Name: live cell imaging of bacillus subtilis and streptococcus pneumoniae using automated time-lapse microscopy
Uploaded: 2011-07-28T13:00:00
Duration: 7 min 31 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy at JoVE.com

Arbetet i gruppen JWV stöds av ett EU Marie Curie återintegrering Fellowship, ett Sysmo2 Grant (NWO-ALW/ERASysBio), en Horizon bidrag (ZonMW) och av en Veni gemenskap (NWO-ALW). Gruppen av OPK stöds av flera STW bidrag (NWO), en SYSMO1 (IGdeJ) och SYSMO2 bidrag, ett ESF EUROCORES SynBio bidrag (SynMod) och av Kluyver Centrum för genomik av industriell fermentering och Top Institutet för livsmedel och nutrition.

<ol>
	<li>Veening, J. W., Smits, W. K., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bistability,+epigenetics,+and+bet-hedging+in+bacteria.">Bistability, epigenetics, and bet-hedging in bacteria.</a> Annu. Rev Microbiol. 62, 193-193 (2008).</li><li>Dubnau, D., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bistability+in+bacteria.">Bistability in bacteria.</a> Mol Microbiol. 61, 564-564 (2006).</li><li>Locke, J. C., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+movies+to+analyse+gene+circuit+dynamics+in+single+cells.">Using movies to analyse gene circuit dynamics in single cells.</a> Nat. Rev. Microbiol. 7 (5), 383-383 (2009).</li><li>Veening, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bet-hedging+and+epigenetic+inheritance+in+bacterial+cell+development.">Bet-hedging and epigenetic inheritance in bacterial cell development.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105 (11), 4393-4393 (2008).</li><li>de Jong, I. G., Veening, J. W., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochronic+phosphorelay+gene+expression+as+a+source+of+heterogeneity+in+Bacillus+subtilis+spore+formation.">Heterochronic phosphorelay gene expression as a source of heterogeneity in Bacillus subtilis spore formation.</a> J. Bacteriol. 192 (8), 2053-2053 (2010).</li><li>Veening, J. W., Murray, H., Errington, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanism+for+cell+cycle+regulation+of+sporulation+initiation+in+Bacillus+subtilis.">A mechanism for cell cycle regulation of sporulation initiation in Bacillus subtilis.</a> Genes Dev. 23 (16), 1959-1959 (2009).</li><li>Eberhardt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+localization+of+choline-utilization+proteins+in+Streptococcus+pneumoniae+using+novel+fluorescent+reporter+systems.">Cellular localization of choline-utilization proteins in Streptococcus pneumoniae using novel fluorescent reporter systems.</a> Mol Microbiol. 74 (2), 395-395 (2009).</li><li>Vasantha, N., Freese, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme+changes+during+Bacillus+subtilis+sporulation+caused+by+deprivation+of+guanine+nucleotides.">Enzyme changes during Bacillus subtilis sporulation caused by deprivation of guanine nucleotides.</a> J Bacteriol. 144 (3), 1119-1119 (1980).</li><li>Stewart, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+and+death+in+an+organism+that+reproduces+by+morphologically+symmetric+division.">Aging and death in an organism that reproduces by morphologically symmetric division.</a> PLoS. Biol. 3, 45-45 (2005).</li><li>Rosenfeld, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+regulation+at+the+single-cell+level.">Gene regulation at the single-cell level.</a> Science. 307 (5717), 1962-1962 (2005).</li><li>Guberman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PSICIC:+noise+and+asymmetry+in+bacterial+division+revealed+by+computational+image+analysis+at+sub-pixel+resolution.">PSICIC: noise and asymmetry in bacterial division revealed by computational image analysis at sub-pixel resolution.</a> PLoS. Comput. Biol. 4 (11), 1000233-1000233 (2008).</li><li>Montero, L. l. o. p. i. s. . P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+organization+of+the+flow+of+genetic+information+in+bacteria.">Spatial organization of the flow of genetic information in bacteria.</a> Nature. 466, 77-77 (2010).</li><li>Avery, O. T., Macleod, C. M., McCarty, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+chemical+nature+of+the+substance+inducing+transformation+of+pneumococcal+types:+Induction+of+transformation+by+a+desoxyribonucleic+acid+fraction+isolated+from+pneumococcus+type+III.">Studies on the chemical nature of the substance inducing transformation of pneumococcal types: Induction of transformation by a desoxyribonucleic acid fraction isolated from pneumococcus type III.</a> J Exp. Med. 79, 137-137 (1944).</li><li>Hoskins, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+of+the+bacterium+Streptococcus+pneumoniae+strain+R6.">Genome of the bacterium Streptococcus pneumoniae strain R6.</a> J Bacteriol. 183, 5709-5709 (2001).</li><li>Martin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+recA+gene+of+Streptococcus+pneumoniae+is+part+of+a+competence-induced+operon+and+controls+lysogenic+induction.">The recA gene of Streptococcus pneumoniae is part of a competence-induced operon and controls lysogenic induction.</a> Mol Microbiol. 15, 367-367 (1995).</li></ol>

Inga intressekonflikter deklareras.

I motsats till många andra encelliga metoder kan tidsförlopp fluorescensmikroskopi här beskrivna metoden användas för att följa historien om en specifik cell med avseende på dess förfäder, sitt beteende och händelser division. I kombination med fluorescerande mål initiativtagare eller proteiner, kan särskilda utvecklingsproblem väg aktivering följas i tid och protein lokalisering samt protein dynamik kan övervakas under bakteriell utveckling. Som nämnts ovan kan studier koncentrerar sig på olika bakteriearter utföras genom att anpassa tillväxten villkor enligt kraven för en specifik bakterie. De enda begränsningar vi stött på är relaterade till tillväxt villkor och urval. På grund av en sluten miljö kan mediet förutsättningarna inte ändras under experimentet. Dessutom kan maximalt fyra stammar per försök övervakas effektivt. Med tanke på några kritiska steg, beskrev en enda cell analysmetoden här kan lätt appliceras med alla automatiserade mikroskop. I det följande kommer en översikt av dessa kritiska steg ges. Detaljerad information finns i huvudtexten allmän förberedelse:. Det är klokt att kontrollera autofokus inställningar som krävs för en specifik bakterie före experimentet. Likaså bör ungefärliga optimala inställningar för visualisering av fluorescens bestämmas i förväg, om möjligt. Dessutom, efter en förberedd tidslinje hjälper det att ha allt material färdigt att använda i tid (före uppvärmningen mikroskop kammaren, programmering mikroskopet inställningar, förbereda bilden en timme innan cellerna i önskad tillväxtfas, se figur 1) . Tillväxt av B. subtilis i TLM och CDM: TLM och CDM är kemiskt definierade svält medier där B. subtilis växer endast långsamt. Den tidsperiod där cellerna odlas i media kan behöva förlängas beroende på den specifika stam. Den långsamma tillväxten hindrar cellerna från hopar sig på varandra Beredning av mikroskop prov:. Luftbubblor mellan genen ram, glasplatta och locket glida måste förebyggas för att förhindra omfattande torkning av agarosen-baserade medium. Detsamma gäller på medellång / täckglas gränssnitt. Det är viktigt att låta cellerna tillräckligt torr, för att förhindra bad och / eller flera skikt tillväxt Time-lapse fluorescensmikroskopi:. Pre-uppvärmningen av bilden samt klimatkammare är avgörande för att förebygga allvarliga autofokus problem. Celler bör väljas i mitten av en agar pad, eftersom dessa har störst chans att stanna i området och fokus under försöket (förutsatt att provet var torkat tillräckligt bra). Maximalt 10 platser per experiment fungerar fortfarande väl. Efter att ha valt den första cellen av intresse endast använda programvaran för att justera fokus (se text för detaljer). Kontrollera om cellerna är fortfarande i fokus under de första timmarna av experimentet i 30 min intervaller Analys:. Det är viktigt att kontrollera före omfattande analys förfaranden om bakgrunden till mediet har liknande värden i fluorescens kanaler. Små dammpartiklar, medium komponenter, smutsiga linser eller små agaros klumpar kan bidra till lokalt ökad fluorescens, vilket gör filmen svårt eller omöjligt att analysera Felsökning:. Om cellerna växer ovanpå varandra, kan detta antingen tyda på att täckglaset var bifogas för tidigt eller att mediet inte lämpar sig för tillväxt av microcolony monolager. Om celler av intresse kontinuerligt dör i förtid, medan andra celler i bilden delar glatt, kanske du vill kontrollera om du sätter UV-filter på plats. Det kan också bidra till att minska exponeringen tid eller ljusintensitet under långa experiment.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reagensets namn </th><th> Företag </th><th> Katalognummer </th><th> Kommentarer (frivilligt) </th></tr><tr><td> Gene Frame </td><td> ABgene </td><td> AB-0578 </td><td> 1,7 x 2,8 cm </td></tr><tr><td> högupplösta låg smältpunkt agaros </td><td> Sigma </td><td> A4718 </td><td></td></tr><tr><td> stort täckglas </td><td> flera </td><td></td><td> 24 x 50 mm </td></tr><tr><td> om så önskas, membran färg, t ex FM 5-95 </td><td> Invitrogen </td><td> T23360 </td><td> andra membran färgämnen är också tillgängliga: <a href="http://probes.invitrogen.com/media/pis/mp34653.pdf">http://probes.invitrogen.com/media/pis/mp34653.pdf</a> </td></tr><tr><td> Time-lapse mikroskop med klimatkammare </td><td> flera </td><td></td><td> se detaljer för vår enhet i motsvarande avsnitt </td></tr></tbody></table>

live cell imaging of bacillus subtilis and streptococcus pneumoniae using automated time-lapse microscopy

Under de senaste åren har forskarna blivit alltmer medvetna om att genomsnittliga data från mikrobiell populationsbaserade experiment är inte representativa för beteende, status eller fenotyp av enstaka celler. På grund av denna nya insikt antalet enda cell studier ökar ständigt (för senaste recensionerna se 1,2,3). Däremot tillåter många av de enskilda tillämpas cellen tekniker inte övervaka utvecklingen och beteendet hos en viss enskild cell i tid (t.ex. flödescytometri eller standard mikroskopi). Här ger vi en detaljerad beskrivning av en mikroskopi metod som används i flera aktuella studier 4, 5, 6, 7, som gör att följa och inspelning (fluorescens) enskilda bakterieceller av Bacillus subtilis och Streptococcus pneumoniae genom tillväxt och delning i många generationer. Den resulterande filmer kan användas för att bygga träd fylogenetiska släktlinje genom att spåra historien om en enstaka cell i en befolkning som härstammar från en gemensam förfader. Detta tidsförlopp fluorescensmikroskopi metod kan inte bara användas för att undersöka tillväxt, delning och differentiering av enskilda celler, men också att analysera effekten av cellens historia och anor på specifika cellulära beteende. Dessutom är tidsförlopp mikroskopi idealisk för att undersöka dynamiken genuttryck och protein lokalisering vid bakteriella cellcykeln. Metoden förklarar hur man förbereder bakterieceller och konstruera mikroskop för att utväxt av enskilda celler i en microcolony. Kort sagt, enskilda celler fläckig på ett halvfast yta bestående av odlingsmedium kompletteras med agaros som de växa och dela sig under ett fluorescensmikroskop inom en temperaturstyrd klimatkammare. Bilderna är tagna vid specifika intervaller och senare analyseras med hjälp av öppen källkod ImageJ.

Watch this Scientific Journal Video about Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy at JoVE.com

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

Detta protokoll är en steg-för-steg förfarande för att övervaka enskilda cellens beteende olika bakterier i tiden med hjälp av automatiserade fluorescens time-lapse mikroskopi. Dessutom ger vi riktlinjer för hur man kan analysera mikroskopi bilder.

Levande cell imaging av Bacillus subtilis Och Streptococcus pneumoniae Med hjälp av automatiserade Time-lapse Mikroskopi

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

Använda Bioluminescent Imaging för att undersöka synergi mellan Streptococcus pneumoniae Och influensa A-virus i modersmjölksersättning Möss

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Encelliga Analys av Bacillus subtilis Biofilmer Använda fluorescensmikroskopi och flödescytometri

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

Visualisering av bakterietoxin Inducerade svar Använda Live Mikroskopi Cell Fluorescens

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Karakterisering av inflammatoriska svar under intranasal kolonisering med Streptococcus pneumoniae

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

Övervaknings Förändringar i Membrane polaritet, Membrane Integritet och intracellulära jonkoncentrationer i<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Med hjälp av fluorescerande färger

Membrane depolarization and ion fluxes are events that have been studied extensively in biological systems due to their ability to profoundly impact ...

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae Using the Quellung Reaction

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae Using the Quellung Reaction

Capsular Serotypningen av<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Använda Quellung Reaction

There are over 90 different capsular serotypes of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). As well as being a tool for understanding pneumococcal ...

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae by Latex Agglutination

Kapselkontraktur Serotypningen av<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Av latexagglutination

Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major ...

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

Att mäta fysiologiska reaktioner av<em&gt; Drosophila</em&gt; Sensoriska neuroner till Lipid Feromoner Använda Live Kalcium Imaging

Unlike mammals, insects such as Drosophila have multiple taste organs. The chemosensory neurons on the legs, proboscis, wings and ovipositor of Drosophila ...

Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device

Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device

Fluorescence Time-lapse avbildning av Complete<em&gt; S. venezuelae</em&gt; Life Cycle använda en mikroflödessystem enhet

Live-cell imaging of biological processes at the single cell level has been instrumental to our current understanding of the subcellular organization of ...

Prevention of Heat Stress Adverse Effects in Rats by Bacillus subtilis Strain

Prevention of Heat Stress Adverse Effects in Rats by Bacillus subtilis Strain

Förebyggande av värmestress Biverkningar hos råttor efter<em&gt; Bacillus subtilis</em&gt; Stam

This study was designed to evaluate the protective effect of the Bacillus subtilis strain against complications related to heat stress. Thirty-two ...