Name: purification of hsp104, a protein disaggregase
Uploaded: 2011-09-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification of Hsp104, a Protein Disaggregase at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענק מ-NIH (5T32GM008275-22) ואת הלב האגודה האמריקאית מענק predoctoral (עד EAS), כימיה, ביולוגיה ממשק אחוות מ-NIH (2T32GM071339-06A1) (על MED); ומענקים מן NIH (1DP2OD002177-01 ו-NS067354 0110), אליסון רפואי הקרן, ואת ביל ומלינדה גייטס (ל JS).

1. הביטוי של Hsp104 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפלסמיד המועסקים לטיהור ב E. coli, pPROEX-HTb-Hsp104, מכיל את Hsp104 לפתוח קריאת מסגרת בשליטת ועין מתנהלת של האמרגן TRC 26. הפלסמיד מייצר Hsp104 עם תג 6-N-מסוף שלו כי ניתן להסיר על ידי מחשוף פרוטאז TeV. המר...

ציר הזמן: עבור פעילות Hsp104 מקסימלי אנו ממליצים על ערכת טיהור כולו יושלם במהירות האפשרית. עם זאת, את מספר הצעדים טיהור הופך לוח זמנים תובעני כי לא תמיד מעשית. אם הפעולות לטיהור מתבצעות מהר ככל האפשר, את הזמן מסוף ביטוי לילה ועד 2-4 שעות של דגירה על 30 מעלות צלזיוס עם TeV פ?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th></tr><tr><td> BL21-CodonPlus-RIL תאים המוסמכת </td><td> Stratagene, Agilent Technologies </td><td> 230255 </td></tr><tr><td> 2XYT מרק </td><td> USB </td><td> 75864 </td></tr><tr><td> השלם, מיני, EDTA ללא מעכבי פרוטאז טבליות </td><td> רוש </td><td> 1836170 </td></tr><tr><td> Pepstatin </td><td> סיגמא </td><td> P4265 </td></tr><tr><td> Ni-Sepharose 6 Fast Flow </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-5318-02 </td></tr><tr><td> Amicon Ultra-15 יחידות מסנן צנטריפוגלי (MWCO 30000) </td><td> Millipore </td><td> UFC903008 </td></tr><tr><td> משאבים ש - טור 6ml </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-1179-01 </td></tr><tr><td> proTEV פרוטאז </td><td> Promega </td><td> V6052 </td></tr><tr><td> AcTEV פרוטאז </td><td> Invitrogen </td><td> 12575015 </td></tr><tr><td> Superose 6 10/300 GL </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-5172-01 </td></tr><tr><td> Hsp40 </td><td> Assay עיצובים </td><td> SPP-400 </td></tr><tr><td> Hsp72 </td><td> Assay עיצובים </td><td> ADI-NSP-555 </td></tr></tbody></table>

purification of hsp104, a protein disaggregase

Hsp104 הוא hexameric AAA + חלבון 1 של שמרים, אשר זוגות הידרוליזה ATP לחלבון disaggregation 20-10 (איור 1). פעילות זו מקנה שני יתרונות מרכזיים סלקטיבית. ראשית, renaturation של אגרגטים מופרעת על ידי Hsp104 מסמיך הישרדות שמרים לאחר חלבונים misfolding מדגיש שונים, כולל הלם חום 3,5,11,12. שנית, שיפוץ צולבות סיבי עמילואיד ביתא על ידי Hsp104 מאפשרת שמרים לנצל פריונים עצום (amyloids זיהומיות) כמאגר של מועיל תורשתי וריאציה פנוטיפי 13-22. למרבה הפלא, Hsp104 ישירות remodels oligomers preamyloid ו סיבי עמילואיד, כולל אלה מורכבת של חלבונים הפריון שמרים Sup35 ו Ure2 23-30. פונקציונליות זו עמילואיד שיפוץ הוא פן מיוחד של שמרים Hsp104. E. orthologue coli, ClpB, נכשל preamyloid oligomers לשפץ או סיבי עמילואיד 26,31,32. Orthologues Hsp104 נמצאים בכל ממלכות החיים חוץ, להביך, בעלי חיים. ואכן, אם תאים חיים בעלי כל המערכת האנזימטית שזוגות disaggregation חלבון renaturation (ולא השפלה) נשאר 33-35 ידוע. לפיכך, אנו ואחרים הציעו Hsp104 עשוי להיות מפותח כסוכן הטיפולי למחלות ניווניות שונות הקשורות misfolding של חלבונים ספציפיים לתוך oligomers preamyloid רעילים סיבי עמילואיד 4,7,23,36-38. אין טיפולים ישירות ליעד מינים מצטברים הקשורים למחלות אלה. עם זאת, Hsp104 מתמוסס oligomers רעילים סיבי עמילואיד מורכב אלפא synuclein, אשר מחוברים עם מחלת פרקינסון 23, כמו גם צורות של PRP עמילואיד 39. חשוב לציין, Hsp104 מפחית הצטברות חלבון מקילה ניוון מוחיים מכרסמים במודלים של מחלת פרקינסון 23 ו - 38 מחלת הנטינגטון. באופן אידיאלי, כדי לייעל את הטיפול ולמזער את תופעות הלוואי, Hsp104 יהיה מהונדסים potentiated סלקטיבי לשפץ אגרגטים ספציפי מרכזי המחלה שאלה 4,7. עם זאת, הבנה מבניים מכניסטית מוגבל של כמה Hsp104 disaggregates כזה רפרטואר מגוון של מבנים מצטברים חלבונים שאינם קשורים מתסכל אלה במאמצים 30,40-42. כדי להבין את המבנה ואת מנגנון של Hsp104, חיוני ללמוד את חלבון טהור מחדש פעילות disaggregase שלה עם רכיבים מינימליים. Hsp104 הוא חלבון 102kDa עם לצרכן של 5.3 ~, אשר hexamerizes בנוכחות ADP או ה-ATP, או בריכוזים בחלבונים בהעדר 43-46 נוקלאוטידים. כאן אנו מתארים פרוטוקול אופטימיזציה עבור טיהור של פעיל ביותר, Hsp104 יציב מ E. coli. השימוש E. coli מאפשר פשוטה בקנה מידה גדול ייצור השיטה שלנו יכולה להתבצע במהירות ובאופן אמין עבור Hsp104 וריאנטים רבים. פרוטוקול שלנו מגדילה Hsp104 טוהר מפשט הסרת 6-התג שלו לעומת שיטת טיהור הקודם מתוך ה coli 47. יתר על כן, פרוטוקול שלנו הוא קליל ונוח יותר מאשר שני הפרוטוקולים מאוחרים יותר 26,48.

Watch this Scientific Journal Video about Purification of Hsp104, a Protein Disaggregase at JoVE.com

Purification of Hsp104, a Protein Disaggregase

כאן אנו מתארים פרוטוקול לטיהור מאוד פעיל Hsp104, AAA hexameric + חלבון מן שמרים, אשר זוגות הידרוליזה ל-ATP disaggregation חלבון. תכנית זו מנצל לבנות His6-tagged לטיהור זיקה בין<em&gt; א coli</em&gt; ואחריו אניון מטבע כרומטוגרפיה, His6, תג עם הסרת פרוטאז TeV, וגודל-הדרה כרומטוגרפיה.

טיהור Hsp104, Disaggregase חלבון

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key ...

Research

JoVE Journal

Biology

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

הכתמה של חלבונים עם ג&#39;ל Coomassie G-250 ללא חומצה אצטית ממס אורגני

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&Delta;41

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamAÃƒÅ½Ã¢â‚¬Â41

טיהור של מ magneticum מסננים השגריר-1 Magnetosome חלבון Associated MamAΔ41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is ...

Expression, Detergent Solubilization, and Purification of a Membrane Transporter, the MexB Multidrug Resistance Protein

הביטוי, solubilization דטרגנט, ועל טיהור Transporter ממברנה, חלבון ההתנגדות MexB Multidrug

Multidrug resistance (MDR), the ability of a cancer cell or pathogen to be resistant to a wide range of structurally and functionally unrelated ...

Automated Hydrophobic Interaction Chromatography Column Selection for Use in Protein Purification

הידרופובי אוטומטי אינטראקציה כרומטוגרפיה טור בחירה עבור שימוש ב טיהור חלבון

In contrast to other chromatographic methods for purifying proteins (e.g. gel filtration, affinity, and ion exchange), hydrophobic interaction ...

Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

טיהור chromatographic של הריבוזומים שמרים מאוד פעיל

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers.  ...

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

חלבון טיהור אורתוגונלית בהנחיית תג זיקה קטנים Bispecific

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

זיהוי שותפים חלבון אינטראקציה באמצעות טיהור טנדם זיקה

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

Generation, Purification, and Characterization of Cell-invasive DISC1 Protein Species

דור, טיהור, ואפיון של מיני חלבון DISC1 הסלולריים פולשניים

Protein aggregation is seen as a general hallmark of chronic, degenerative brain conditions like, for example, in the neurodegenerative diseases ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

שיטה ללא טיהור חלבונים של קביעת זיקה מחייבת ידי thermophoresis Microscale

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

זיהוי אינטראקציה בין חלבונים ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; ראשי מבוגרים טנדם זיקה טיהור (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...