Name: isolation of cd133+ liver stem cells for clonal expansion
Uploaded: 2011-10-10T13:00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of CD133+ Liver Stem Cells for Clonal Expansion at JoVE.com

Доктор Раунтри признается текущей поддержке со стороны Детского Чудо сети, Национальный институт здравоохранения, K08DK080928 и R03DK088013 и American Cancer Society исследований Scholar Award, MgO-11651. Доктор Раунтри признает, что эта процедура была первоначально разработана и уточнена в то время как финансируется Программой развития детской Scientist (NICHD гранта K12-HD00850).

<ol>
	<li>Rountree, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CD133-expressing+murine+liver+oval+cell+population+with+bilineage+potential.">A CD133-expressing murine liver oval cell population with bilineage potential.</a> Stem Cells. 25, 2419-2429 (2007).</li><li>Ding, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133++liver+cancer+stem+cells+from+methionine+adenosyl+transferase+1A-deficient+mice+demonstrate+resistance+to+transforming+growth+factor+(TGF)-beta-induced+apoptosis.">CD133+ liver cancer stem cells from methionine adenosyl transferase 1A-deficient mice demonstrate resistance to transforming growth factor (TGF)-beta-induced apoptosis.</a> Hepatology. 49, 1277-1286 (2009).</li><li>Rountree, C. B., Ding, W., He, L., Stiles, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+of+CD133-expressing+liver+cancer+stem+cells+in+liver-specific+phosphatase+and+tensin+homolog+deleted+on+chromosome+10-deleted+mice.">Expansion of CD133-expressing liver cancer stem cells in liver-specific phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10-deleted mice.</a> Stem Cells. 27, 290-299 (2009).</li><li>Rountree, C. B., Senadheera, S., Mato, J. M., Crooks, G. M., Lu, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+of+liver+cancer+stem+cells+during+aging+in+methionine+adenosyltransferase+1A-deficient+mice.">Expansion of liver cancer stem cells during aging in methionine adenosyltransferase 1A-deficient mice.</a> Hepatology. 47, 1288-1297 (2008).</li><li>Michalopoulos, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+regeneration.">Liver regeneration.</a> J. Cell. Physiol. 213, 286-300 (2007).</li><li>Fausto, N., Campbell, J. S., Riehle, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+regeneration.">Liver regeneration.</a> Hepatology. 43, 45-53 (2006).</li><li>Theise, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+Stem+Cells.+III.+Emergent+themes+of+liver+stem+cell+biology:+niche,+quiescence,+self-renewal,+and+plasticity.">Gastrointestinal Stem Cells. III. Emergent themes of liver stem cell biology: niche, quiescence, self-renewal, and plasticity.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 290, 189-193 (2006).</li><li>Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+and+liver+repopulating+capacity+of+murine+oval+cells.">The origin and liver repopulating capacity of murine oval cells.</a> Proc Natl Acad Sci U. S. A. 100, 11881-11888 (2003).</li><li>Greenbaum, L. E., Wells, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+stem+cells+in+liver+repair+and+fibrosis.">The role of stem cells in liver repair and fibrosis.</a> Int. J. Biochem. Cell Biol. 43, 222-229 (2011).</li><li>Choi, S. S., Omenetti, A., Syn, W. K., Diehl, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+Hedgehog+signaling+in+fibrogenic+liver+repair.">The role of Hedgehog signaling in fibrogenic liver repair.</a> Int. J. Biochem. Cell. Biol. 43, 238-244 (2011).</li><li>Khurana, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scopolamine+treatment+and+muscarinic+receptor+subtype-3+gene+ablation+augment+azoxymethane-induced+murine+liver+injury.">Scopolamine treatment and muscarinic receptor subtype-3 gene ablation augment azoxymethane-induced murine liver injury.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 333, 639-649 (2010).</li><li>Sell, S., Leffert, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+cancer+stem+cells.">Liver cancer stem cells.</a> J. Clin. Oncol. 26, 2800-2805 (2008).</li><li>Lee, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+prognostic+subtype+of+human+hepatocellular+carcinoma+derived+from+hepatic+progenitor+cells.">A novel prognostic subtype of human hepatocellular carcinoma derived from hepatic progenitor cells.</a> Nat. Med. 12, 410-416 (2006).</li><li>Sell, S., Dunsford, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+the+stem+cell+origin+of+hepatocellular+carcinoma+and+cholangiocarcinoma.">Evidence for the stem cell origin of hepatocellular carcinoma and cholangiocarcinoma.</a> Am. J. Pathol. 134, 1347-1363 (1989).</li><li>Amin, R., Mishra, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+stem+cells+and+tgf-Beta+in+hepatic+carcinogenesis.">Liver stem cells and tgf-Beta in hepatic carcinogenesis.</a> Gastrointest Cancer Res. 2, 27-30 (2008).</li><li>Tang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progenitor/stem+cells+give+rise+to+liver+cancer+due+to+aberrant+TGF-beta+and+IL-6+signaling.">Progenitor/stem cells give rise to liver cancer due to aberrant TGF-beta and IL-6 signaling.</a> Proc Natl Acad Sci. 105, 2445-2450 (2008).</li><li>Kitisin, K., Pishvaian, M. J., Johnson, L. B., Mishra, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+stem+cells+and+molecular+signaling+pathways+in+hepatocellular+carcinoma.">Liver stem cells and molecular signaling pathways in hepatocellular carcinoma.</a> Gastrointest Cancer Res. 1, 13-21 (2007).</li><li>Rountree, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow+fails+to+differentiate+into+liver+epithelium+during+murine+development+and+regeneration.">Bone marrow fails to differentiate into liver epithelium during murine development and regeneration.</a> Hepatology. 45, 1250-1260 (2007).</li><li>Shimano, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+oval+cells+have+the+side+population+phenotype+defined+by+expression+of+ATP-binding+cassette+transporter+ABCG2/BCRP1.">Hepatic oval cells have the side population phenotype defined by expression of ATP-binding cassette transporter ABCG2/BCRP1.</a> Am J Pathol. 163, 3-9 (2003).</li><li>Suzuki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+isolation+and+clonal+identification+of+self-renewing+bipotent+hepatic+progenitor+cells+in+adult+mouse+liver.">Flow cytometric isolation and clonal identification of self-renewing bipotent hepatic progenitor cells in adult mouse liver.</a> Hepatology. , (2008).</li><li>Suzuki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+identification+and+characterization+of+self-renewing+pluripotent+stem+cells+in+the+developing+liver.">Clonal identification and characterization of self-renewing pluripotent stem cells in the developing liver.</a> J Cell Biol. 156, 173-184 (2002).</li><li>Yamashita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EpCAM-positive+hepatocellular+carcinoma+cells+are+tumor-initiating+cells+with+stem/progenitor+cell+features.">EpCAM-positive hepatocellular carcinoma cells are tumor-initiating cells with stem/progenitor cell features.</a> Gastroenterology. 136, 1012-1024 (2009).</li><li>Yamashita, T., Budhu, A., Forgues, M., Wang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+hepatic+stem+cell+marker+EpCAM+by+Wnt-beta-catenin+signaling+in+hepatocellular+carcinoma.">Activation of hepatic stem cell marker EpCAM by Wnt-beta-catenin signaling in hepatocellular carcinoma.</a> Cancer Res. 67, 10831-10839 (2007).</li><li>Furuyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+cell+supply+from+a+Sox9-expressing+progenitor+zone+in+adult+liver,+exocrine+pancreas+and+intestine.">Continuous cell supply from a Sox9-expressing progenitor zone in adult liver, exocrine pancreas and intestine.</a> Nat Genet. 43, 34-41 (2011).</li><li>Kordes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133++hepatic+stellate+cells+are+progenitor+cells.">CD133+ hepatic stellate cells are progenitor cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 352, 410-417 (2007).</li><li>Berg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+Growth+Factor+10+is+critical+for+liver+growth+during+embryogenesis+and+controls+of+hepatoblast+survival+via+b-catenin+activation.">Fibroblast Growth Factor 10 is critical for liver growth during embryogenesis and controls of hepatoblast survival via b-catenin activation.</a> Hepatology. , (2007).</li><li>Turner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+hepatic+stem+cell+and+maturational+liver+lineage+biology.">Human hepatic stem cell and maturational liver lineage biology.</a> Hepatology. 53, 1035-1045 (2011).</li><li>Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+restriction+of+human+hepatic+stem+cells+to+mature+fates+is+made+efficient+by+tissue-specific+biomatrix+scaffolds.">Lineage restriction of human hepatic stem cells to mature fates is made efficient by tissue-specific biomatrix scaffolds.</a> Hepatology. 53, 293-305 (2011).</li><li>Galicia, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+of+hepatic+tumor+progenitor+cells+in+Pten-null+mice+requires+liver+injury+and+is+reversed+by+loss+of+AKT2.">Expansion of hepatic tumor progenitor cells in Pten-null mice requires liver injury and is reversed by loss of AKT2.</a> Gastroenterology. 139, 2170-2182 (2010).</li><li>Ding, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial-to-mesenchymal+transition+of+murine+liver+tumor+cells+promotes+invasion.">Epithelial-to-mesenchymal transition of murine liver tumor cells promotes invasion.</a> Hepatology. 52, 945-953 (2010).</li></ol>

Доктор Раунтри получает поддержку исследований от фармацевтики Bayer. Доктора. Дин и Crooks и г-жа Данг и г-жа VanKirk не имеют раскрытия информации в отчетности.

В отличие от кроветворной системой, в которой гемопоэтических стволовых клеток несут ответственность за поддержание системы сотовой дифференциации, replacesnormal физиологических оборот лейкоцитов, эритроцитов и тромбоцитов, клеток печени стволовыми или взрослых клеток-предшественников печени, не участвуют в нормальной печени гомеостаза. 5,6 после острого повреждения печени или частичной резекции печени, гепатоциты, как дифференцированный эпителий печени, проходят несколько этапов распространения, чтобы заменить потерянные массы печени. 5,6 Только при хронической травмы являются печень стволовых клеток наблюдалось распространяться. 1,5 -11 Эти взрослые, орган конкретные стволовые клетки предложил дифференцироваться в гепатоциты и как холангиоцитов. 1,5-8 Интересно, что подавляющее большинство рак печени развивается на фоне хронических травм, и, таким образом стволовых клеток печени также предположил, что прекурсоры для подмножества рака печени. 2-4,12-17 Oдной из основных проблем стволовых клеток работе в печени изоляции редких популяций клеток для функционального анализа. Например, подавляющее большинство клеток в гепатоциты печени, которая значительно больше, чем холангиоцитов и другие более мелкие без паренхиматозных клеток. Разбив весь печени в клетки отсеков (большой гепатоцитов - паренхиматозный фракции и более мелкие клетки - не паренхиматозных фракции), и далее выбрав для CD45 негативные клетки (не гемопоэтических клеток), мы можем обогатить начиная популяция стволовых клеток более 600 раз. 1,18-21 Следует отметить, что мы ни в коем случае о том, что CD133 + населения является 100% чистой популяции стволовых клеток, но очевидно, представляет собой гетерогенную популяцию клеток с различными линии и заселение потенциал. Одним из основных ограничений поле определения стволовых клеток и клеток-предшественников. Мы используем термин &quot;стволовая клетка&quot; в более широком плане эта работа, но в строгом определении, CD133 +, не parenchymal клетки представляют собой би-линии предшественников населения. Учитывая нынешнее состояние стволовых и прогениторных исследований в печени, этот доклад не предусматривает отправной точкой для следователей, которые заинтересованы в этой области. Как появляются новые маркеры, такие как EpCAM, 22,23 или транскрипционных факторов, таких как Sox9, 24 они могут быть включены. Например, мы обнаружили довольно высокий уровень перекрытия между EpCAM + клеток и CD133 + клеток. В этом отчете мы подробно процесс стволовых клеток изоляции от нормальной мышиной печени, а также хронического поражения печени моделей, которые демонстрируют увеличение печени стволовых клеток. Этот метод имеет очевидные преимущества по сравнению со стандартными иммуногистохимии замороженных или фиксированных формалином и печени, функциональных исследований с использованием живых клеток могут быть выполнены после изоляции. 1,3,4 конкретная цель этого процесса заключается в изоляции относительно чистой населения печени стволовыми клетками, которые могут клонально быть расширен в пробирке. <p cдевушка = &quot;jove_content&quot;&gt; Основное ограничение для этой процедуры является то, что большинство клеток, выделенных не будет жизнеспособной после проточной цитометрии (см. раздел Поиск и устранение неисправностей). Это результат часов, необходимых для подготовки клеток, и многочисленные процедуры, необходимые для уточнения населения до изоляции. Если печень переваривается в одной клеточной суспензии для немедленного анализа FACS, размер разницы между гепатоцитами и других не-паренхиматозные клетки будут эффективно ворота FACS создание невозможно. Если печень не-паренхиматозные клетки используются, без устранения гемопоэтических клеток, существует риск, что значительное количество CD133 + клеток может быть гемопоэтических происхождения могут загрязнить фракции. Кроме того, при обработке клеток через Miltenyi фильтр, только одно клеток и очень небольшие скопления клеток были собраны. Это гарантирует, что образец не будет забивать FACS иглы потребления. Альтернативы для этой процедуры включают м.odification для любого альтернативного маркера клеточной поверхности, такие как CD49f, EpCAM, или комбинация маркеров, таких как CD133 + + EpCAM второй опубликовала отчет использует градиент плотности, чтобы изолировать стволовые клетки печени от не-паренхиматозные фракции. Эта процедура требует Ultra-центрифуга (8000 мкг), добавляет значительное время процедуры, и по нашему опыту, значительно снижается предварительно FACS сотовой выход и пост-FACS жизнеспособность 8. Дальнейшие эксперименты включают более широкий спектр генного анализа выражений, в том числе плода гены печени, таких как HNF3, HNF4α, и αfp.In того, Вестерн-блоттинга и иммуноцитохимия выраженной белки могут быть использованы для подтверждения RT-PCR результаты клеток в культуре. Один из вопросов, следует отметить, последние работы, которые определены CD133 выражение звездчатых клеток печени 25. Сейчас мы регулярно скрининга наши образцы на маркеры звездчатых клеток (см. раздел Поиск и устранение неисправностей), и не имеют IDentified значительное загрязнение в нашей фракции. Это может быть связано с различными технологиями пищеварения и печени изолятор. 2,3,26 Основываясь на том факте, что большинство клеток не будет жизнеспособной сразу после выделения FACS, мы рекомендуем, чтобы быть покрыты клетками, как и большая часть CD133 + клеток или отдельные клетки, до использования в животных. 5-7 дней в пробирке позволит значительно улучшить результаты анализа опухоли. Кроме того, учитывая суровость одном изоляторе, это должно проводиться только один раз колоний могут быть расширены с объемной CD133 + изолированных клеток. Более подробное обсуждение различных условий культуры и леса белки, которые могут быть использованы для культуры стволовых печень и клетки-предшественники были также характеризуется Lola Рид. Эта работа дает альтернативные условия и модификации, которые исследователи могут включать в свои программы исследований раз основные методы изоляции освоены. 27,28 доктора Рейд пристаА также обеспечивает более детальный анализ биологии происхождение и созревание между печеночной стволовых клеток и совершенные прародителями. С точки зрения опухолей в естественных условиях анализа, мы имели успех, используя недавно изолированных клеток и клеток из клонированных расширен CD133 + клеток в пробирке, в первую очередь использованием 1x10 6 клеток. Мы сосредоточились ontwo генетических штаммов хронического поражения печени, MAT1a - / - и печень конкретных Pten - / - мышей, и мы использовали оба голых мышей и мышей дикого типа в качестве хозяев для роста опухоли. По нашему опыту, CD133 + клеток печени стволовыми только образуют опухолей, если они изолированы от значительного повреждения печени моделей, которые предварительно злокачественные. Обратите внимание, что опухоли образуются из CD133 + клетки имеют как общие гепатоцеллюлярной карциномы и холангиокарцинома особенности, предлагая стволовых клеток или клеток-предшественников происхождения к опухолям. 2-4,29 Последующие работы после опухолей документально включенийде стандартного патологического анализа опухолевых тканей (H &amp; E окрашивание) и иммуногистохимического окрашивания. Кроме того, опухоль может быть фарш переваривается и для FACS анализа или повторного культуры. 2-4,30 В заключение, мы подробно процедуру изоляции, расширение и основных характеристик CD133 + печени стволовыми клетками и CD133 + раковые стволовые клетки. Поиск и устранение неисправностей: CD45 загрязнения: Для шага 3, если есть загрязнения CD45 + клеток, которые могут быть оценены путем добавления CD45-FITC Ab до FACS анализа и изоляции, убедитесь, что CD45 Microbead антитела не истек и что фильтрат собирали только тогда, Фильтр был в магнитном держателе. Любой фильтрата, собранного в то время как фильтр не в магнитный держатель будет содержать CD45 + клеток. Низкое количество клеток: Для неповрежденной печени, общее количесг CD133 + без паренхиматозных изолированные может быть меньше чем 10000. Эти клетки являются редкими в спокойном печени. Для модели хронического поражения, как DDC 0,1% диете, число увеличится до 100.000 значительно клеток. Если общее количество клеток значительно ниже этих цифр, один вопрос, чтобы рассмотреть, является окрашивание FACS Ab. Убедитесь в том, что Ab CD133 не истек, а бедные окрашивания может привести к плохой урожай. Кроме того, мы рекомендуем выполнять FACS анализ печени, не паренхимных клеток для определения относительной населения до попытки FACS изоляции. Низкая жизнеспособность клеток после FACS: Один из вопросов, жизнеспособность может быть связано с тем, как клетки обрабатываются и за какое время. В идеале, вся процедура изоляторе, шаги 1-4, должны проводиться без каких-либо задержек между шагами и завершится в тот же день. Любая значительная задержка между шагами 1-4 позволит значительно сократить жизнеспособность клеток. Второй вопрос связан с сELL жизнеспособности могут быть связаны с оболочкой давления используется для изоляции FACS. Мы рекомендуем использовать оболочку нижнего давления. Наконец, когда клетки выделяют, они должны быть немедленно покрытием, как и любое значительное хранения на льду после сортировки будет также уменьшить жизнеспособность. CD133 + без паренхиматозных неоднородности: Последние отчеты показывают, что звездчатые клетки печени также могут иметь CD133 выражения и есть пластичности 25. Таким образом, в дополнение к проверке би-потенции генов альбумина и Krt19, дополнительная проверка может включать в себя гены, связанные с звездчатых клеток, таких как глиальных фибриллярный кислый белок в покоящихся клеток звездчатого и альфа-актин гладких и десмин в активированных клеток звездчатого. 3,4,26 Кроме того, CD133 + населения представляет собой широкую предшественников населения. Добавление второго маркера, таких как EpCAM, может помочь уточнить населению дальше, и предел неоднородности.

<table border="1"><tbody><tr><th> Название реагента </th><th> Компания </th><th> Номер в каталоге </th><th> Комментарии (по желанию) </th></tr><tr><td> DMEM: F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 10565-018 </td><td> С фенолом красным </td></tr><tr><td> CD45 микрошарики </td><td> Miltenyi </td><td> 130-052-301 </td><td></td></tr><tr><td> Фактор роста гепатоцитов </td><td> Сигма </td><td> H1404 </td><td></td></tr><tr><td> Эпидермального фактора роста </td><td> Сигма </td><td> E4127 </td><td></td></tr><tr><td> ДНКазой </td><td> Сигма </td><td> DN25 </td><td> 1 грамм </td></tr><tr><td> Коллагеназа D </td><td> Roche </td><td> 1088874 </td><td></td></tr><tr><td> Проназа </td><td> Roche </td><td> 0165921 </td><td></td></tr><tr><td> 70 микрон сетчатый фильтр </td><td> Рыбак </td><td> 352350 </td><td></td></tr><tr><td> Omniscript RT </td><td> Quaigen </td><td> 205111 </td><td> 50 реакций </td></tr><tr><td> HotStarTaq </td><td> Quaigen </td><td> 203203 </td><td></td></tr><tr><td> Miltenyi LD колонки </td><td> Miltenyi </td><td> 130-042-901 </td><td></td></tr><tr><td> CD133-PE FACS Ab </td><td> eBioscience </td><td> 12-1331-82 </td><td></td></tr><tr><td> Ламинин покрытие пластин </td><td> BD </td><td> 354410 </td><td> 96-луночные </td></tr><tr><td> Трипсин 0,05% ЭДТА </td><td> Invitrogen </td><td> 25300-354 </td><td> 100 мл </td></tr><tr><td> RNeasy Micro Kit </td><td> Quaigen </td><td> 74004 </td><td> 50 столбцов для 5x10 5 клеток или менее </td></tr><tr><td> Фарм Lyse </td><td> BD </td><td> 555899 </td><td> 10X концентрации </td></tr></tbody></table>

isolation of cd133+ liver stem cells for clonal expansion

Печень стволовых клеток, или овальные клетки, размножаются при хроническом поражении печени, и предложил дифференцироваться в гепатоциты и как холангиоцитов. Кроме того, стволовых клеток печени предположили, что предшественниками для подмножества рака печени, гепатоцеллюлярной карциномы. Одной из основных проблем в стволовые клетки произведения в любой твердый орган, как печень является выделение редких популяции клеток для детального анализа. Например, подавляющее большинство клеток в печени, гепатоциты (паренхиматозные фракции), который значительно больше, чем не-паренхиматозные клетки. По обогащения специфический клеточный отсеков печени (например, паренхиматозные и не паренхиматозных фракции), и выбрав для CD45 негативные клетки, мы можем обогатить начиная популяция стволовых клеток более чем 600-fold.The proceduresdetailed в этом отчет позволяет относительно редкие популяции клеток из твердого органа должны быть отсортированы эффективно. Этот процесс может быть использован для isolateliверсия стволовых клеток из нормальных мышиных печени, а также хронического поражения печени моделей, которые демонстрируют увеличение печени стволовых клеток. Этот метод имеет очевидные преимущества по сравнению со стандартными иммуногистохимии замороженных или фиксированных формалином и печени, функциональных исследований с использованием живых клеток может быть выполнено после первого совместного локализации экспериментов. Для выполнения процедуры, описанной в настоящем докладе, рабочие отношения с исследования на основе проточной цитометрии основной настоятельно рекомендуется, так как данные изоляции FACS сильно зависят от специализированных приборов и сильное знание основных проточной цитометрии процедур. Конкретная цель этого процесса заключается в изоляции населения печени стволовыми клетками, которые могут быть расширены клонально в пробирке.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of CD133+ Liver Stem Cells for Clonal Expansion at JoVE.com

Isolation of CD133+ Liver Stem Cells for Clonal Expansion

Здесь мы описываем изоляции CD133 выражения печени стволовые клетки и раковые стволовые клетки из мышиных целом печени, процесс, который требует тканей пищеварения, клетки обогащения и изоляции проточной цитометрии. Мы включать методы для продвинутых одном изоляторе и клональной экспансии.

Выделение CD133 + печень стволовых клеток для клональной экспансии

Liver stem cell, or oval cells, proliferate during chronic liver injury, and are proposed to differentiate into both hepatocytes and cholangiocytes. In ...

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells HSCs

Выделение и трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (ГСК)

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

Выделение и расширение добычи взрослых человеческих эндотелиальных клеток, образующих колонии Прародитель

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells (ECFCs)

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells MSCs and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells ECFCs

Выделение и животных Сыворотка свободного расширения прав пуповины производных мезенхимальных стромальных клеток (МСК) и эндотелиальных колонии Формирование клеток-предшественников (ECFCs)

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

Выделение и Вывод мышиных эмбриональных зародышевых клеток

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Isolation of Stem Cells from Human Pancreatic Cancer Xenografts

Выделение стволовых клеток из прав ксенотрансплантаты рака поджелудочной железы

Cancer stem cells (CSCs) have been identified in a growing number of malignancies and are functionally defined by their ability to undergo self-renewal ...

Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells

Выделение мышью слюнных желез стволовых клеток

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Выделение и культура Индивидуальные мышечных волокон и их сателлитные клетки от взрослых скелетных мышц

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

Na&#239;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

Наивные стволовых клеток взрослых Изоляция от первичных человеческих культурах фибробластов

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Индукционные и анализ эпителиальных к мезенхимальных перехода

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Isolation, Culture, and Transplantation of Muscle Satellite Cells

Изоляция, культура, и трансплантация мышечных сателлитных клеток

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal ...