Name: live cell imaging of bacillus subtilis and streptococcus pneumoniae using automated time-lapse microscopy
Uploaded: 2011-07-28T13:00:00
Duration: 7 min 31 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy at JoVE.com

JWVのグループでの作業は、EUのマリーキュリー復帰フェローシップ、Sysmo2グラント（NWO-ALW/ERASysBio）、ホライゾン助成金（ZonMW）でとVENIフェローシップ（NWO - ALW）によってサポートされています。 OPKのグループは、いくつかのSTWの助成金（NWO）、SYSMO1（IGdeJ）とSYSMO2助成金、ESF Eurocoresシンバイオ助成金（SynMod）でと工業的発酵食品と栄養のトップ研究所のゲノミクスのためのKluyverセンターによってサポートされています。

<ol>
	<li>Veening, J. W., Smits, W. K., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bistability,+epigenetics,+and+bet-hedging+in+bacteria.">Bistability, epigenetics, and bet-hedging in bacteria.</a> Annu. Rev Microbiol. 62, 193-193 (2008).</li><li>Dubnau, D., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bistability+in+bacteria.">Bistability in bacteria.</a> Mol Microbiol. 61, 564-564 (2006).</li><li>Locke, J. C., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+movies+to+analyse+gene+circuit+dynamics+in+single+cells.">Using movies to analyse gene circuit dynamics in single cells.</a> Nat. Rev. Microbiol. 7 (5), 383-383 (2009).</li><li>Veening, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bet-hedging+and+epigenetic+inheritance+in+bacterial+cell+development.">Bet-hedging and epigenetic inheritance in bacterial cell development.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105 (11), 4393-4393 (2008).</li><li>de Jong, I. G., Veening, J. W., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochronic+phosphorelay+gene+expression+as+a+source+of+heterogeneity+in+Bacillus+subtilis+spore+formation.">Heterochronic phosphorelay gene expression as a source of heterogeneity in Bacillus subtilis spore formation.</a> J. Bacteriol. 192 (8), 2053-2053 (2010).</li><li>Veening, J. W., Murray, H., Errington, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanism+for+cell+cycle+regulation+of+sporulation+initiation+in+Bacillus+subtilis.">A mechanism for cell cycle regulation of sporulation initiation in Bacillus subtilis.</a> Genes Dev. 23 (16), 1959-1959 (2009).</li><li>Eberhardt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+localization+of+choline-utilization+proteins+in+Streptococcus+pneumoniae+using+novel+fluorescent+reporter+systems.">Cellular localization of choline-utilization proteins in Streptococcus pneumoniae using novel fluorescent reporter systems.</a> Mol Microbiol. 74 (2), 395-395 (2009).</li><li>Vasantha, N., Freese, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme+changes+during+Bacillus+subtilis+sporulation+caused+by+deprivation+of+guanine+nucleotides.">Enzyme changes during Bacillus subtilis sporulation caused by deprivation of guanine nucleotides.</a> J Bacteriol. 144 (3), 1119-1119 (1980).</li><li>Stewart, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+and+death+in+an+organism+that+reproduces+by+morphologically+symmetric+division.">Aging and death in an organism that reproduces by morphologically symmetric division.</a> PLoS. Biol. 3, 45-45 (2005).</li><li>Rosenfeld, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+regulation+at+the+single-cell+level.">Gene regulation at the single-cell level.</a> Science. 307 (5717), 1962-1962 (2005).</li><li>Guberman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PSICIC:+noise+and+asymmetry+in+bacterial+division+revealed+by+computational+image+analysis+at+sub-pixel+resolution.">PSICIC: noise and asymmetry in bacterial division revealed by computational image analysis at sub-pixel resolution.</a> PLoS. Comput. Biol. 4 (11), 1000233-1000233 (2008).</li><li>Montero, L. l. o. p. i. s. . P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+organization+of+the+flow+of+genetic+information+in+bacteria.">Spatial organization of the flow of genetic information in bacteria.</a> Nature. 466, 77-77 (2010).</li><li>Avery, O. T., Macleod, C. M., McCarty, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+chemical+nature+of+the+substance+inducing+transformation+of+pneumococcal+types:+Induction+of+transformation+by+a+desoxyribonucleic+acid+fraction+isolated+from+pneumococcus+type+III.">Studies on the chemical nature of the substance inducing transformation of pneumococcal types: Induction of transformation by a desoxyribonucleic acid fraction isolated from pneumococcus type III.</a> J Exp. Med. 79, 137-137 (1944).</li><li>Hoskins, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+of+the+bacterium+Streptococcus+pneumoniae+strain+R6.">Genome of the bacterium Streptococcus pneumoniae strain R6.</a> J Bacteriol. 183, 5709-5709 (2001).</li><li>Martin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+recA+gene+of+Streptococcus+pneumoniae+is+part+of+a+competence-induced+operon+and+controls+lysogenic+induction.">The recA gene of Streptococcus pneumoniae is part of a competence-induced operon and controls lysogenic induction.</a> Mol Microbiol. 15, 367-367 (1995).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

他の多くの単一のセル技術とは対照的に、ここで説明するタイムラプス蛍光顕微鏡法は、その祖先、その動作、および除算イベントに関する特定のセルの履歴をたどるために使用することができます。蛍光標識した標的プロモーターまたはタンパク質と組み合わせることで、特定の発生経路の活性化は、時間とタンパク質の局在ならびにタンパク質のダイナミクスは、細菌の開発時に監視することができるで追跡することができます。 上記に示したように、別の細菌種に集​​中して研究は特定の細菌の要件に応じて増殖条件を適応することによって行うことができます。我々が遭遇した唯一の制限は、成長条件とサンプルサイズに関連しています。密閉された環境のために、培地条件が実験中に変更することはできません。また、実験ごとに4つの系統の最大は、効率的に監視することができます。 いくつかの重要なステップを考えると、ここで説明する単一細胞解析の手法は、容易に自動化された顕微鏡を使用して適用することができます。以下では、これらの重要な手順の概要が与えられます。詳細情報は、メインテキストに記載されて一般的な準備が：それは前の実験への特定の細菌のために必要なオートフォーカスの設定を確認するのが賢明です。可能であれば同様に、蛍光の可視化のためのおおよその最適な設定は、事前に決定されるべきである。また、準備したタイムラインは時間ですぐに使用できるすべての材料を持ってするのに役立つ、以下の（スライド1時間の準備を、顕微鏡の設定をプログラミング、顕微鏡室を事前に温めて細胞は、目的の増殖期になる前に、図1を参照） B.の 。 成長TLMとCDMの枯草菌 ：TLMとCDMが化学的に定義されている飢餓の媒体Bの枯草菌はゆっくりと成長。細胞を培地で栽培される時間期間は、特定の菌株によって延長する必要がある場合があります。低成長がお互いに積み重ねから細胞を防止顕微鏡の試料の調製は：。遺伝子のフレームの間に空気の泡を、スライドガラスとカバーガラスは、アガロースベースの媒体の広範囲な乾燥を防ぐために防止する必要があります。同じことはミディアム/カバースリップのインタフェースにも当てはまります。それは水泳および/ ​​または複数の層の成長を防ぐために、細胞が十分に乾燥させることが重要ですタイムラプス蛍光顕微鏡：。スライドだけでなく、環境室の前の温暖化が主要なオートフォーカスの問題を防ぐために重要である。これらは（サンプルが十分に乾燥させて提供）実験中にフィールドとフォーカスに滞在する最高のチャンスがあるので、細胞は、寒天のパッドの中央に選択する必要があります。実験ごとに10カ所の最大は、まだ正しく動作します。興味のある最初のセルを選択した後のみ（詳細は本文を参照）フォーカスを調整するためのソフトウェアを使用しています。 。細胞は30分間隔での実験分析の最初の数時間中にフォーカス可能かどうかを確認してください：それは媒体の背景が蛍光チャンネルで同じような値を持っているかどうかを事前に拡張された分析手順に確認することが重要です。小さ ​​な塵の粒子が、培地成分、汚れたレンズまたは小型アガロースの塊は、 トラブルシューティングを分析するために映画が困難または不可能に、局所的に増大した蛍光に貢献することができます。細胞は互いの上に成長した場合、これはどちらかのカバースリップがあったことを示すかもしれません早すぎるか、そのメディアが微小コロニー単分子膜の成長に適していない添付。スライド上の他の細胞が喜んで分割するのに対し、関心の細胞は連続して、途中で死亡した場合、あなたは位置にUVフィルターを置くかどうかをチェックすることがあります。また、長時間の実験中に、露光時間や光強度を減少させるために役立つかもしれない。

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント（省略可能） </th></tr><tr><td>遺伝子のフレーム</td><td> ABgene </td><td> AB - 0578 </td><td> 1.7 × 2.8センチメートル</td></tr><tr><td>高解像度の低融点アガロース</td><td>シグマ</td><td> A4718 </td><td></td></tr><tr><td>大きなカバースリップ</td><td>いくつか</td><td></td><td> 24 × 50ミリメートル</td></tr><tr><td>必要に応じて、膜色素、例えば、FM 5から95 </td><td>インビトロジェン</td><td> T23360 </td><td>他の膜の染料も使用可能です。 <a href="http://probes.invitrogen.com/media/pis/mp34653.pdf">http://probes.invitrogen.com/media/pis/mp34653.pdf</a> </td></tr><tr><td>環境室とのタイムラプス顕微鏡</td><td>いくつか</td><td></td><td>対応するセクションで我々のデバイスの詳細を参照してください。 </td></tr></tbody></table>

live cell imaging of bacillus subtilis and streptococcus pneumoniae using automated time-lapse microscopy

ここ数年の間に科学者は微生物集団ベースの実験から得られた平均的なデータが単一の細胞の挙動、状態や表現型の代表ではないことをますます認識するようになりました。この新しい洞察による単一細胞の研究の数は、（最近のレビューのために1,2,3を参照）継続的に上昇する。しかし、適用される単一のセル技術の多くは、時間のある特定の単一のセル（例えばフローサイトメトリーまたは標準顕微鏡）の開発と動作を監視することはできません。 ここで、我々は多くの世代のための成長と分裂を介して枯草菌と肺炎球菌の個々の細菌細胞を以下のと（の蛍光）を記録できるようにいくつかの最近の研究4、5で使用される顕微鏡法、6、7、の詳細な説明を提供しています。結果として得られる動画は、1つの共通祖先に由​​来する集団内の単一セルの歴史をさかのぼることによって系統学的系統樹を構築するために使用することができます。このタイムラプス蛍光顕微鏡法は、個々の細胞の増殖、分裂と分化を調査するだけでなく、特定の細胞挙動のセルの歴史と祖先の影響を分析するために使用することはできません。また、タイムラプス顕微鏡は、理想的には細菌の細胞周期の間に遺伝子発現のダイナミクスとタンパク質の局在を調べるために適しています。方法は、細菌の細胞を調製し、微小コロニーに単一細胞の伸長を有効にするために顕微鏡スライドを構築する方法を説明します。一言で言えば、単一の細胞は、彼らが成長し、温度制御された環境室内で蛍光顕微鏡下で割っているアガロースを添加した増殖培地から成る半固体表面上にスポットされています。画像は特定の間隔でキャプチャされ、後にオープンソースソフトウェアImageJを用いて解析している。

Watch this Scientific Journal Video about Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy at JoVE.com

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

このプロトコルは、自動化された蛍光タイムラプス顕微鏡を用いて時間の異なる細菌の単セルの動作を監視するためにステップバイステップ手順を提供します。さらに、我々は、顕微鏡画像を分析する方法のガイドラインを提供します。

の生細胞イメージング枯草菌と肺炎球菌自動タイムラプス顕微鏡を使用して

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

の間に相乗効果を調査するために生物発光イメージングを使用して肺炎球菌幼児マウスで>とインフルエンザウイルス

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

免疫・感染学

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

の単一細胞解析枯草菌</em蛍光顕微鏡とフローサイトメトリーを用いて>バイオフィルム

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

ライブセル蛍光顕微鏡を用いた細菌毒素誘導される応答の可視化

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

肺炎球菌による鼻腔内コロニー形成時の炎症反応の特徴

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

メンブレン極性膜完全性、細胞内イオン濃度の監視の変更<em&gt;肺炎球菌</em&gt;蛍光染料を使用

Membrane depolarization and ion fluxes are events that have been studied extensively in biological systems due to their ability to profoundly impact ...

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae Using the Quellung Reaction

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae Using the Quellung Reaction

の莢血清型<em&gt;肺炎球菌</em&gt;膨張反応を使用して、

There are over 90 different capsular serotypes of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). As well as being a tool for understanding pneumococcal ...

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

の莢膜血清型<em&gt;肺炎球菌</em&gt;ラテックス凝集による

Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major ...

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

の生理反応を測定します<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;ライブカルシウムイメージングを使用して脂質フェロモンの感覚ニューロン

Unlike mammals, insects such as Drosophila have multiple taste organs. The chemosensory neurons on the legs, proboscis, wings and ovipositor of Drosophila ...

Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device

Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device

コンプリートの蛍光タイムラプスイメージング<em&gt; S。ベネズエラ</emマイクロ流体デバイスの使用&gt;ライフサイクル

Live-cell imaging of biological processes at the single cell level has been instrumental to our current understanding of the subcellular organization of ...

Prevention of Heat Stress Adverse Effects in Rats by Bacillus subtilis Strain

Prevention of Heat Stress Adverse Effects in Rats by Bacillus subtilis Strain

熱の予防によりラットに悪影響をストレス<em&gt;枯草菌</em&gt;ひずみ

This study was designed to evaluate the protective effect of the Bacillus subtilis strain against complications related to heat stress. Thirty-two ...