Name: performing custom microrna microarray experiments
Uploaded: 2011-10-28T12:00:00
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O trabalho foi suportado em parte pelo Instituto Nacional de Abuso de Drogas Center (P50 DA 011.806) e Exército dos Estados Unidos Departamento de Defesa (W81XWH-07-1-0183).

1. Impressão de microarrays miRNA personalizado <ol><li> Imprimir o microarray slides usando o microarray serviços instalação do núcleo de uma universidade ou uma empresa. A qualidade de microarray de fabricação é um dos fatores mais críticos para o sucesso de um experimento de microarray. Tente alguns serviços, se possível. Idealmente, seria imprimir 5-10 slides de cada vez, e todos os slides parecem idênticos, com bem separados, os pontos individuais. </li><li> Para suporte microarray, usamos as lâminas...

<ol>
	<li>Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functions+of+animal+microRNAs.">The functions of animal microRNAs.</a> Nature. 431, 350-355 (2004).</li><li>Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Most+mammalian+mRNAs+are+conserved+targets+of+microRNAs.">Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs.</a> Genome Res. 19, 92-105 (2009).</li><li>Chekulaeva, M., Filipowicz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+miRNA-mediated+post-transcriptional+regulation+in+animal+cells.">Mechanisms of miRNA-mediated post-transcriptional regulation in animal cells.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 21, 452-460 (2009).</li><li>Farazi, T. A., Spitzer, J. I., Morozov, P., Tuschl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNAs+in+human+cancer.">miRNAs in human cancer.</a> J. Pathol. 223, 102-115 (2011).</li><li>Small, E. M., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pervasive+roles+of+microRNAs+in+cardiovascular+biology.">Pervasive roles of microRNAs in cardiovascular biology.</a> Nature. 469, 336-342 (2011).</li><li>Thomson, J. M., Parker, J., Perou, C. M., Hammond, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+custom+microarray+platform+for+analysis+of+microRNA+gene+expression.">A custom microarray platform for analysis of microRNA gene expression.</a> Nat. Methods. 1, 47-53 (2004).</li><li>Zhang, X., Xu, W., Tan, J., Zeng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stripping+custom+microRNA+microarrays+and+the+lessons+learned+about+probe:slide+interactions.">Stripping custom microRNA microarrays and the lessons learned about probe:slide interactions.</a> Anal. Biochem. 386, 222-227 (2009).</li><li>Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRBase:+tools+for+microRNA+genomics.">miRBase: tools for microRNA genomics.</a> Nucl. Acids. Res. 36, D154-D158 (2008).</li><li>Landgraf, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mammalian+microRNA+expression+atlas+based+on+small+RNA+library+sequencing.">A mammalian microRNA expression atlas based on small RNA library sequencing.</a> Cell. 129, 1401-1414 (2007).</li><li>Chiang, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+microRNAs:+experimental+evaluation+of+novel+and+previously+annotated+genes.">Mammalian microRNAs: experimental evaluation of novel and previously annotated genes.</a> Genes. Dev. 24, 992-1009 (2010).</li></ol>

Apesar dos avanços recentes nas tecnologias de seqüenciamento de profundidade, microarray continua a ser uma opção viável para high-throughput análise de DNA e RNA. Comparado ao seqüenciamento de profundidade, as experiências microarray são mais baratos, e um laboratório de biologia molecular típico pode executar a maioria dos experimentos e análise de dados in-house, o que permite flexibilidade e economiza tempo. No futuro, é provável microarrays adequado para interrogar intensamente conjuntos de genes, p...

<table border="1"><tbody><tr><th> Itens </th><th> Vendedor </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários </th></tr><tr><td> NCode Multi-Species miRNA Microarray Probe Set V2 </td><td> Invitrogen </td><td> MIRMPS201 </td><td> Desenhado com base nos miRBase Release 9.0 (Outubro de 2006). Ele contém ~ 1140 sem modificações, 34-44 nt oligonucleotídeos longos como sondas para voar worm,, peixe-zebra, rato, rato, e miRNAs humanos, e um número de sondas de controle interno, como snoRNAs. As sondas de miRNA são doublets das seqüências complementares de miRNAs maduros, daí o tamanho de ~ 44 nt. Para a análise de um pode se concentrar em miRNAs de um genoma particular (s) de interesse. </td></tr><tr><td> Trizol </td><td> Invitrogen </td><td> 15596018 </td><td> Temos também utilizado enriquecido, fração de RNA pequeno de rotulagem, embora total de amostras de RNA são mais rápidos e mais fáceis de preparar e de quantificar e adequado para aplicações a jusante como a análise de mRNA. </td></tr><tr><td> T4 RNA Ligase 1 </td><td> New England Biolabs </td><td> M0204L </td><td></td></tr><tr><td> Ulysis Alexa Fluor 647 Kit Rotulagem de Ácido Nucleico </td><td> Invitrogen </td><td> U21660 </td><td> Este kit ou produtos similares podem ser usados ​​para rotular amostras experimentais RNA ou um RNA de controlo (em vez de DNA de controle) também. </td></tr><tr><td> 5&#39;-PCU-DY547-3 &#39; </td><td> Dharmacon </td><td> Feitos </td><td> Fração pequena do RNA pode ser igualmente marcada pela ligadura. </td></tr><tr><td> Colunas CentriSep </td><td> Separações Princeton </td><td> CS-901 </td><td></td></tr><tr><td> GAPSII corrediça revestida </td><td> Corning </td><td> 40004 </td><td> Outros tipos de slides podem ser usados ​​também. </td></tr><tr><td> Hibridização câmaras de microarray </td><td> Corning </td><td> 2551 ou 40080 </td><td> Outros tipos de câmaras de hibridação e lamínulas também deve funcionar. Utilização de máquinas de hibridização comercialmente disponíveis podem reduzir o tempo de hibridização significativamente, por exemplo, a ~ 2 horas. </td></tr><tr><td> Lifterslips </td><td> ThErmo / Erie Scientific </td><td> 25X60I-M5439-001-LS </td><td></td></tr><tr><td> BlueFuse </td><td> BlueGenome </td><td></td><td></td></tr><tr><td> GeneSpring </td><td> Agilent </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

performing custom microrna microarray experiments

microRNAs (miRNAs) são uma grande família de ~ 22 nucleotídeos (nt) longas moléculas de RNA, que são amplamente expressos em eucariotos 1. Genomas complexos codificam pelo menos centenas de miRNAs, que principalmente inibir a expressão de um vasto número de genes-alvo pós-transcricionalmente 2, 3. miRNAs controlam uma ampla gama de processos biológicos 1. Além disso, a expressão de miRNA alterados tem sido associado com doenças humanas como câncer e miRNAs podem servir como biomarcadores para doenças e prognóstico 4, 5. É importante, portanto, entender a expressão de miRNAs e funções sob diversas condições. Três abordagens principais têm sido empregadas para expressão perfil de miRNA: real-time PCR, microarranjos, seqüenciamento e profunda. A técnica de microarray miRNA tem a vantagem de ser de alto rendimento, geralmente menos caro, ea maioria das etapas experimentais e análise pode ser carried em um laboratório de biologia molecular na maioria das universidades, as escolas médicas e hospitais associados. Aqui, nós descrevemos um método para a realização de experimentos de microarray miRNA personalizado. Um conjunto de sonda de miRNA serão impressas em lâminas de vidro para produzir microarrays miRNA. RNA é isolado usando um método ou reagente que preserva espécies de pequenos RNA, e então marcadas com um corante fluorescente. Como controle, oligonucleotídeos referência DNA correspondente a um subconjunto de miRNAs também estão marcadas com um corante fluorescente diferente. O DNA de referência servirá para demonstrar a qualidade do slide e hibridação e também será utilizado para a normalização de dados. O RNA e DNA são misturados e hibridizado com uma lâmina de microarray contendo sondas para a maioria dos miRNAs na base de dados. Após a lavagem, o slide é digitalizada para obter imagens e intensidades dos pontos individuais quantificadas. Esses sinais-prima será processada e analisada como os dados da expressão do miRNAs correspondente. Microaslides rray pode ser descascado e regenerado para reduzir o custo de microarrays e para reforçar a coerência das experiências microarray. Os mesmos princípios e procedimentos são aplicáveis ​​a outros tipos de experimentos de microarray personalizado.

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Performing Custom MicroRNA Microarray Experiments

Um procedimento simples de realizar experimentos de microarray personalizado microRNA é descrito. As etapas incluem isolar RNA, rotulagem RNA e DNA de referência, hibridação as amostras para microarrays, a digitalização da microarrays, quantificar e analisar os sinais de hibridização.

A realização de experimentos de Microarray personalizado MicroRNA

microRNAs (miRNAs) are a large family of &tilde; 22 nucleotides (nt) long RNA molecules that are widely expressed in eukaryotes 1.  Complex genomes encode ...

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