Name: purification of hsp104, a protein disaggregase
Uploaded: 2011-09-30T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification of Hsp104, a Protein Disaggregase at JoVE.com

Detta arbete stöddes av ett bidrag från NIH (5T32GM008275-22) och en American Heart Association predoctoral gemenskap (till EAS), en kemi-biologi Interface stipendium från NIH (2T32GM071339-06A1) (till MED), och bidrag från NIH (1DP2OD002177-01 och NS067354-0110), The Ellison Medical Foundation och Bill and Melinda Gates Foundation (till JS).

1. Redovisning av Hsp104 <ol><li> Den plasmid som används för rening i E. coli, pPROEX-HTB-Hsp104 innehåller Hsp104 öppen läsram under inducerbara kontroll av TRC promotor 26. Den plasmid producerar Hsp104 med en N-terminal Hans 6-tagg som kan tas bort genom TEV proteas klyvning. Förvandla pPROEX-HTB-Hsp104 i kodon-optimerade E. coli BL21-CodonPlus-RIL celler (Stratagene, Agilent Technologies) med en typisk bakteriell omvandling förfarande (t.ex. enligt tillverka...

Tidslinje: För maximal Hsp104 aktivitet rekommenderar vi att hela reningen systemet slutföras så snabbt som möjligt. Gör dock att antalet reningssteg ett krävande schema som inte alltid praktiskt. Om reningssteg genomförs så snabbt som möjligt, tiden från slutet av natten uttryck genom till 2-4 timmars inkubation vid 30 ° C med TEV proteas är cirka 9-11 timmar. En möjlig plats att pausa följer TEV klyvning steg. Om det är absolut nödvändigt kan Hsp104 vara knäppa frysas efter detta steg som besk...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reagensets namn </th><th> Företag </th><th> Katalognummer </th></tr><tr><td> BL21-CodonPlus-RIL behöriga celler </td><td> Stratagene, Agilent Technologies </td><td> 230.255 </td></tr><tr><td> 2XYT buljong </td><td> USB </td><td> 75.864 </td></tr><tr><td> Komplett, mini, EDTA-fri proteashämmare tabletter </td><td> Roche </td><td> 1836170 </td></tr><tr><td> Pepstatin A </td><td> Sigma </td><td> P4265 </td></tr><tr><td> Ni-Sepharose 6 Snabbt flöde </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-5318-02 </td></tr><tr><td> Amicon Ultra-15 centrifugal filter enheter (MWCO 30.000) </td><td> Millipore </td><td> UFC903008 </td></tr><tr><td> Resurs Q - 6 ml kolumnen </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-1179-01 </td></tr><tr><td> proTEV Protease </td><td> Promega </td><td> V6052 </td></tr><tr><td> AcTEV Protease </td><td> Invitrogen </td><td> 12575015 </td></tr><tr><td> Superose 6 10/300 GL </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-5172-01 </td></tr><tr><td> Hsp40 </td><td> Analys Designs </td><td> SPP-400 </td></tr><tr><td> Hsp72 </td><td> Analys Designs </td><td> ADI-NSP-555 </td></tr></tbody></table>

purification of hsp104, a protein disaggregase

Hsp104 är en hexameric AAA + protein 1 från jäst, vilket par ATP hydrolys till protein uppdelning 20-10 (bild 1). Denna verksamhet tillför två viktiga selektiva fördelar. Först ger Återställande av oordnade aggregat efter Hsp104 jäst överlevnaden efter olika protein-misfolding påkänningar, inbegripet heat shock 3,5,11,12. För det andra möjliggör ombyggnad av kors-beta amyloidfibrerna av Hsp104 jäst att utnyttja myriad prioner (smittsamma amyloid) som en reservoar av nyttiga och ärftlig fenotypisk variation 13-22. Anmärkningsvärt, remodels Hsp104 direkt preamyloid oligomerer och fibriller amyloid, inklusive de består av proteiner jäst prioner Sup35 och Ure2 23-30. Detta amyloid-remodeling funktionalitet är en specialiserad aspekt av jäst Hsp104. E. coli orthologue, ClpB, underlåter att oligomerer omskapa preamyloid eller fibriller amyloid 26,31,32. Hsp104 orthologues finns i alla riken i livet utom perplexingly, djur. I själva verket, om djurceller har någon enzymatisk system som par protein uppdelning till Återställande (i stället för nedbrytning) är okänd 33-35. Därför har vi och andra föreslagit att Hsp104 kan utvecklas som ett terapeutiskt medel för olika neurodegenerativa sjukdomar i samband med misfolding av specifika proteiner i giftiga preamyloid oligomerer och fibriller amyloid 4,7,23,36-38. Det finns inga behandlingar som inriktas direkt på den aggregerade arter i samband med dessa sjukdomar. Ändå löser Hsp104 toxiska oligomerer och fibriller amyloid som består av alfa-synuklein, som har samband med Parkinsons sjukdom 23 liksom former amyloid av PrP 39. Viktigt minskar Hsp104 proteinaggregering och ameliorates neurodegeneration i gnagarmodeller av Parkinsons sjukdom 23 och Huntingtons sjukdom 38. Helst för att optimera behandlingen och minimera biverkningar, skulle Hsp104 vara konstruerad och förstärkas för att selektivt omforma särskilda aggregat central för sjukdomen i fråga 4,7. Men den begränsade strukturella och mekanistiska förståelsen för hur Hsp104 disaggregates en så mångfacetterad repertoar av aggregerade strukturer och oberoende proteiner hämmar dessa strävanden 30,40-42. För att förstå struktur och mekanism Hsp104 är det viktigt att studera rent protein och rekonstruera dess disaggregase aktivitet med minimal komponenter. Hsp104 är en 102kDa protein med en PI på ~ 5,3, vilket hexamerizes i närvaro av ADP och ATP, eller vid hög proteinhalt koncentrationer i avsaknad av nukleotid 43-46. Här beskriver vi ett optimerat protokoll för rening av mycket aktiva, stabila Hsp104 från E. coli. Användningen av E. coli kan förenklas storskalig produktion och vår metod kan utföras snabbt och tillförlitligt för många Hsp104 varianter. Vår protokoll ökar Hsp104 renhet och förenklar Hans 6-tagg bort jämfört med en tidigare reningsmetod från E. coli 47. Dessutom är våra protokoll mer lättvindigt och bekvämt än två nyare protokollen 26,48.

Watch this Scientific Journal Video about Purification of Hsp104, a Protein Disaggregase at JoVE.com

Purification of Hsp104, a Protein Disaggregase

Här beskriver vi ett protokoll för rening av mycket aktiva Hsp104, en hexameric AAA + protein från jäst, vilket par ATP hydrolys till protein uppdelning. Detta system utnyttjar en His6-märkta bygga för affinitet rening från<em&gt; E. coli</em&gt; Följt av anjon-utbyte kromatografi, His6-tagg borttagning med TEV proteas, och storlek-utanförskap kromatografi.

Rening av Hsp104, ett protein Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key ...

Research

JoVE Journal

Biology

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

Färgning av proteinerna i geler med Coomassie G-250 utan organiska lösningsmedel och ättiksyra

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&Delta;41

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamAÃƒÅ½Ã¢â‚¬Â41

Rening av M. magneticum Sila AMB-1 Magnetosome Medverkande Protein MamAΔ41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is ...

Expression, Detergent Solubilization, and Purification of a Membrane Transporter, the MexB Multidrug Resistance Protein

Expression, tvättmedel Lösningsgörande, och rening av ett membran transportören, MexB multidrogresistensgenen Protein

Multidrug resistance (MDR), the ability of a cancer cell or pathogen to be resistant to a wide range of structurally and functionally unrelated ...

Automated Hydrophobic Interaction Chromatography Column Selection for Use in Protein Purification

Automatiserad Hydrofob Interaktion kromatografikolonn val för användning i Protein Purification

In contrast to other chromatographic methods for purifying proteins (e.g. gel filtration, affinity, and ion exchange), hydrophobic interaction ...

Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

Kromatografiska Rening av högaktiv Jäst Ribosomer

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers.  ...

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Ortogonal proteinrening underlättas av en liten Bispecific Affinity Tagg

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

Identifiering av Protein Samverkande Partners Använda Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

Generation, Purification, and Characterization of Cell-invasive DISC1 Protein Species

Generation, rening och karakterisering av Cell-invasiva arter DISC1 Protein

Protein aggregation is seen as a general hallmark of chronic, degenerative brain conditions like, for example, in the neurodegenerative diseases ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Protein Purification-fri Metod för bindningsaffinitet Bestämning genom Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

Identifiera protein-proteininteraktion i<em&gt; Drosophila</em&gt; Vuxen Heads av Tandem Affinity Purification (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...