets O and H antigen alleles.</a> J. Food Prot. 72, 2198-2201 (2009).</li><li>Hong, Y., Liu, T., Lee, H. o. f. a. c. r. e., Maier, C. L., White, M., Ayers, D. G., Wang, S., Berghaus, L., R, M. a. u. r. e. r. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=J.Rapid+screening+of+Salmonella+enterica+serovars+Enteritidis,+Hadar,+Heidelberg+and+Typhimurium+using+a+serologically-correlative+allelotyping+PCR+targeting+the+O+and+H+antigen+alleles.">J.Rapid screening of Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg and Typhimurium using a serologically-correlative allelotyping PCR targeting the O and H antigen alleles.</a> BMC Microbiol. , (2008).</li><li>Liu, T., Liljebjelke, K., Bartlett, E., Hofacre, C. L., Sanchez, S., Maurer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+nested+PCR+to+detection+of+Salmonella+in+poultry+environments.">Application of nested PCR to detection of Salmonella in poultry environments.</a> J. Food Prot. 65, 1227-1232 (2002).</li><li>Maurer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+and+limitation+of+molecular+techniques.">Rapid detection and limitation of molecular techniques.</a> Ann. Rev. Food Sci. Tech. 2, 259-279 (2011).</li><li>Moscoso, H., Alvarado, I., Hofacre, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+analysis+of+infectious+bursal+disease+virus+from+bursal+tissues+collected+on+FTA+filter+paper.">Molecular analysis of infectious bursal disease virus from bursal tissues collected on FTA filter paper.</a> Avian Dis. 50, 391-396 (2006).</li><li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: a laboratory. , (1989).</li><li>Wittwer, C. T., Fillmore, G. C., Hillyard, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+polymerase+chain+reaction+capillary+tubes+with+hot+air.">Automated polymerase chain reaction capillary tubes with hot air.</a> Nucleic Acids Res. 17, 4353-4357 (1989).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

La mayoría de los disponibles en el mercado pruebas PCR para la detección de los objetivos de Salmonella único en el género (por ejemplo, invA) genes. Sin embargo, no todos los serotipos son iguales en su capacidad para causar enfermedades en humanos o la prevalencia en las poblaciones animales. El reconocimiento temprano de las diferencias antigénicas de Salmonella LPS O-antígeno y antígenos H2 flagellinH1 y ha dado lugar a la diferenciación de Salmonella en más de 2.500 serotipos sobre la base de estas diferencias antigénicas. Hay 46 diferentes antígenos O y 86 antígenos distintos flagelina (H) identificados en el género Salmonella. Salmonella puede poseer uno (H1) o de dos diferentes (H1 y H2) flagellins. La combinación diferente de O, H1, H2 y cuenta antígenos de los serotipos de Salmonella 2.500 reconocido hoy en día. Un serotipo es asignado sobre la base de la fórmula antigénica derivada de la identificación de la persona antígenos O y H. La fórmula antigénica se escribe como O: H1: H2, y donde &quot;-&quot;, se refiere a la ausencia de flagelina H1 o H2 y &quot;NT&quot; (no tipificable) para Salmonella negativo para el antígeno-O. Por ejemplo, el serovar Typhimurium se asigna a una S. enterica aislada con la fórmula antigénica B: i: 1,2, mientras que Enteritidis se le da a un aislamiento con la fórmula D1: g, m: -. Esta variación antigénica en la población de Salmonella es la manifestación externa de las diferencias a nivel de nucleótidos que por lo tanto pueden ser fácilmente explotados por PCR. Hemos identificado las diferencias genéticas específicas asociadas con los alelos S y H para desarrollar un PCR para la identificación de S. allelotyping enterica serovar: Enteritidis, Hadar, Heidelberg, y Typhimurium (3). La correcta asignación y presentación de informes de Salmonella serovar requiere una prueba para todos los alelos asociados con O: H1: H2 fórmulas antigénicas para Enteritidis (D1: g, m: -), Hadar (C2: z10: e, n, x), Heidelberg (B : r: 1,2) y Typhimurium (B: i: 1,2). Sin el conocimiento del alelo S o antígeno, el hallazgo de la g H1, el alelo m por sí sola no se identifica necesariamente la Salmonella Enteritidis en aislar como otros serotipos de Salmonella: Agona, California, y Montevideo, también poseen este mismo alelo. Mientras que la PCR allelotyping fue originalmente diseñado para detectar un primer plano mencionado serotipos de Salmonella, esta prueba puede identificar otros 19 serotipos (tabla 3). Nuestra allelotyping PCR fue diseñada originalmente para detectar alelos S y H. En la práctica, se ha vuelto más práctico y rentable para que podamos identificar el antígeno-O por la prueba de aglutinación, utilizando antisueros específicos O, en lugar de realizar el PCR allelotyping O cuando se trabaja con cultivos de Salmonella aisladas. Sin embargo, se recomienda utilizar el O allelotyping PCR si el laboratorio utiliza el PCR como una pantalla (2) o para la clasificación presentada en los aislamientos de Salmonella tarjetas FTA (6), e incluyen una PCR específica de Salmonella con la primera pantalla de las muestras (4 ). Limitar la PCR allelotyping a sólo aquellas muestras que se identifican como Salmonella por PCR o pruebas bioquímicas / antigénica. El protocolo se describe en este artículo ha sido optimizado para su uso con el Rapidcycler Idaho Technology, un termociclador de aire caliente que permite a reducir los volúmenes de reacción y las condiciones de reacción se ejecuta en menos tiempo de lo que muchos termocicladores calefacción bloque. Para adaptar este protocolo para su uso con un termociclador un calentador pueden requerir la optimización de las condiciones de reacción empíricamente mediante la reducción / aumento de las temperaturas de recocido, el ajuste de concentración de los cebadores, o el ajuste de concentraciones de MgCl 2. Por ejemplo, hemos tenido que adaptar el protocolo para el MJ Research PTC-200 termociclador de la siguiente manera. Trabajar con los volúmenes misma reacción en la tabla 1, las acciones de trabajo concentrationof se diluyó el primer set i de 2,5 M, la temperatura de hibridación se redujo de 55 ° C a 45 ° C, y los tiempos de incubación en la desnaturalización, hibridación y extensión de las medidas se alargó a 20 s para el i / g, m allelotyping PCR. Tener el control, positivas y negativas son esenciales en la puesta en marcha inicial y la optimización de los PCR, incluyendo los protocolos publicados. Recomendamos adquirir conocido serotipos de Salmonella, especialmente Anatum (E1: e, h: 1,6), Enteritidis (D1: g, m: -), Hadar (C2: z10: e, n, x), Heidelberg (B: r : 1,2), Montevideo (C1: g, m, s: 1,2,7) y Typhimurium (B: i: 1,2), y un laboratorio de Escherichia coli K12 (DH5a, LE393, JM109, etc ) como controles positivos y negativos, respectivamente, para las pruebas de PCR allelotyping descrito en este artículo. Varios de estos serotipos de Salmonella servirá como control positivo o negativo, dependiendo de qué alelo se pone a prueba. Ciertas precauciones y pautas se deben seguir al realizar esta y cualquier otro diagnóstico de PCR. En primer lugar, la separación físicade la preparación de la plantilla, PCR puesta en marcha, y la electroforesis en gel es fundamental en la prevención de posibles PCR traspaso de la contaminación y la información errónea de los falsos positivos. Además, la inclusión de los controles adecuados es necesario en cualquier rutina de PCR ya que estos controles identificar los problemas que puedan surgir y ayudar en la interpretación de los resultados (5). Lo más importante, la consistencia es esencial, especialmente en lo que respecta a las condiciones de electroforesis para la detección andestimation amplificación (PCR producto) de tamaño de amplificación. Para ilustrar este punto, a propósito de electroforesis suspendido antes de lo esperado en la figura 1A. Los patrones de peso molecular (calles 1 y 13) y el control positivo (carril 2), no están lo suficientemente separados para estimar con precisión los tamaños y observar la separación de fragmentos de ADN, donde hay pequeñas diferencias (~ 50 pb) en los tamaños. La adecuada separación de los fragmentos de ADN, especialmente los patrones de peso molecular, es fundamental la presentación de informes positivos depende de la estimación precisa del tamaño de amplificación y la distinción &quot;verdaderos positivos&quot; de no amplicones específicos que a veces se observan en el funcionamiento diario de cualquier PCR (5 ). Por ejemplo, hay una amplificación no específicos en la Figura 1B, carril 7 (~ 700 pb de tamaño). Electroforesis había sido descontinuado demasiado pronto, cuando el frente de colorante sólo en el punto a mitad de camino en el gel de agarosa, habría poca diferencia entre 500 pb y 700 pb fragmentos de ADN. Por lo tanto, muestra en la calle 7 que han sido erróneamente reportado como positivo para ambos i y g, m alelos. Finalmente, es necesario reconocer las limitaciones asociadas a cualquier prueba. Varios de los PCR H1/H2 allelotyping no tiene el poder discriminatorio para distinguir sutiles diferencias genéticas en los alelos que pertenecen a la H2 1,2, 1,5, 1,6, 1,7 complejo antígeno, e, n, x / e , n, Z15 complejo antígeno y el complejo antígeno H1 G, que incluye la g, m alelo. Uno o dos cambios de aminoácidos en cuenta los diferentes epítopos presentes en estos antígenos flagelares. Por lo tanto, difícil para nosotros el diseño de cebadores que podría explotar estas diferencias de base en ocasiones de un solo par en la secuencia del gen de flagelina (3). Por ejemplo, Salmonella serovares Dublin (D1: g, p: -) y Berta (D1: f, g, t: -) también son positivas en la PCR con los g, mallelotyping primers. Los cebadores H2 allelotyping no puede distinguir Typhimurium (B: i: 1,2) de Lagos (B: i: 1,5), Heidelberg (B: r: 1,2) de Bradford (B: r: 1,5), Winneba (B: r: 1,6), o Remo (B: r: 1,7), o Hadar (C2: z10: e, n, x) de Glostrup (C2: z10: e, n, Z15). Mientras que la probabilidad de encontrar algunos de estos serotipos: Lagos, Bradford, Winneba, Remo o Glustrup es remota, es una posibilidad y requiere ya sea proporcionando aviso legal sobre la limitación de las pruebas o de otra prueba confirmatoria. En conclusión, este serotipo basado en la PCR identifica rápidamente S. enterica serovar Enteritidis, Hadar, Heidelberg y Typhimurium, y O, H1, H2 y los alelos asociados con 19 serotipos adicionales. Este ensayo es una rápida y rentable alternativa al enfoque tradicional microbiológicos de Salmonella serotipo.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del Material </th><th> Tipo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentario </th></tr><tr><td> Luria Bertani </td><td></td><td> Pescador </td><td></td><td> (O cualquier otra fuente similar) </td></tr><tr><td> Microfuga tubos </td><td> 1,5 ml de capacidad </td><td> Pescador </td><td></td><td> (O cualquier otra fuente similar) </td></tr><tr><td> Etanol </td><td> Prueba 200 </td><td> Pescador </td><td></td><td> (O cualquier otra fuente similar) </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> Grado de Biología Molecular </td><td> Sigma </td><td></td><td> (O cualquier otra fuente similar, sólo PCR) </td></tr><tr><td> 10 x PCR Buffer: </td><td> 20 mM MgCl 2 </td><td> Idaho Tecnología </td><td></td><td> (Tampón viene con BSA, Ficoll y tartrazina) </td></tr><tr><td></td><td> 30 mM MgCl 2 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 40 mM MgCl 2 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> PCR primers </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMSO </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> dNTP </td><td></td><td> Roche </td><td></td><td> (O cualquier otra fuente similar) </td></tr><tr><td> Taq ADN polimerasa </td><td></td><td> Denville </td><td></td><td> (O cualquier otra fuente similar) </td></tr><tr><td> Pipetas capilares </td><td> Un volumen de 10 l </td><td> Idaho Tecnología </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Rápida termociclador </td><td></td><td> Idaho Tecnología </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Agarosa </td><td> Baja EEO; Grado de Biología Molecular </td><td> BioRad </td><td></td><td> (O cualquier otra fuente similar) </td></tr><tr><td> 50 X TAE buffer o tampón TBE 5X </td><td></td><td> Pescador </td><td></td><td> (O cualquier otra fuente similar) </td></tr><tr><td> El bromuro de etidio </td><td></td><td> BioRad </td><td></td><td> (O cualquier otra fuente similar) </td></tr><tr><td> Horizontal, sumergible cámara de electroforesis en gel con molde de gel </td><td></td><td> BioRad </td><td></td><td> (O cualquier otra fuente similar) </td></tr><tr><td> Fuente de alimentación </td><td></td><td> BioRad </td><td></td><td> (O cualquier otra fuente similar) </td></tr><tr><td> Molecular Imager sistema Gel Doc </td><td></td><td> BioRad </td><td></td><td> (O cualquier otra fuente similar) </td></tr></tbody></table> Tabla 4. Materiales

an allelotyping pcr for identifying salmonella enterica serovars enteritidis, hadar, heidelberg, and typhimurium

Las pruebas actuales de terminación de proyecto comercial para la identificación de genes de Salmonella objetivo único de este género. Sin embargo, hay dos especies, subespecies y seis, y más de 2.500 serotipos de Salmonella diferentes, y no todos son iguales en su importancia para la salud pública. Por ejemplo, la búsqueda de S. enterica subespecie IIIa Arizona en una granja ponedora de huevos de mesa es insignificante en comparación con el aislamiento de S. enterica serovar Enteritidis subespecie I, la principal causa de salmonelosis asociados al consumo de huevos de mesa. Serotipos se identifican con base en las diferencias antigénicas de lipopolisacárido (LPS) (antígeno O) y flagelina (H1 y H2 antígenos). Estas diferencias antigénicas son la apariencia externa de la diversidad de los genes y alelos de genes asociados con este fenotipo. Hemos desarrollado un allelotyping, PCR multiplex que las claves en las diferencias genéticas entre los cuatro principales S. enterica serovar subespecie que se encuentra en las aves de corral y se asocia con la enfermedad humana significativa en los EE.UU.. Las parejas de cebadores de PCR fueron dirigidos a genes o secuencias clave única de un serovar de Salmonella específico y diseñado para producir una amplificación con un tamaño específico para que el gen o alelo. Salmonella serovar se asigna a un aislamiento basado en la combinación de resultados de las pruebas de PCR para LPS específicos y flagelina alelos del gen. La PCR multiplex descrito en este artículo son específicos para la detección de S. enterica serovar Enteritidis subespecie I, Hadar, Heidelberg, y Typhimurium. Aquí se demuestra cómo utilizar el multiplex PCR para identificar los serotipos de Salmonella para aislar.

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An Allelotyping PCR for Identifying Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium

Se describe una técnica de PCR múltiple para la detección rápida de Salmonella enterica serovar Enteritidis, Hadar, Heidelberg, y Typhimurium. Serotipos de Salmonella específicos se pueden identificar por objetivo una PCR múltiple para los genes y las secuencias únicas para el grupo O-antígeno de la biosíntesis y la flagelina de un serotipo determinado. Serovar se le asignó a un aislamiento de Salmonella basado en la apariencia de los amplicones específicos de tamaño, (producto de PCR), correspondiente al alelo objetivo.

Una PCR para la identificación de Allelotyping Salmonella enterica Serotipos Enteritidis, Hadar, Heidelberg, y Typhimurium

Current commercial PCRs tests for identifying Salmonella target genes unique to this genus.  However, there are two species, six subspecies, and over ...

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