Name: single cell fate mapping in zebrafish
Uploaded: 2011-10-05T13:00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Fate Mapping in Zebrafish at JoVE.com

Мы благодарим J. Chen за предоставление в клетке флуоресцеина-декстран синтеза протокол. Это исследование было поддержано марта Dimes награду 5-FY09-78, Американская Ассоциация Сердца награду 09BGIA2090075, и NIH / NHLBI награду HL107369 R01-01 SS отдельное спасибо C. Клоссон за микроскопии помощи.

<ol>
	<li>Mathur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mEosFP-based+green-to-red+photoconvertible+subcellular+probes+for+plants.">mEosFP-based green-to-red photoconvertible subcellular probes for plants.</a> Plant physiology. 154, 1573-1587 .</li><li>Wiedenmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EosFP,+a+fluorescent+marker+protein+with+UV-inducible+green-to-red+fluorescence+conversion.">EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 15905-15910 (2004).</li><li>Subach, F. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivatable+mCherry+for+high-resolution+two-color+fluorescence+microscopy.">Photoactivatable mCherry for high-resolution two-color fluorescence microscopy.</a> Nature. 6, 153-159 (2009).</li><li>Hatta, K., Tsujii, H., Omura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+tracking+using+a+photoconvertible+fluorescent+protein.">Cell tracking using a photoconvertible fluorescent protein.</a> Nature protocols. 1, 960-967 (2006).</li><li>Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optical+marker+based+on+the+UV-induced+green-to-red+photoconversion+of+a+fluorescent+protein.">An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 12651-12656 (2002).</li><li>Watanabe, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-organelle+tracking+by+two-photon+conversion.">Single-organelle tracking by two-photon conversion.</a> Optics express. 15, 2490-2498 (2007).</li><li>Warga, R. M., Kane, D. A., Ho, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+mapping+embryonic+blood+in+zebrafish:+multi-+and+unipotential+lineages+are+segregated+at+gastrulation.">Fate mapping embryonic blood in zebrafish: multi- and unipotential lineages are segregated at gastrulation.</a> Developmental cell. 16, 744-755 (2009).</li><li>Chudakov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kindling+fluorescent+proteins+for+precise+in+vivo+photolabeling.">Kindling fluorescent proteins for precise in vivo photolabeling.</a> Nature. 21, 191-194 (2003).</li><li>Habuchi, S., Tsutsui, H., Kochaniak, A. B., Miyawaki, A., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mKikGR,+a+monomeric+photoswitchable+fluorescent+protein.">mKikGR, a monomeric photoswitchable fluorescent protein.</a> PloS ONE. 3, e3944-e3944 (2008).</li><li>Nowotschin, S., Hadjantonakis, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+KikGR+a+photoconvertible+green-to-red+fluorescent+protein+for+cell+labeling+and+lineage+analysis+in+ES+cells+and+mouse+embryos.">Use of KikGR a photoconvertible green-to-red fluorescent protein for cell labeling and lineage analysis in ES cells and mouse embryos.</a> BMC developmental biology. 9, 49-49 (2009).</li><li>Stark, D. A., Kulesa, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vivo+comparison+of+photoactivatable+fluorescent+proteins+in+an+avian+embryo+model.">An in vivo comparison of photoactivatable fluorescent proteins in an avian embryo model.</a> Dev Dyn. 236, 1583-1594 (2007).</li><li>Zhong, T. P., Childs, S., Leu, J. P., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gridlock+signalling+pathway+fashions+the+first+embryonic+artery.">Gridlock signalling pathway fashions the first embryonic artery.</a> Nature. 414, 216-220 (2001).</li><li>Vogeli, K. M., Jin, S. W., Martin, G. R., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+common+progenitor+for+haematopoietic+and+endothelial+lineages+in+the+zebrafish+gastrula.">A common progenitor for haematopoietic and endothelial lineages in the zebrafish gastrula.</a> Nature. 443, 337-339 (2006).</li><li>Clanton, J. A., Shestopalov, I. A., Chen, J. K., Gamse, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+Labeling+of+Zebrafish+Cells+with+Laser+Uncagable+Fluorescein+Dextran.">Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran.</a> J. Vis. Exp. (50), e2672-e2672 (2011).</li><li>Niemz, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laser-Tissue Interactions: Fundamentals and Applications. , (2003).</li><li>Jowett, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+protein+and+gene+expression.">Analysis of protein and gene expression.</a> Methods in cell biology. 59, 63-85 (1999).</li></ol>

Нет конфликта интересов объявлены.

Эта статья описывает универсальный метод для отображения одной судьбой ячейки на основе фотоактивации клетке флуоресцеина-декстрана. Uncaging в клетке флуоресцеина-декстрана в одиночных камерах достигается с помощью двух-фотонного поглощения от фемтосекундных лазерных Mai Tai связан с Zeiss LSM 510 META конфокальной микроскопии. Uncaged флуоресцеина-декстрана в фотоактивированного клетки быстро визуализировать с помощью простой процедуры иммуногистохимии. В этом протоколе двухфотонного поглощения длины волны для фотоактивации клетке флуоресцеина-декстрана составляет 740 нм. Эта длина волны была экспериментально определяется photoactivating клетке флуоресцеина-декстрана вводят эмбрионов дикого типа. Длина волны лазерного возбуждения варьировалась от 600 до 800 нм, а наличие или отсутствие флуоресценции флуоресцеина после активации было качественно определен. Мы обнаружили, что 740 нм произвел сильнейший флуоресцеина сигнал после активации. В идеале, 740 нм должна работать для всехмодельных систем, однако мы рекомендуем тестирования диапазона длин волн для определения оптимального двухфотонного длины волны возбуждения для вашего образца. В клетке флуоресцеина-декстрана вводят дикого типа эмбрионы, для каждой из двух фотонов длины волны возбуждения испытания мы также изменялась средняя мощность лазера. Для длины волны возбуждения 740 нм, средняя мощность лазера 47 МВт производства флуоресцеина сильнее сигнал на активированном области по сравнению к снижению средней мощности лазера. Высшее средней мощности лазерного не производят сильные сигналы флуоресцеина, но абляции тканей. С фемтосекундных лазерных импульсов эффективны при абляции биологической ткани 15, мы рекомендуем определения порога генерации средней мощности для фотоактивации, чтобы избежать аблации ткани. Два-фотонного поглощения происходит в течение небольшого объема взаимодействия. Для обеспечения правильной активации в клетке флуоресцеина-декстран, клетки должны быть приведены в надлежащее внимание. В гоэлектронной выше протокола, GFP-положительных клеток были одновременно отображаемого при дневном свете, чтобы подтвердить фокус ячейки. Таким образом, белый свет приобретения в дополнение к другим каналам является целесообразным. После подтверждения фокус ячейки, наш протокол предлагает увеличение активированных клеток. Коэффициент масштабирования от 50 до 70 Предполагается, однако, эта величина зависит от размера выбранной ячейки. Увеличение масштаба изолирует активированные клетки от соседних клеток, а также ограничивает область сканирования в течение двух-фотонной активации. В идеале, область сканирования должна охватывать большую площадь ячейки. Обнаружение одного активированных клеток требуется, чтобы фоновое окрашивание быть минимальным. В приведенном выше протоколе иммунодетекции важно, что образец их в блокирующем буфере в течение 5 до 6 часов (шаг 4,13). При разработке с NBT / BCIP, Uncaged флуоресцеина-декстран должны стать видимыми в течение 10 до 20 минут. Если фоновое окрашивание сильна, мы предлагаем больше времени блокировки и дополнительной промывки для удаления антитела (шаг 4,17). На рисунках 1 и 2 представлены репрезентативные результаты фотоактивации и иммунодетекции. На рисунке 1, ранним 1 - 2-клетки эмбрионов на стадии дикого типа вводили в клетке флуоресцеина-декстрана. Эмбрионы были подняты до середины сомитогенеза и установлен в низкой температурой плавления агарозы в боковой ориентации. На рисунке 1 (а, б) изобразить светлое и флуоресцентные изображения эмбриона до фотоактивации. Доказательства того, что эмбрион остался Uncaged демонстрирует отсутствие флуоресценции флуоресцеина на рисунке 1 (б). Небольшая область в сомитов была активирована с длиной волны 740 нм в течение 31 секунд использовании средней мощности лазерного из 47 мВт, рисунок 1 (с; стрелка). После активации, двухфотонное uncaging флуоресцеина-декстран произошло как показано на флуоресценции от активированного области, Рисунок 1 (D; стрелка). Активация не сопровождается лазерная абляция, как сомитной ткани остаются нетронутыми, рисунок 1 (с). На рисунке 2 показаны иммунодетекции из Uncaged плавикового<html> escein-декстрана. Небольшая область в латеральной пластинки мезодермы из 10-сомитов эмбрион фотоактивируемые с использованием тех же параметров лазера, как указано на рисунке 1. Эмбрион был поднят и обрабатывается с использованием шагов через 4,1 4,20. Стрелки на рисунке 2 находит регионе активирована, о чем свидетельствует накопление синий осадок. Только активированный расположение четко обнаружено не вмешиваясь фоне окрашивания. Подготовка решения: 1 X PBT (1 л) 100 мл 10 X PBS 2 г BSA 10 мл 20% Tween 10 X PBS (1 л) 80 г NaCl 2 г KCl 6,1 г Na 2 HPO 4 1,9 г KH 2 PO 4 DDH 2 O до 1 л рН до 7,3 4% параформальдегида (160 мл) 32% параформальдегид (два флаконах по 10 мл) 8 мл 20 X PBS 132 мл DDH 2 O jove_content &quot;&gt; AP буфера (50 мл) 1 мл 5 М NaCl 2,5 мл 1 М MgCl 2 5 мл 1 М Трис рН 9,5 250 мкл 20% Tween 41,25 мл DDH 2 O Антитела решение (1 образец) 5,5 мкл порошок Ацетон 40 мкл PBT 0,8 мкл LS 0,1 мкл Anti-флуоресцеина-AP антител 2% LS (360 мкл на 1 образец) 7,2 мкл 100% LS 352,8 мкл PBT 1 X Danieau СМИ (1 л) ‡ 11,6 мл 5 М NaCl 700 мкл 1 М KCl 400 мкл 1 М MgSO 4 600 мкл 1 М Ca (NO 3) 2 5 мл 1 М HEPES DDH 2 O до 1 л рН настроить до 7,6 ‡ Danieau является идеальным решением соли для выращивания эмбрионов данио рерио dechorionated. Другие средства могут использоваться, если они изотонических растворов с проPerly осмолярности (~ 300 мосм для рыбок данио) НБТ складе (1 мл) 50 мг нитротетразол синий 0,7 мл ангидрида диметил формамида 0,3 мл DDH 2 O BCIP складе (1 мл) 50 мг 5-бром-4-хлор-3-индолил фосфат 1 мл ангидрида диметил формамида NBT / BCIP развивающихся решения 1 мл буфера AP 4,5 мкл складе НБТ 3,5 мкл складе BCIP Ацетон порошок <ol><li> Выберите 20 взрослых рыб и заморозить их в жидком азоте. </li><li> Измельчить мороженой рыбы с помощью ступки и пестика в порошок. </li><li> Передача рыбы порошка в 50 мл коническую трубку. </li><li> Заполните коническую трубку с 100% ацетона. Вихревые трубки. </li><li> Спиновые трубки при макс оборотов в минуту в течение 10 мин. Удалите супернатант. </li><li> Вымойте гранул другого 3 раза в 100% ацетоне и вращать трубу при макс оборотов в минуту в течение 10 мин. СиУ последней промывки супернатант должны появиться ясно. </li><li> Добавить 100% ацетона в осадок снова, и пусть трубы выдерживают при комнатной температуре. Более плотные частицы осядут, в то время как более мелкие частицы остаются во взвешенном состоянии. </li><li> Слейте мелких частиц в новую пробирку. Аликвотировать порошок решения на отдельные трубы и хранить их при температуре -20 ° C. </li></ol>

<table border="1"><tbody><tr><th> Название реагента </th><th> Компания </th><th> Номер в каталоге </th></tr><tr><td> CMNB-клетке флуоресцеина SE </td><td> Invitrogen </td><td> C20050 </td></tr><tr><td> 10 кДа Aminodextran </td><td> Invitrogen </td><td> D1860 </td></tr><tr><td> Zeba опреснения Спин колонки </td><td> Проколоть </td><td> 89889 </td></tr><tr><td> Температура плавления агарозы </td><td> Amresco </td><td> 0815-100G </td></tr><tr><td> Борат натрия </td><td> Amresco </td><td> 1131117-100G </td></tr><tr><td> Tricaine метилсульфонат / MS222 </td><td> Исследования Organics </td><td> 1347A </td></tr><tr><td> Anti-флуоресцеина-AP </td><td> Roche </td><td> 11376622 </td></tr><tr><td> Блокировка буфера </td><td> Roche Applied Sciences </td><td> 11 096 176 001 </td></tr><tr><td> Малеиновая кислота </td><td> Сигма </td><td> MO375-500G </td></tr><tr><td> Параформальдегид </td><td> Электрическоепри микроскопии наук </td><td> 15714 </td></tr><tr><td> НБТ </td><td> Сигма </td><td> I8377-250мг </td></tr><tr><td> BCIP </td><td> Фишер Научные </td><td> PI-34040 </td></tr><tr><td> Микроинъектор </td><td> Harvard Apparatus </td><td> PLI-2000 </td></tr><tr><td> LabTek камерных покровного стекла горки </td><td> Nalge Nunc Международного </td><td> 155380 </td></tr><tr><td> Протеиназы K </td><td> Invitrogen </td><td> AM2544 </td></tr><tr><td> Lamb сыворотке </td><td> Invitrogen </td><td> 16070096 </td></tr><tr><td> LSM 510 META НЛО </td><td> Zeiss </td><td></td></tr><tr><td> 20X 0,8 NA Air апохроматических цели </td><td> Zeiss </td><td></td></tr><tr><td> Прозрачный желтый фильтр </td><td> Дом театра Инк </td><td> Roscolux фильтрующего слоя Цвет: 312 </td></tr></tbody></table>

single cell fate mapping in zebrafish

Возможность дифференциально маркировать отдельные клетки имеет важное значение в развитии биологии. Например, в определении того, как гемопоэтических, линий лимфатических и кровеносных сосудов возникают в развивающихся эмбрионах требуется отображение судьбы и линии отслеживания недифференцированных клеток-предшественников. Недавно фотоактивируемых белков, которые включают: 1 Eos, 2, PAmCherry 3, Kaede 4-7, pKindling 8 и 9 KikGR, 10 получили широкий интерес как сотовые отслеживания зондов. Спектр флуоресценции эти светочувствительные белки могут быть легко преобразованы с УФ возбуждении, позволяя популяции клеток следует отличать от соседними. Тем не менее, photoefficiency из активированного протеина может ограничить долгосрочные клетки отслеживания 11. В качестве альтернативы фотоактивируемых белков, в клетке флуоресцеина-декстран широко используется в зародыше модели систем 7, 12-14. Традиционно для флуоресцеина выпускать из клетки-декстран, УФ-возбужденныхрадиоизлучение от флуоресценции доме лампы или одного лазерного УФ-фотонов была использована, однако такие источники ограничивает пространственное разрешение фотоактивации. Здесь мы приводим протокол к судьбе карту, происхождение следа, и обнаружить одно меченых клеток. Отдельные клетки у эмбрионов вводят в клетке флуоресцеина-декстран которые фотоактивируемые с ближнего инфракрасного лазерного импульса производятся из фемтосекундного лазера титана сапфира. Этот лазер является обычным во всех двухфотонного конфокальный микроскоп, таких как META LSM 510 NLO микроскоп, используемые в настоящем документе. С биологической ткани является прозрачным для инфракрасного облучения 15, лазерные импульсы могут быть направлены глубоко внутри эмбриона без uncaging клеток выше или ниже выбранной фокальной плоскости. Таким образом, нелинейный двух-фотонного поглощения индуцируется только на геометрического фокуса выпускать из клетки флуоресцеина-декстрана в одной ячейке. Чтобы обнаружить ячейку, содержащую Uncaged флуоресцеина-декстрана, мы опишем простой протокол от 16 до иммуногистохимии быстро видеотехникативной активированных клеток. Активация и обнаружения протокола представленные в этой статье является универсальным и может быть применен к любой модели системы. Примечание: реагенты, используемые в настоящем протоколе можно найти в таблице, прилагаемой в конце статьи.

Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Fate Mapping in Zebrafish at JoVE.com

Single Cell Fate Mapping in Zebrafish

Метод описан в photoactivate одной клетки, содержащие в клетках флуоресцентного белка с помощью двух-фотонного поглощения от Ti: Sapphire фемтосекундного лазерного генератора. Для судьба карте фотоактивированного клетки, иммуногистохимии используется. Эта техника может быть применена к любому типу клеток.

Одно отображение Судьба сотового у рыбок данио

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, ...

Research

JoVE Journal

Biology

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Трансплантация почки Всего мозга у взрослых данио рерио

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors

Одноклеточный Всасывающая Recordings от фоторецепторов Мышь Конус

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment ...

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

Практический подход к генетического картирования Судьба индуцибельной: Путеводитель по Марку и Трек Клетки В Vivo</em

Fate maps are generated by marking and tracking cells in vivo to determine how progenitors contribute to specific structures and cell types in developing ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Судьба картирование человеческих эмбриональных стволовых клеток на формирование тератома

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

В естественных условиях электропорации Morpholinos в Retina взрослых данио рерио

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

В естественных условиях электропорации Morpholinos в Восстанавливающий взрослых данио рерио хвостового плавника

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Бластомеров эксплантов для тестирования для сотовых приверженности судьбы во время эмбрионального развития

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal  which tissues descend from each cell of the embryo.  Although fate maps ...

Generation of Dispersed Presomitic Mesoderm Cell Cultures for Imaging of the Zebrafish Segmentation Clock in Single Cells

Генерация распределенные пресомитной мезодермы клеточных культур для работы с изображениями данио рерио Сегментация часы в одиночных камерах

Segmentation is a  periodic and sequential morphogenetic process in vertebrates. This rhythmic  formation of blocks of tissue called somites along the ...

Identification of MyoD Interactome Using Tandem Affinity Purification Coupled to Mass Spectrometry

Идентификация MyoD интерактомные Использование Тандем Аффинная очистка В сочетании с масс-спектрометрии

Skeletal muscle terminal differentiation starts with the commitment of pluripotent mesodermal precursor cells to myoblasts. These cells have still the ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

С открытым исходным кодом Анализ Одночастичного для супер-разрешение микроскопии с VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...