Name: a quantitative assay for insulin-expressing colony-forming progenitors
Uploaded: 2011-11-28T12:00:00
Duration: 14 min 39 s
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Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Klaus Kaestner pelo dom da linhagem celular murina Ngn3-EGFP-tronco embrionárias, Lucy Mrs. Brown e do Núcleo de Citometria de análise para assistência na separação de células. Este trabalho foi financiado em parte pelo NIH concede R21DK069997 e R01DK081587 atribuído ao HTK e do California Institute de Medicina Regenerativa (CIRM) bolsas de formação concedidas a MW e LS

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	<li>Ku, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Committing+embryonic+stem+cells+to+early+endocrine+pancreas+in+vitro.">Committing embryonic stem cells to early endocrine pancreas in vitro.</a> Stem cells. 22, 1205-1217 (2004).</li><li>Ku, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-expressing+colonies+developed+from+murine+embryonic+stem+cell-derived+progenitors.">Insulin-expressing colonies developed from murine embryonic stem cell-derived progenitors.</a> Diabetes. 56, 921-929 (2007).</li><li>Chen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+an+in+vitro+differentiation+assay+for+pancreatic-like+cell+development+from+murine+embryonic+stem+cells:+detailed+gene+expression+analysis.">Characterization of an in vitro differentiation assay for pancreatic-like cell development from murine embryonic stem cells: detailed gene expression analysis.</a> Assay. Drug. Dev. Technol. 9, 403-419 (2011).</li><li>Lee, C. S., Perreault, N., Brestelli, J. E., Kaestner, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenin+3+is+essential+for+the+proper+specification+of+gastric+enteroendocrine+cells+and+the+maintenance+of+gastric+epithelial+cell+identity.">Neurogenin 3 is essential for the proper specification of gastric enteroendocrine cells and the maintenance of gastric epithelial cell identity.</a> Genes. 16, 1488-1497 (2002).</li><li>Gu, G., Dubauskaite, J., Melton, D. 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Biol. 143, 827-836 (1998).</li><li>Bonner-Weir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+cultivation+of+human+islets+from+expanded+ductal+tissue.">In vitro cultivation of human islets from expanded ductal tissue.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 7999-8004 (2000).</li><li>Gao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+endocrine+progenitor+cells+and+critical+factors+for+their+differentiation+in+human+adult+pancreatic+cell+culture.">Characterization of endocrine progenitor cells and critical factors for their differentiation in human adult pancreatic cell culture.</a> Diabetes. 52, 2007-2015 (2003).</li><li>Gao, R., Ustinov, J., Korsgren, O., Otonkoski, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+neogenesis+of+human+islets+reflects+the+plasticity+of+differentiated+human+pancreatic+cells.">In vitro neogenesis of human islets reflects the plasticity of differentiated human pancreatic cells.</a> Diabetologia. 48, 2296-2304 (2005).</li><li>Suarez-Pinzon, W. L., Lakey, J. R., Brand, S. J., Rabinovitch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+therapy+with+epidermal+growth+factor+and+gastrin+induces+neogenesis+of+human+islet+beta-cells+from+pancreatic+duct+cells+and+an+increase+in+functional+beta-cell+mass.">Combination therapy with epidermal growth factor and gastrin induces neogenesis of human islet beta-cells from pancreatic duct cells and an increase in functional beta-cell mass.</a> J. Clin. Endocrinol. Metab. 90, 3401-3409 (2005).</li><li>Hao, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-cell+differentiation+from+nonendocrine+epithelial+cells+of+the+adult+human+pancreas.">Beta-cell differentiation from nonendocrine epithelial cells of the adult human pancreas.</a> Nature Medicine. 12, 310-316 (2006).</li><li>Ku, H. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+identification+of+multipotent+precursors+from+adult+mouse+pancreas+that+generate+neural+and+pancreatic+lineages.">Clonal identification of multipotent precursors from adult mouse pancreas that generate neural and pancreatic lineages.</a> Nature Biotechnology. 22, 1115-1124 (2004).</li><li>Rovira, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+centroacinar/terminal+ductal+progenitor+cells+in+adult+mouse+pancreas.">Isolation and characterization of centroacinar/terminal ductal progenitor cells in adult mouse pancreas.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 75-80 (2010).</li></ol>

Não temos nada a revelar.

Ensaios de colônia que permitem avaliações quantitativas e funcionais de células progenitoras do pâncreas individuais foram limitados até agora, o que muito prejudicaram o progresso nos estudos da haste de pâncreas e da biologia de células progenitoras. A essência de um ensaio de colônia é que ele mede a capacidade intrínseca de células progenitoras, e não apenas os seus fenótipo, permitindo a funcionalidade e os potenciais de linhagem de células progenitoras que devem ser observados. É também uma ferramenta quantitativa que pode determinar o número de células progenitoras em uma dada população. No campo de células tronco hematopoiéticas, ensaios de colônia têm desempenhado um papel importante na identificação, bem como decifrar os requisitos do fator de crescimento, interações e mecanismos que regem o compromisso da linhagem dessas células. 6 No campo da biologia de células progenitoras do pâncreas, órgão pancreático 7 , 8 ou a granel culturas 13/09 foram criadas, no entanto, tais ensaios não abordam questi biológicaons no nível da célula única. Sem análises única célula, a existência de multi-potenciais-tronco do pâncreas / progenitores não pode ser provada de forma inequívoca. 14 Aqui nós mostramos que a insulina que expressam formadoras de colônias progenitores podem ser analisadas utilizando uma imagem tridimensional, Matrigel contendo, sistema de cultivo semi-sólido. Embora um sistema de cultura de suspensão 15,16 foi desenvolvido que permite progenitores adulto solteiro de pâncreas a proliferar e se diferenciar em &quot;pancreatospheres&quot;, o nosso ensaio colônia oferece vantagens adicionais. Primeiro, o nosso semi-sólida cultura de sistema de mídia permite que placas de até 25.000 células classificadas por 500 mL por meio de cultura de 24 poços, mantendo a formação de colônias, resultando na faixa linear. 2 Em contraste, o ensaio pancreatosphere suspensão requer o uso de um único método de deposição de células do classificador de células para permitir análises única célula, e, assim, um maior volume de meios de cultura e espaço incubadorasão necessárias. Portanto, nosso ensaio colônia é relativamente fácil e cost-effective de conduzir quando grandes números de células diferentes precisam ser comparados ao mesmo tempo para as atividades progenitor. Em segundo lugar, o nosso semi-sólida mídia permite a distribuição uniforme dos componentes da matriz extracelular e fatores de crescimento, que permite tanto a proliferação ea diferenciação de ocorrer no mesmo poço. Em contraste, é mais difícil fornecer um ambiente como esse, especialmente a matriz, para células em cultura de suspensão. Estamos conscientes de que com o nosso método não pode ser definitivamente provado que cada colônia é derivada de uma única célula, como dois progenitores podem ser posicionadas de forma aleatória próximos uns dos outros e formar uma colônia. No entanto, este problema pode ser superado pela análise secundária usando a manipulação única célula. Direta mão direita de células classificadas único poderia demonstrar definitivamente a origem única célula de cada colônia. Em resumo, a insulina expressar formadoras de colônias de atividade progenitores em meios semi-sólidos aqui descrito oferece oportunidades únicas para estudos sobre os mecanismos de progenitores pancreático ao nível única célula. Por exemplo, em um relatório antes, descobrimos que além de Matrigel, uma mistura bruta de proteínas da matriz extracelular, na cultura da mídia é necessária para a formação da insulina expressar colônias de células-Ngn3 EGFP +, 2 sugerindo a matriz extracelular é importante para aqueles progenitores. Com este ensaio colônia, agora será possível dissecar ainda mais e definir os requisitos matriz específica para tal atividade. Além de estudar progenitores derivadas de células-tronco embrionárias de camundongos, que estão atualmente investigando se esse sistema em ensaio in vitro também apóia a formação de outras colônias distintivo derivado do pâncreas e fígado de camundongos perinatal e de adultos, bem como do tecido pancreático de cadáveres humanos desprovidos de ilhotas.

<table border="1"><tbody><tr><td> Material / Reagente </td><td> Companhia </td><td> Catálogo Número </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> 1X DMEM / F-12 (1:1) </td><td> Mediatech </td><td> 15-090-CV </td><td></td></tr><tr><td> Soro fetal bovino </td><td> Cultura de Tecidos Biologicals </td><td> 201 </td><td> Consulte a Seção 1,1 </td></tr><tr><td> L-glutamina </td><td> Gibco </td><td> 25030-081 </td><td></td></tr><tr><td> 1X PBS Dulbecco </td><td> Mediatech </td><td> 21-031-CV </td><td></td></tr><tr><td> De soro bovino Albumina </td><td> Sigma </td><td> A8412 </td><td> 7,5% </td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> Becton Dickinson </td><td> 356231 </td><td> Crescimento reduzido Fator </td></tr><tr><td> Metilcelulose </td><td> Sinetsu Químicos, Tóquio, Japão </td><td></td><td> 1.500 centipoise (High-viscosity) </td></tr><tr><td> Nicotinamida </td><td> Sigma </td><td> N0636 </td><td></td></tr><tr><td> Humano Recombinante Activina βB </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 659-AB-025 </td><td></td></tr><tr><td> EXENDIN-4 </td><td> Sigma </td><td> E7144 </td><td></td></tr><tr><td> Humano Recombinante VEGF-A </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 293-VE-010 </td><td></td></tr><tr><td> Placas de 24 poços </td><td> Costar </td><td> 3473 </td><td> Ultra-baixo Ligação </td></tr><tr><td> 60 milímetros Petri Dish com grade </td><td> Nunc </td><td> 169558 </td><td></td></tr></tbody></table>

a quantitative assay for insulin-expressing colony-forming progenitors

O campo de pâncreas-tronco e biologia de células progenitoras tem sido dificultada pela falta de testes funcionais in vitro e quantitativas que permitem a análise da única célula. Análises de progenitores único são de importância crítica, porque eles fornecem maneiras definitivo para inequivocamente demonstrar o potencial da linhagem de células progenitoras individual. Embora os métodos tenham sido desenvolvidos para gerar &quot;pancreatospheres&quot; na cultura da suspensão a partir de células individuais, várias limitações existem. Primeiro, é demorado para executar a deposição única célula para um grande número de células, que por sua vez nos comandos de grandes volumes de meios de cultura e espaço. Numeração, segundo a pancreatospheres resultante é de trabalho intensivo, especialmente quando a freqüência dos progenitores pancreatosphere de iniciação é baixa. Terceiro, o ensaio pancreatosphere não é um método eficiente para permitir que tanto a proliferação e diferenciação de células progenitoras do pâncreas na mesma cultura bem, rerestringindo a utilidade do ensaio. Para superar essas limitações, um semi-sólido media ensaio baseado colônia de células progenitoras do pâncreas foi desenvolvido e é apresentado neste relatório. Este método tira vantagem de um conceito existente a partir do ensaio de colônias hematopoiéticas, em que a metilcelulose é usado para fornecer a viscosidade à mídia, permitindo que as células progenitoras para permanecer no espaço tridimensional como se submetem a proliferação, bem como a diferenciação. Para enriquecer insulina expressar formadoras de colônias progenitores de uma população heterogênea, utilizamos as células que expressam neurogenin (NGN) 3, um de pâncreas endócrino marcador de células progenitoras. Tronco embrionárias murinas (ES) de células derivadas de células que expressam Ngn3 marcado com o repórter da proteína verde fluorescente melhorada foram classificados e até 25.000 células por poço foram plaqueadas em anexo baixa pratos de 24 poços cultura. Cada poço continha 500 mL de meio semi-sólido com os seguintes componentes principais: conhecihylcellulose, Matrigel, nicotinamida, EXENDIN-4, ativina βB e mídia condicionado coletados de murino ES derivadas de células-pancreáticas células semelhantes. Depois de 8 a 12 dias de cultura, expressando-insulina colônias com morfologia distinta foram formadas e poderia ser ainda analisados ​​para a expressão de genes de pâncreas utilizando RT-PCR quantitativo e coloração immunoflourescent para determinar a composição linhagem de cada colônia. Em resumo, o nosso ensaio colônia permite fácil detecção e quantificação de células progenitoras funcional dentro de uma população heterogênea de células. Além disso, o semi-sólido formato de mídia permite a apresentação uniforme dos componentes da matriz extracelular e fatores de crescimento para as células, permitindo que os progenitores a proliferar e se diferenciar in vitro. Este ensaio colônia oferece oportunidades únicas para estudos sobre os mecanismos de células progenitoras pancreático ao nível única célula.

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A Quantitative Assay for Insulin-expressing Colony-forming Progenitors

A tridimensionais ensaio clonogênica que permite pancreático-como progenitores de se diferenciar em insulina expressar colônias é descrito. Este método tira vantagem de semi-sólido mídia contendo fatores Matrigel metilcelulose, e crescimento, no qual progenitores única proliferam e se diferenciam<em&gt; In vitro</em&gt;, Permitindo a quantificação do número de células progenitoras funcional em uma população.

Uma análise quantitativa para expressar Insulin-formadoras de colônias Progenitores

The field of pancreatic stem and progenitor cell biology has been hampered by a lack of in vitro functional and quantitative assays that allow for the ...

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