Name: purification of hsp104, a protein disaggregase
Uploaded: 2011-09-30T13:00:00
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Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium des NIH (5T32GM008275-22) und ein American Heart Association Promotionsstipendium (EAS) unterstützt, ein Chemie-Biologie-Schnittstelle Stipendium der NIH (2T32GM071339-06A1) (zu MED) und Zuschüsse aus dem NIH (1DP2OD002177-01 und NS067354-0110), Die Ellison Medical Foundation und The Bill and Melinda Gates Foundation (JS).

1. Expression von Hsp104 <ol><li> Das Plasmid für die Reinigung in E. beschäftigt coli, pPROEX-HTB-Hsp104 enthält die Hsp104 offene Leserahmen unter der induzierbaren Kontrolle des trc-Promotors 26. Das Plasmid produziert Hsp104 mit einem N-terminalen His 6-Tag, das durch TEV-Protease-Spaltung entfernt werden können. Transform pPROEX-HTB-Hsp104 in Codon-optimierten E. coli BL21-CodonPlus-RIL Zellen (Stratagene, Agilent Technologies) mit einer typischen bakt...

Timeline: Für maximal Hsp104 Aktivität empfehlen wir, dass die gesamte Reinigungsschema so schnell wie möglich abgeschlossen werden. Allerdings macht die Zahl der Reinigungsschritte ein anspruchsvoller Zeitplan, der vielleicht nicht immer praktisch. Wenn die Reinigung Schritte werden so schnell wie möglich durchgeführt werden, die Zeit zwischen dem Ende der Nacht Ausdruck durch die 2-4 Stunden Inkubation bei 30 ° C mit TEV-Protease beträgt ca. 9-11 Stunden. Ein möglicher Ort zum Verweilen ist nach der TEV...

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th></tr><tr><td> BL21-CodonPlus-RIL kompetenter Zellen </td><td> Stratagene, Agilent Technologies </td><td> 230255 </td></tr><tr><td> 2xYT Brühe </td><td> USB </td><td> 75864 </td></tr><tr><td> Complete, Mini, EDTA-free Protease-Inhibitor Tabletten </td><td> Roche </td><td> 1836170 </td></tr><tr><td> Pepstatin A </td><td> Sigma </td><td> P4265 </td></tr><tr><td> Ni-Sepharose 6 Fast Flow </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-5318-02 </td></tr><tr><td> Amicon Ultra-15 Zentrifugalfilter Einheiten (MWCO 30.000) </td><td> Millipore </td><td> UFC903008 </td></tr><tr><td> Resource Q - 6ml Spalte </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-1179-01 </td></tr><tr><td> Protev Protease </td><td> Promega </td><td> V6052 </td></tr><tr><td> AcTEV Protease </td><td> Invitrogen </td><td> 12575015 </td></tr><tr><td> Superose 6 10 / 300 GL </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-5172-01 </td></tr><tr><td> Hsp40 </td><td> Assay Designs </td><td> SPP-400 </td></tr><tr><td> Hsp72 </td><td> Assay Designs </td><td> ADI-NSP-555 </td></tr></tbody></table>

purification of hsp104, a protein disaggregase

Hsp104 ist ein hexameren AAA + protein 1 aus Hefe, die Paare ATP-Hydrolyse, um Protein Aufschlüsselung 2-10 (Abb. 1). Diese Aktivität vermittelt zwei wichtige selektive Vorteile. Erstens ermöglicht Renaturierung ungeordnete Aggregate von Hsp104 Hefe Überleben nach verschiedenen Protein-Fehlfaltung betont, einschließlich Hitzeschock 3,5,11,12. Zweitens ermöglicht die Umgestaltung des Cross-Beta-Amyloid-Fibrillen durch Hsp104 Hefe unzähligen Prionen (infektiöse Amyloide) als ein Reservoir von Vorteil zu nutzen und vererbbare phänotypische Variation 13-22. Bemerkenswert ist, dass Hsp104 direkt umbaut preamyloid Oligomere und Amyloidfibrillen, einschließlich derjenigen der Hefe Prion-Proteine ​​Sup35 und Ure2 23-30 zusammen. Das Amyloid-Umbau-Funktionalität ist ein spezialisierter Facette der Hefe Hsp104. Die E. coli Ortholog, ClpB, nicht umgestalten preamyloid Oligomere oder Amyloid-Fibrillen 26,31,32. Hsp104 Orthologe sind in allen Reichen des Lebens außer, verblüffend, Tiere gefunden. In der Tat, ob tierische Zellen keine enzymatische System besitzen, dass Paare Protein Aufschlüsselung nach Renaturierung (statt Abbau) bleibt unbekannt 33-35. So haben wir und andere vorgeschlagen, dass Hsp104 als Therapeutikum für verschiedene neurodegenerative Erkrankungen, die mit der Fehlfaltung von spezifischen Proteinen in toxische preamyloid Oligomere und Amyloidfibrillen 4,7,23,36-38 verbunden entwickelt werden könnten. Es gibt keine Behandlungen, die direkt auf den aggregierten Spezies mit diesen Erkrankungen assoziiert. Doch löst sich Hsp104 toxischen Oligomere und Amyloidfibrillen von Alpha-Synuclein, die mit Morbus Parkinson 23 sowie Amyloid Formen von PrP 39 verbunden zusammengesetzt sind. Wichtig ist, reduziert Hsp104 Proteinaggregation und verbessert Neurodegeneration in Nagermodellen der Parkinson-Krankheit 23 und Huntington-Krankheit 38. Idealerweise auf die Therapie zu optimieren und die Nebenwirkungen minimieren, wäre Hsp104 entwickelt und werden verstärkt gezielt umzugestalten spezifische Aggregate von zentraler Bedeutung für die betreffende Krankheit 4,7. Doch die begrenzte strukturelle und mechanistische Verständnis davon, wie Hsp104 disaggregiert ein so vielfältiges Repertoire von aggregierten Strukturen und verwandte Proteine ​​frustriert diese Bemühungen 30,40-42. Um zu verstehen, die Struktur und den Mechanismus der Hsp104, ist es wichtig, die reine Protein-und rekonstruieren ihre disaggregase Aktivität mit minimalen Komponenten zu untersuchen. Hsp104 ist ein 102kDa Protein mit einem pI von ca. 5,3, die in Gegenwart von ADP oder ATP oder bei hohen Proteinkonzentrationen in Abwesenheit von Nukleotid 43-46 hexamerizes. Hier beschreiben wir ein optimiertes Protokoll für die Reinigung von hoch aktiven, stabilen Hsp104 von E. coli. Die Verwendung von E. coli ermöglicht eine vereinfachte Großproduktion und unsere Methode kann schnell und zuverlässig für zahlreiche Hsp104 Varianten durchgeführt werden. Unser Protokoll erhöht Hsp104 Reinheit und vereinfacht His 6-tag Entfernung im Vergleich zu einer früheren Reinigungsverfahren aus E. coli 47. Darüber hinaus ist unser Protokoll mehr einfache und bequemer als zwei neuere Protokolle 26,48.

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Purification of Hsp104, a Protein Disaggregase

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Reinigung von hochaktiven Hsp104, ein hexameren AAA +-Protein aus Hefe, die Paare ATP-Hydrolyse, um Protein Disaggregation. Dieses Schema nutzt eine His6-markierten Konstruktes zur Affinitätsreinigung von<em&gt; E. coli</em&gt; Durch Anionenaustausch-Chromatographie, His6-tag-Entfernung mit TEV-Protease und Größenausschlusschromatographie gefolgt.

Reinigung von Hsp104, ein Protein Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key ...

Research

JoVE Journal

Biology

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Färbung von Proteinen in Gelen mit Coomassie G-250 ohne organische Lösungsmittel und Essigsäure

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Forschung

Biologie

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&Delta;41

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamAÃƒÅ½Ã¢â‚¬Â41

Die Reinigung des M. magneticum Stamm AMB-1 Magnetosom assoziierten Protein MamAΔ41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is ...

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Expression, Waschmittel Solubilisierung und Reinigung von einer Membran Transporter, der MexB Multidrug Resistance Protein

Multidrug resistance (MDR), the ability of a cancer cell or pathogen to be resistant to a wide range of structurally and functionally unrelated ...

Automated Hydrophobic Interaction Chromatography Column Selection for Use in Protein Purification

Automatisierte Hydrophobe Interaktions-Chromatographie Spaltenauswahl für den Einsatz in Protein Purification

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Chromatographische Reinigung von hoch aktiven Hefe Ribosomen

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Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Orthogonal Protein Purification von einer kleinen Bispezifische Affinity Tag Facilitated

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