Name: imaging leukocyte adhesion to the vascular endothelium at high intraluminal pressure
Uploaded: 2011-08-23T12:00:00
Duration: 6 min 20 s
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इस अध्ययन में भाग विक्टोरियन है सरकार OIS कार्यक्रम, राष्ट्रीय स्वास्थ्य और ऑस्ट्रेलिया कार्यक्रम और परियोजना अनुदान के चिकित्सा अनुसंधान परिषद (JPF ठोकरें - चिन) और स्नातकोत्तर छात्रवृत्ति (डी मिचेल) द्वारा समर्थित किया गया था.

1. मन्या धमनियों को अलग <ol><li> Euthanase10 सप्ताह सीओ 2 / O 2 asphyxiation के माध्यम से पुराने Sprague Dawley चूहों. </li><li> आबकारी महाधमनी और दिल के साथ छोड़ दिया और सही आम मन्या धमनियों वाहिकाओं के न्यूनतम खींच सुनिश्चित करने. </li><li> अलग बर्फ ठंड क्रेब्स बफर के महाधमनी और दिल से मन्या धमनियों और करीब विच्छेदन प्रदर्शन. </li><li> बर्फ पर बढ़ते पहले क्रेब्स में पृथक वाहिकाओं रखें. </li></ol> लगभग. समय = 45 मिनट 2. भड़काना पोत कक्ष <ol><li> बफर के माध्यम से 37 डिग्री सेल्सियस, पोत चैम्बर फ्लश क्रेब्स बफर carbogen गैस (5% सीओ 2 के 95% 2 हे) infusing द्वारा शारीरिक पीएच पर बनाए रखा के प्रॉक्सिमल और डिस्टल connectors कम </li><li> सुनिश्चित टयूबिंग और cannulas पूरी तरह से प्लावित कर रहे हैं और गठबंधन. </li><li> P1 (प्रॉक्सिमल) और p2 transducers (डिस्टल) के माध्यम से Kreb बफर फ्लश. बंद करने के लिए transducers में कोई हवाई बुलबुले सुनिश्चित नल. </li><li> इसी connectors के लिए transducers कनेक्ट और फिर से अधिक क्रेब्स कोई हवाई बुलबुले को सुनिश्चित करने के बफर फ्लश. चैम्बर के लिए बंद नल. </li></ol> लगभग. समय = 15 मिनट 3. पोत कक्ष दबाव <ol><li> दबाव उपकरणों पर मुड़ें: दबाव सहायक, प्रेशर मॉनीटर, क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप (चित्रा 1). </li><li> 20 (1 पर डायल) mmHg, कोई हवाई बुलबुले सुनिश्चित करने पर टयूबिंग के माध्यम से दबाव और स्वत: चलाने के क्रेब्स बफर पर दबाव इमदादी पर क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप के साथ. </li><li> बंद P2 transducer के लिए टयूबिंग कनेक्ट. दबाव स्थिर हो जाएगा. </li><li> पोत चैम्बर P2 नल खोलने के लिए बाहर फ्लश किसी भी बुलबुले को फिर से बंद है. </li><li> क्रेब्स बफर (- 7 एमएल 5) के साथ स्नान भरें. </li></ol> लगभग. समय = 10 मिनट 4. पोत बढ़ते <ol><li> प्रत्येक प्रवेशनी पर एक विदारक माइक्रोस्कोप जगह काले पॉलिएस्टर संबंधों (चित्रा 2) के तहत. </li><li> Cannulas और प्रवेशनी धारकों के अलावा ले जाएँ और माउंट ¼ पोत पर P1 प्रवेशनी (महाधमनी चाप अंत). पोत आँसू नहीं सुनिश्चित करें. </li><li> क्रेब्स बफर के साथ भरा सिरिंज का प्रयोग धीरे P1 transducer के माध्यम से पोत के अतिरिक्त रक्त बाहर निकलवाने. चैम्बर के लिए P1 बंद. </li><li> पॉलिएस्टर टाई के साथ P1 प्रवेशनी सुरक्षित पोत. </li><li> P2 प्रवेशनी पर बढ़ते के लिए cannulas / प्रवेशनी करीब धारकों ले जाएँ. </li><li> माउंट पोत के बाहर का अंत (~ की लंबाई ¼) बाहर का प्रवेशनी पर. पॉलिएस्टर टाई के साथ सुरक्षित. </li></ol> लगभग. समय = 20 मिनट 5. पोत पर दबाव <ol><li> प्रवेशनी धारकों को समायोजित करने के लिए मोड़ नहीं है या बर्तन में खिंचाव सुनिश्चित. </li><li> साथ P1 और p2 चैम्बर के लिए बंद कर दिया मैनुअल के लिए स्वत: से दबाव सहायक स्विच. दबाव इमदादी पर की जाँच करें वहाँ 10 सेकंड के भीतर दबाव में कोई निरंतर कमी नहीं है. अगर वहाँ है, एक दरार उत्पन्न है और कनेक्शन और transducers के लिए जगह में सुरक्षित करने की आवश्यकता है. </li><li> दबाव सहायक वापस स्वत तो खुले चैम्बर के लिए P2 के लिए समायोजित करें. माइक्रोस्कोप के तहत निरीक्षण पोत चौड़ा करना है जब नल चैम्बर खोला है. </li><li> पुस्तिका दबाव सहायक स्विच. 10 सेकंड के भीतर दबाव में लगातार कमी के लिए फिर से जाँच करें. अगर वहाँ एक दरार है तो प्रणाली तंग दबाव नहीं है और वहाँ के बर्तन में छेद होने की संभावना है. </li><li> स्वत: खुला P1 वापस चैम्बर के लिए स्विच. मैनुअल सेटिंग में जाँच करें कि दबाव स्थिर रहता है. </li><li> यदि पुस्तिका सेटिंग वृद्धि डायल पर 2 (40 mmHg) कोई रिसाव,. </li><li> स्वत: समायोजित और माइक्रोस्कोप के तहत पोत का निरीक्षण. यदि आवश्यक हो, प्रवेशनी धारक को समायोजित पुस्तिका सेटिंग पर लीक के लिए vessel.Check में कोई मोड़ सुनिश्चित करने के लिए. </li><li> 5.7 डायल 3 (60 mmHg) में वृद्धि, जब तक वांछित दबाव तक पहुँच जाता है पर - 5.6 4 (80 mmHg) और इसलिए कदम दोहराएँ. </li></ol> लगभग. समय = 15 - 30 मिनट 6. दबाव पोत incubating <ol><li> तापमान नियंत्रक 37 सेट डिग्री सेल्सियस कनेक्ट </li><li> एक दूसरे के पोत कक्ष स्नान में क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप perfuse क्रेब्स बफर (1 एमएल / मिनट) के साथ. </li><li> कनेक्ट केवल स्नान के ऊपर परत सुनिश्चित करने के चैम्बर के लिए Aspirator निकाल दिया जाता है. </li><li> 37 ° C पर दबाव स्वचालित करने के लिए सेट के साथ एक घंटे के लिए दबाव पोत सेते हैं. </li><li> दबाव (मार्गदर्शन करने के लिए स्विचन) समय - समय पर नहीं लीक कर रहा है की जाँच करें. </li><li> विभिन्न औषधीय हस्तक्षेप के प्रभाव बस ऊष्मायन के दौरान स्नान करने के लिए यौगिक जोड़कर देखा जा सकता है है. </li></ol> लगभग. समय = 1 घंटे 7. पूरे रक्त के साथ दबाव पोत Perfusing <ol><li> ऊष्मायन के दौरान कम से कम 7.5 एमएल मानव पूरे रक्त / 40 यू हेपरिन / एमएल रक्त में एकत्र पोत प्राप्त करते हैं. 37 पर एक 50 मिलीलीटर बाज़ में सेते डिग्री सेल्सियस </li><li> टी के अंत से पहले 10 मिनट37 पर 10 मिनट के लिए VybrantDil (1:1000) के साथ ऊष्मायन लेबल रक्त वह ° सी के अंधेरे में. </li><li> 10 मिनट के बाद, किसी भी बुलबुले समाशोधन सिरिंज में रक्त इकट्ठा करने और एक गर्मी 37 पर सेट जैकेट ° सी. के साथ एक सिरिंज पंप पर देते हैं </li><li> चैम्बर / पोत P1 transducer और बंद सिरिंज और बेकार टयूबिंग कनेक्ट. </li><li> 1000 μL / मिनट बर्बाद टयूबिंग के माध्यम से किसी भी बुलबुले को दूर करने पर पर्ज रक्त. </li><li> चैम्बर के लिए P1 खोलें. दबाव सहायक स्वचालित रूप से समायोजित करने के लिए वांछित दबाव बनाए रखना होगा. </li><li> 100 μL / मिनट पर खून Perfuse. </li><li> एक फ्लोरोसेंट खुर्दबीन 15 सेकंड के लिए एक डिजिटल कैमरा रिकॉर्ड perfused पोत के दो 1 पर, फ़ील्ड 3, 5, 7.5 और 10 मिनट के लिए युग्मित का उपयोग करना. </li><li> डाक छिड़काव endothelial अखंडता और समारोह जैसे आगे भड़काऊ प्रतिक्रिया को मान्य myograph और आसंजन अणु अभिव्यक्ति immunohistochemistry द्वारा निर्धारित किया जा सकता है औषधीय तकनीकों के माध्यम से मूल्यांकन किया जा सकता है. </li></ol> लगभग. समय = 15 मिनट 8. प्रतिनिधि परिणाम: दबाव कक्ष की स्थापना के एक योजनाबद्ध आरेख चित्र 1 में दिखाया गया है. साथ लाइव वीडियो रिकॉर्डिंग के माध्यम से एक डिजिटल कैमरा एक फ्लोरोसेंट खुर्दबीन परिणाम के लिए मिलकर तुरन्त कल्पना कर सकते हैं. प्रतिनिधि वीडियो छवियों चित्रा 3 जहां leukocytes endothelium के अनुयायी हो सकता है अगर वे 10 सेकंड के लिए स्थिर बने रहे पर विचार कर रहे हैं में देखा जाता है. सतत पाश पालन कोशिकाओं पर वीडियो रिकॉर्डिंग के साथ एक औसत प्रति क्षेत्र के रूप में गिना जा सकता है है. जबकि दोनों (चित्रा 3A) कम और उच्च दबाव (3B चित्रा) आसंजन के कुछ राशि का कारण होगा उच्च intraluminal दबाव में ल्युकोसैट आसंजन में महत्वपूर्ण वृद्धि देखी है और यह भी मात्रात्मक प्रदर्शन किया है (चित्रा 4). <img alt="चित्रा 1" src="/files/ftp_upload/3221/3221fig1.jpg" /> चित्रा 1. प्रेशराइज्ड पूर्व vivo पोत चैम्बर योजनाबद्ध एक cannulated पोत एक प्रॉक्सिमल (P1) transducer और एक बाहर का (P2) transducers है कि रक्तचाप पोत के भीतर सक्षम बनाता है चालाकी से किया जा से जुड़े. छिड़काव P1 transducer और दबाव के माध्यम से है P2 transducer के माध्यम से बनाए रखा है. <img alt="चित्रा 2" src="/files/ftp_upload/3221/3221fig2.jpg" /> चित्रा 2. संबंधों के साथ Cannuala काले पॉलिएस्टर संबंधों प्रत्येक प्रवेशनी से जुड़े होते हैं. <img alt="चित्रा 3" src="/files/ftp_upload/3221/3221fig3.jpg" /> चित्रा 3. प्रतिनिधि वीडियो छवियों प्रतिदीप्ति तहत गतिशील सेल (लाल तीर) 80 mmHg (ए) और 120 mmHg पर आसंजन (बी) के छिड़काव के 10 मिनट के बाद. <img alt="चित्रा 4" src="/files/ftp_upload/3221/3221fig4.jpg" /> चित्रा 4 Sprague Dawley में ल्युकोसैट आसंजन कम से कम 1 घंटे ऊष्मायन (80 mmHg) और उच्च दबाव (120 mmHg) के बाद मन्या धमनियों. *** 0.001 &lt;पी, के रूप में 2 तरह दोहराया एनोवा उपायों Bonferroni अस्थायी पद परीक्षण का उपयोग से विश्लेषण.

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अध्ययन प्रोटोकॉल अल्फ्रेड मेडिकल रिसर्च और शिक्षा सीमा पशु आचार समिति और अल्फ्रेड अस्पताल आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था.

यह एक संशोधित बरकरार वास्तविक समय में दबाव की शर्तों के तहत अलग रक्त वाहिकाओं में endothelium ल्युकोसैट आसंजन अध्ययन विधि है. अकेले पोत चैम्बर के छिड़काव बड़े चूहों और चूहे वाहिकाओं के समर्थक भड़काऊ उपभेदों के एक त्वरित सत्यापन के लिए सक्षम बनाता है. सक्षम करने से दबाव हेरफेर गतिशील सेल बातचीत बहुत उच्च intraluminal दबाव है, इस प्रकार बेहतर नकल रही शारीरिक और pathophysiological शर्तों को कम से मनाया अनुमति देता है. जहाजों के व्यास भी पर्याप्त सेल इमेजिंग प्रोग्राम का उपयोग और इसलिए कतरनी प्रवाह और दर और निर्धारित किया जा सकता है इसलिए चालाकी से मापा जा सकता है. अपनी myograph क्षमताओं के साथ, औषधीय स्नान में रखा हस्तक्षेप इस मॉडल यंत्रवत और संकेत रास्ते के अध्ययन को सक्षम करने के साथ प्रयोगात्मक संभव स्थिति के लिए एक और आयाम जोड़. जबकि endothelial संरक्षण दबाव हेरफेर के दौरान पुष्टि नहीं हो सकते हैं, ACH और पीई के लिए प्रतिक्रियाओं के बाद 9 छिड़काव आयोजित किया जा सकता है. यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि इस सेटअप सेल के लिए सेल काँपने के गुणवाला रक्त प्रवाह और न ही सिस्टोलिक या diastolic दबाव के प्रभाव नहीं बातचीत पर intraluminal दबाव के प्रभाव को दर्शाता है. इसके अलावा, जबकि ल्युकोसैट आसंजन पर तीव्र दबाव परिवर्तन मनाया गया, इस सेटअप भी हो सकता है पुरानी दबाव प्रभाव (यानी ऊष्मायन बार बढ़ती है और एक पुरानी दबाव पशु मॉडल का उपयोग) को देखने का उपयोग कर सकते हैं. Sprague Dawley आम मन्या धमनियों इस सेट में प्रदर्शन कर रहे हैं, लेकिन अन्य उपभेदों और प्रजातियों प्रवेशनी आकार के लिए उपयुक्त समायोजन के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है. वास्तव में, यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि और जानवरों की उम्र और वजन पोत आकार को प्रभावित और इस तरह है कि सेट अप के लिए प्रत्येक पोत के लिए व्यक्तिगत की जरूरत है. संयोजी ऊतक के बंद और सावधान विच्छेदन leukocytes के दृश्य काफी सुधार कर सकते हैं.

<table border="1"><tbody><tr><th> अभिकर्मक / उपकरण का नाम </th><th> कंपनी </th><th> सूचीपत्र संख्या </th><th> टिप्पणियाँ </th></tr><tr><td> खुर्दबीन </td><td> कार्ल Zeiss, इंक </td><td> STEREO डिस्कवरी V.20 </td><td></td></tr><tr><td> पीएचडी 2000 सिरिंज पम्प </td><td> हार्वर्ड उपकरण </td><td> 70-2016 </td><td></td></tr><tr><td> डिजिटल कैमरा और नियंत्रक </td><td> ORCA-ईआर हमामात्सू </td><td> C4742-95 </td><td></td></tr><tr><td> प्रतिदीप्ति प्रदीप्ति सिस्टम </td><td> लुमेन गतिशीलता </td><td> एक्स उद्धृत 120 </td><td></td></tr><tr><td> पोत चैंबर </td><td> सिस्टम, इंस्ट्रुमेंटेशन के रहने </td><td> CH/1/SH </td><td></td></tr><tr><td> दबाव सर्वो नियंत्रक और क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पम्प </td><td> सिस्टम, इंस्ट्रुमेंटेशन के रहने </td><td> पुनश्च - 200 </td><td></td></tr><tr><td> छिड़काव दबाव मॉनिटर </td><td> सिस्टम, इंस्ट्रुमेंटेशन के रहने </td><td> प्रधानमंत्री - 4 </td><td></td></tr><tr><td> 2 एक्स दबाव ट्रांन्सड्यूसर </td><td> सिस्टम, इंस्ट्रुमेंटेशन के रहने </td><td> PT - एफ </td><td></td></tr><tr><td> तापमान नियंत्रक </td><td> सिस्टम, इंस्ट्रुमेंटेशन के रहने </td><td> TC-01 </td><td></td></tr><tr><td> क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पम्प </td><td> Instech प्रयोगशालाओं, इंक </td><td> P720 </td><td></td></tr><tr><td> VybrantDil समाधान सेल लेबलिंग </td><td> Invitrogen </td><td> वी - 22,885 </td><td> 1:1000 का प्रयोग करें </td></tr></tbody></table>

imaging leukocyte adhesion to the vascular endothelium at high intraluminal pressure

Worldwide, hypertension is reported to be in approximately a quarter of the population and is the leading biomedical risk factor for mortality worldwide. In the vasculature hypertension is associated with endothelial dysfunction and increased inflammation leading to atherosclerosis and various disease states such as chronic kidney disease2, stroke3 and heart failure4. An initial step in vascular inflammation leading to atherogenesis is the adhesion cascade which involves the rolling, tethering, adherence and subsequent transmigration of leukocytes through the endothelium. Recruitment and accumulation of leukocytes to the endothelium is mediated by an upregulation of adhesion molecules such as vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1), intracellular cell adhesion molecule-1 (ICAM-1) and E-selectin as well as increases in cytokine and chemokine release and an upregulation of reactive oxygen species5. In vitro methods such as static adhesion assays help to determine mechanisms involved in cell-to-cell adhesion as well as the analysis of cell adhesion molecules. Methods employed in previous in vitro studies have demonstrated that acute increases in pressure on the endothelium can lead to monocyte adhesion, an upregulation of adhesion molecules and inflammatory markers6 however, similar to many in vitro assays, these findings have not been performed in real time under physiological flow conditions, nor with whole blood. Therefore, in vivo assays are increasingly utilised in animal models to demonstrate vascular inflammation and plaque development. Intravital microscopy is now widely used to assess leukocyte adhesion, rolling, migration and transmigration7-9. When combining the effects of pressure on leukocyte to endothelial adhesion the in vivo studies are less extensive. One such study examines the real time effects of flow and shear on arterial growth and remodelling but inflammatory markers were only assessed via immunohistochemistry10. Here we present a model for recording leukocyte adhesion in real time in intact pressurised blood vessels using whole blood perfusion. The methodology is a modification of an ex vivo vessel chamber perfusion model9 which enables real-time analysis of leukocyte -endothelial adhesive interactions in intact vessels. Our modification enables the manipulation of the intraluminal pressure up to 200 mmHg allowing for study not only under physiological flow conditions but also pressure conditions. While pressure myography systems have been previously demonstrated to observe vessel wall and lumen diameter11 as well as vessel contraction this is the first time demonstrating leukocyte-endothelial interactions in real time. Here we demonstrate the technique using carotid arteries harvested from rats and cannulated to a custom-made flow chamber coupled to a fluorescent microscope. The vessel chamber is equipped with a large bottom coverglass allowing a large diameter objective lens with short working distance to image the vessel. Furthermore, selected agonist and/or antagonists can be utilized to further investigate the mechanisms controlling cell adhesion. Advantages of this method over intravital microscopy include no involvement of invasive surgery and therefore a higher throughput can be obtained. This method also enables the use of localised inhibitor treatment to the desired vessel whereas intravital only enables systemic inhibitor treatment.

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Imaging Leukocyte Adhesion to the Vascular Endothelium at High Intraluminal Pressure

यह एक विधि काटा दबाव वाहिकाओं में endothelium के लिए ल्युकोसैट आसंजन कल्पना है. तकनीक कतरनी प्रवाह के तहत intraluminal दबाव भिन्न 200 mmHg इस प्रकार उच्च रक्तचाप के pathophysiological शर्तों नकल - आईएनजी के साथ संवहनी आसंजन का अध्ययन सक्षम बनाता है.

इमेजिंग ल्युकोसैट उच्च Intraluminal दबाव में संवहनी endothelium के लिए आसंजन

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