Name: a simple chelex protocol for dna extraction from anopheles spp.
Uploaded: 2013-01-09T12:00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp. at JoVE.com

الكتاب مدينون لجهاء وشيوخ والمجتمعات من ماشا لunwaveing ​​في التعاون خلال البعوض مجموعات عينة المجال. تقدم الدكتور دوغ نوريس وكنت رفقة الخبرات لا تقدر بثمن على بروتوكول التمليح بها. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل جامعة جونز هوبكنز الملاريا معهد بحوث نظام المنح الرائدة. تم التبرع بها البعوض والطفيليات التكرم معايير المختبر حسب نوع DNA، MR4 الأمريكية والتحصيل الثقافة.

1. التحضيرية تشريح العينات البعوض <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البعوض مكان على قطع صغيرة من parafilm وجبل على تشريح المجهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطية في قطرة ماء منزوع الأيونات لتليين الأنسجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شق الذبيحة البعوض على وجه التحديد في المشترك بين الصدر والبطن، وبالتالي من الخدش الرأس والصدر من قسم البطن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل كل قسم تشريح البعوض إلى تعقيمها نظيفة 1.5 مل أنبوب microcentrifuge prelabeled مع البعوض التفاصيل عدد ID وضعت بشكل مناسب للدلالة على القسم الجسم (مثل &quot;M&quot; في منتصف القناة الهضمية القسم؛ &quot;حزب التحرير&quot; لرئيس قسم الصدر و). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل parafilm والقضاء بعناية مرحلة المجهر مع Kimwipe 70٪ مبلل بالكحول قبل معالجة البعوض المقبل. </li></ol> 2. استخراج الحمض النووي من عينات البعوض <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة 20 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات في أنبوب العينات واستخدام تلميح ماصة لطحن قسم البعوض المغمورة في الأمم المتحدةيفورم التعليق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ميكرولتر من 1X PBS تعقيمها / 1٪ إلى حل سابونين جناسة عينة ومزيج من vortexing حظة لطيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي في 20000 x ج لمدة 2 دقيقة وتجاهل طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة تعليق بيليه في 100 ميكرولتر 1X PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي مرة أخرى في 20000 x ج لمدة 2 دقيقة وتجاهل طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من vortexing لطيف (5 ثانية)، إعادة تعليق بيليه في 75 ميكرولتر المياه المعقمة منزوع الأيونات و 25 ميكرولتر من التعليق 20٪ Chelex-100 W / V الراتنج في الماء منزوع الأيونات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيرس ثقب في غطاء أنبوب عينة باستخدام إبرة تحت الجلد العقيمة 23G ملتهب في الموقد بنسن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغلي التعليق العينة في حمام مائي على الرف العائمة (أو في كتلة التدفئة) لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي في 20000 XG ل1 دقيقة والحل نقل الحمض النووي التي تلت ذلك في قارورة التخزين prelabeled لاستخدامها في تطبيقات PCR قالب. </li></ol> 3. المتصورة المنجلية والتنميط الجيني الأنوفيلةSPP. تحديد الجزيئية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 2.5 ميكرولتر من استخراج الحمض النووي في 25 Chelex ردود الفعل PCR ميكرولتر الحمض النووي للتحقق من جودة 11، تحديد الأنواع الأنوفيلة 10 و التركيب الوراثي لP. 12 المنجلية التهابات الغدة منتصف القناة الهضمية واللعابية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتعظيم العائد AMPLICON، وخاصة بالنسبة للP. كشف المنجلية، وتشمل الزلال 1.5X مصل بقري (BSA) في مقايسة PCR. ويوصى تكوين رد الفعل التالي: (2.5 ميكرولتر قالب، 0.25 ميكرومتر الاشعال، 1.5 ميكرومتر كلوريد المغنيسيوم، و 200 ميكرومتر dNTPs، 1X العازلة PCR، وBSA 1.5X 1.0U البلمرة DNA طق، في 25 مجلدا ميكرولتر). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للتحقق من الجودة في استخراج الحمض النووي، تضخيم منطقة المفصلية نازعة الأدينين ثنائي النوكليوتيد نيكوتيناميد الميتوكوندريا (NADH) الوحيدات 4 (ND4) الجين (الاشعال ND4FW [5&#39;-YAT GTD TTA TGA TTR CCT ​​AA-3 &#39;] وND4RV [5&#39; CTT-رودمان CTT CCW ADW CGT TC-3 &#39;]، ونتوقع المنتج 400bp) 11،13. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للتمييز الأنوفيلة غامبياه الأنواع SL الأخوة. (An. الغامبية SS والانوفلس. فقط)، تضخيم المنطقة المحيطة النيوكلوتايد في التبادل بين الجينات (IGS) المنطقة، (الأمم المتحدة الاشعال [5&#39;-GTGTGCCCCTTCCTCGATGT-3 &#39;]، GA [5&#39;-CTGGTTTGGTCGGCACGTTT- 3 &#39;]، AR [5&#39;-AAGTGTCCTTCTCCATCCTA-3&#39;]، ونتوقع ان المنتج 390bp SS الغامبية، ومن 315bp الانوفلس) 10،11. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكتابة P. المنجلية المقاومة للأدوية مضاد الفولات الأشكال، نفذ PCR المتداخلة لتضخيم المنطقة المحيطة الكودونات الأحماض الأمينية 108، 51، 59، 16 و 164 في اختزال dihydrofolate الطفيلي (DHFR) الجينات: الاشعال الجولة الأولي: M1 [5&#39;-TTTATGATGGAACAAGTCTGC-3 &#39;] وM5 [5&#39;-AGTATATACATCGCTAACAGA-3&#39;] الاشعال الجولة الثانوية: M3 [5&#39;-TTTATGATGGAACAAGTCTGCGACGTT-3 &#39;] مع F / [5&#39;-AAATTCTTGATAAACAACGGAAACCTTTTA-3&#39;] أو F [5&#39;-GAAATGTAATTCCCTAGATATGGAATATT-3] مع M4 [5&#39;-TTAATTTCCCAAGTAAAACTATTAGAGCTTC-3 &#39;]). كما تحتوي على تضخيم المنطقة الكودونات الأحماض الأمينية 436، 437، 540، 581 منوالثانية 613 في P. المنجلية dihydropteroate مخلقة (DHPS) الجينات: الجولة الأولي الاشعال R2 [5&#39;-AACCTAAACGTGCTGTTCAA-3 &#39;] مع R / [5&#39;-AATTGTGTGATTTGTCCACAA3&#39;]؛ جولة الاشعال الثانوي J: [5&#39;-&#39;TGCTAGTGTTATAGATATAGGTGGAGAAAGC-3&#39;] مع K / [&#39;5&#39;-CTATAACGAGGTATTGCATTTATTGCAAGAA-3] أو K: [5&#39;-TGCTAGTGTTATAGATATAGGATGAGCATC-3 &#39;] مع K /، أو L [5&#39;-ATAGGATACTATTTGATATTGATATTGGACCAGGATTCG-3 &#39;] مع L / [5&#39;-5TATTACAACATTTTGATCATTCGCGCAACCGG-3&#39;] 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 4 ميكرولتر AMPLICON الموضوع إلى أليل محددة انزيم الهضم قيود في 30 ميكرولتر ردود الفعل باتباع إرشادات الشركة المصنعة، للكشف عن المخدرات مضاد الفولات المرتبطة الأشكال المقاومة 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموضوع 5 ميكرولتر من AMPLICON PCR (أو 15 ميكرولتر من تقييد هضم) في حارة من بروميد الملطخة agarose هلام إيثيديوم 2٪ إلى الكهربي (100 - 120V) وتصور العصابات تحت تضوء UV. </li></ol>

<ol>
	<li>Bonnet, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+antimalarial+treatment+in+Guinea:+in+vivo+study+of+two+artemisinin+combination+therapies+in+Dabola+and+molecular+markers+of+resistance+to+sulphadoxine-pyrimethamine+in+N'Zerekore.">Efficacy of antimalarial treatment in Guinea: in vivo study of two artemisinin combination therapies in Dabola and molecular markers of resistance to sulphadoxine-pyrimethamine in N'Zerekore.</a> Malar. J. 6, 54 (2007).</li><li>Nsimba, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sulphadoxine/pyrimethamine+versus+amodiaquine+for+treating+uncomplicated+childhood+malaria+in+Gabon:+a+randomized+trial+to+guide+national+policy.">Sulphadoxine/pyrimethamine versus amodiaquine for treating uncomplicated childhood malaria in Gabon: a randomized trial to guide national policy.</a> Malar. J. 7, 31 (2008).</li><li>Oyewole, I. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behaviour+and+population+dynamics+of+the+major+anopheline+vectors+in+a+malaria+endemic+area+in+southern+Nigeria.">Behaviour and population dynamics of the major anopheline vectors in a malaria endemic area in southern Nigeria.</a> J. Vector Borne Dis. 44, 56-64 (2007).</li><li>Harris, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large+proportion+of+asymptomatic+Plasmodium+infections+with+low+and+sub-microscopic+parasite+densities+in+the+low+transmission+setting+of+Temotu+Province,+Solomon+Islands:+challenges+for+malaria+diagnostics+in+an+elimination+setting.">A large proportion of asymptomatic Plasmodium infections with low and sub-microscopic parasite densities in the low transmission setting of Temotu Province, Solomon Islands: challenges for malaria diagnostics in an elimination setting.</a> Malar. J. . 9, 254 (2010).</li><li>Ouedraogo, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substantial+contribution+of+submicroscopical+Plasmodium+falciparum+gametocyte+carriage+to+the+infectious+reservoir+in+an+area+of+seasonal+transmission.">Substantial contribution of submicroscopical Plasmodium falciparum gametocyte carriage to the infectious reservoir in an area of seasonal transmission.</a> PLoS ONE. 4, e8410 (2009).</li><li>Birx, D., de Souza, M., Nkengasong, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+challenges+in+the+scaling+up+of+HIV,+TB,+and+malaria+programs:+The+interaction+of+health+and+laboratory+systems,+clinical+research,+and+service+delivery.">Laboratory challenges in the scaling up of HIV, TB, and malaria programs: The interaction of health and laboratory systems, clinical research, and service delivery.</a> Am. J. Clin. Pathol. 131, 849-851 (2009).</li><li>Ishengoma, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Health+laboratories+in+the+Tanga+region+of+Tanzania:+the+quality+of+diagnostic+services+for+malaria+and+other+communicable+diseases.">Health laboratories in the Tanga region of Tanzania: the quality of diagnostic services for malaria and other communicable diseases.</a> Ann. Trop. Med. Parasitol. 103, 441-453 (2009).</li><li>Alonso, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+research+agenda+for+malaria+eradication:+vector+control.">A research agenda for malaria eradication: vector control.</a> PLoS Med. 8, e1000401 (2011).</li><li>Grimberg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+efficient+non-organic+procedure+for+the+isolation+of+genomic+DNA+from+blood.">A simple and efficient non-organic procedure for the isolation of genomic DNA from blood.</a> Nucleic Acids Res. 17, 8390 (1989).</li><li>Scott, J. A., Brogdon, W. G., Collins, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indentification+of+single+specimens+of+the+Anopheles+gambiae+complex+by+polymerase+chain+reaction.">Indentification of single specimens of the Anopheles gambiae complex by polymerase chain reaction.</a> American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 49, 520-529 (1993).</li><li>Kent, R. J., Norris, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+mammalian+blood+meals+in+mosquitoes+by+a+multiplexed+polymerase+chain+reaction+targeting+cytochrome+B.">Identification of mammalian blood meals in mosquitoes by a multiplexed polymerase chain reaction targeting cytochrome B.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 73, 336-342 (2005).</li><li>Duraisingh, M. T., Curtis, J., Warhurst, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmodium+falciparum:+detection+of+polymorphisms+in+the+dihydrofolate+reductase+and+dihydropteroate+synthetase+genes+by+PCR+and+restriction+digestion.">Plasmodium falciparum: detection of polymorphisms in the dihydrofolate reductase and dihydropteroate synthetase genes by PCR and restriction digestion.</a> Exp. Parasitol. 89, 1-8 (1998).</li><li>Gorrochotegui-Escalante, N., Munoz, M. L., Fernandez-Salas, I., Beaty, B. J., Black, W. C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+isolation+by+distance+among+Aedes+aegypti+populations+along+the+northeastern+coast+of+Mexico.">Genetic isolation by distance among Aedes aegypti populations along the northeastern coast of Mexico.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 62, 200-209 (2000).</li><li>Kreader, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relief+of+amplification+inhibition+in+PCR+with+bovine+serum+albumin+or+T4+gene+32+protein.">Relief of amplification inhibition in PCR with bovine serum albumin or T4 gene 32 protein.</a> Appl. Environ. Microbiol. 62, 1102-1106 (1996).</li><li>Norris, D. E., Shurtleff, A. C., Toure, Y. T., Lanzaro, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microsatellite+DNA+polymorphism+and+heterozygosity+among+field+and+laboratory+populations+of+Anopheles+gambiae+ss+(Diptera+Culicidae).">Microsatellite DNA polymorphism and heterozygosity among field and laboratory populations of Anopheles gambiae ss (Diptera Culicidae).</a> J. Med. Entomol. 38, 336-340 (2001).</li><li>Schriefer, M. E., Sacci, J. B., Wirtz, R. A., Azad, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+polymerase+chain+reaction-amplified+malarial+DNA+in+infected+blood+and+individual+mosquitoes.">Detection of polymerase chain reaction-amplified malarial DNA in infected blood and individual mosquitoes.</a> Exp. Parasitol. 73 (91), 311-316 (1991).</li><li>Al-Soud, W. A., Radstrom, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+PCR-inhibitory+components+in+blood+cells.">Purification and characterization of PCR-inhibitory components in blood cells.</a> J. Clin. Microbiol. 39, 485-493 (2001).</li><li>Hyun, C., Filippich, L. J., Hughes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inhibitory+effect+of+pentobarbitone+on+reverse+transcription-PCR.">The inhibitory effect of pentobarbitone on reverse transcription-PCR.</a> J. Biochem. Biophys. Methods. 62, 63-68 (2005).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

طريقة مبسطة Chelex المقدمة هنا يمكن استخلاص نوعية الأنوفيلة SPP وP. المنجلية DNA من عينات البعوض قابلة للتطبيقات PCR متنوعة. ويمكن استخدام هذه التقنية لتحديد الجزيئية من البعوض ناقل الملاريا ومراقبة المقاوم للأدوية P. المنجلية الأليلات في البعوض عن البرامج الوطنية لمكافحة الملاريا. مزايا تقنية مبسطة تشمل Chelex بساطة، أقل تكلفة، وبالتالي الكواشف والسلامة وزمن أقصر (37 دقيقة) من البروتوكولات القياسية مثل التمليح من طريقة 10 (2 دقيقة 47 ساعة وخطوة ليلة وضحاها، الجدول 1). المزايا المذكورة أعلاه ومتطلبات الحد الأدنى من كاشف (3 الكواشف) مقارنة بروتوكول المعيار الحالي (10 الكواشف، الجدول 1) 11،15، وجعل البروتوكول Chelex مبسطة ودية خاصة إلى المختبرات البلاد الموبوءة حيث كاشف ثابتسلسلة التوريد في كثير من الأحيان من الصعب الحفاظ عليها. وجود قيود على الطريقة التي مثل بروتوكول قياسي، فإنه يخضع أيضا لمثبطات PCR المعروف أن يحدث في إهاب البعوض 16. ومع ذلك، يخلص بسهولة عن طريق إدراج BSA في المقايسات. كما تم استخدامها بنجاح كما BSA محسن التضخيم ضد مثبطات في تطبيقات PCR الأخرى 17،18.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td><td> التعليقات (اختياري) </td></tr><tr><td> Chelex-100، 50-100 شبكة الجافة </td><td> BioRad </td><td> # 143-2832 </td><td></td></tr><tr><td> سابونين </td><td> SIGMA </td><td> 142-7425 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> نيو انغلاند Biolabs </td><td> B9001S </td><td></td></tr></tbody></table>

a simple chelex protocol for dna extraction from anopheles spp.

البلدان الموبوءة يتم اعتماد متزايد الأدوات الجزيئية لكتابة كفاءة، وتحديد ومراقبة ضد طفيليات الملاريا والبعوض الحامل للمرض، باعتبارها جزءا لا يتجزأ من برامج سيطرتهم 1،2،3،4،5. لإنشاء هذه النهج المستدام للدقة في عمليات البحث لتعزيز جهود مكافحة الملاريا والقضاء، وطرق بسيطة ومعقولة التكلفة، مع كاشف بالبخل والاحتياجات من المعدات ضرورية 6،7،8. هنا نقدم بسيطة Chelex المستندة إلى تقنية لاستخراج طفيل الملاريا وناقلات DNA من عينات البعوض مجال جمع. حددنا 72 شكليا الأنوفيلة الغامبية SL. من 156 البعوض التي استولت عليها عاقر قرحا رذاذ المصيد في غرف النوم من الأسر داخل المنطقة المجاورة 2 كم من 2000 معهد الملاريا في ماشا. بعد تشريح لفصل الرأس والصدر من البطن حركة اتشيه الحرة لجميع الأنوفيلة 72biae SL. البعوض، وضعت بشكل فردي القسمين في 1.5 مل أنابيب microcentrifuge والمغمورة في 20 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات. تلميح باستخدام ماصة معقمة، والمتجانس بشكل منفصل لكل قسم البعوض على تعليق موحد في الماء منزوع الأيونات. من جناسة الناجمة عن البعوض كل قسم، تقرر الإبقاء على 10 ميكرولتر بينما تم نقل الآخر إلى 10 ميكرولتر منفصلة تعقيمها أنبوب مل 1.5. تعرضت مأخوذة منفصلة لاستخراج الحمض النووي من قبل Chelex إما المبسطة أو معيار التمليح من استخراج بروتوكول 9،10. البروتوكول هو التمليح من ما يسمى ويستخدم بشكل واسع لأنه يعمل تركيزات عالية من الملح بدلا من المذيبات العضوية الخطرة (مثل الفينول وكلوروفورم) لهطول الأمطار خلال البروتين خطوة استخراج DNA 9. واستخدمت مقتطفات كقوالب لتضخيم PCR باستخدام بادئات استهداف المفصلية الميتوكوندريا dehydroge نيكوتيناميد أدينين ثنائي النوكليوتيدnase (NADH) الوحيدات 4 الجين (ND4) للتحقق من جودة DNA 11، لPCR لتحديد الأنواع الأنوفيلة الغامبية 10 و الأخوة وPCR المتداخلة لكتابة الإصابة المنجلية 12. مقارنة باستخدام نوعية الحمض النووي (ND4) أظهرت حساسية PCR 93٪ والنوعية 82٪ للنهج Chelex نسبة إلى بروتوكول التمليح من المنشأة. وكانت القيم المقابلة من حساسية ونوعية 100٪ و 78٪ على التوالي، وذلك باستخدام الأنواع الأخوة PCR تحديد و92٪ و 80٪ على التوالي لP. المنجلية الكشف PCR. لم تكن هناك فروق ذات دلالة إحصائية في نسبة العينات إعطاء إشارة AMPLICON مع Chelex أو التمليح العادية من البروتوكول في جميع التطبيقات PCR الثلاثة. النهج Chelex حاجة إلى ثلاث الكواشف بسيطة و 37 دقيقة لإكمال، في حين أن. التمليح من البروتوكول ينطوي 10 الكواشف المختلفة و 2 ساعة 47 دقيقة والوقت &quot;معالجة، بما في ذلك خطوة ليلة وضحاها نتائجنا تظهر الفي طريقة مماثلة لChelex استخراج التمليح من القائمة ويمكن أن تكون بديلا عن مقاربة بسيطة ومستدامة في الأماكن المحدودة الموارد حيث إمدادات ثابتة كاشف سلسلة غالبا ما يكون من الصعب الحفاظ عليها.

أمثلة على نتائج فحوصات PCR من DNA لجودة استخراج البعوض (الشكل 1)، الأنوفيلة تحديد الجزيئية الانوفلس (الشكل 2) وP. كشف المنجلية (الشكل 3) تبين أن الأسلوب Chelex مبسطة تعطي نتائج مماثلة على مستوى التمليح من البروتوكول 10، على الرغم من الخطوات أقل من ذلك بكثير (الجدول 1). مع نوعية DNA مماثلة في كل مقتطفات فإنه ليس من المستغرب أن معدلات إيجابية العينة فيما يتعلق آن. وكانت الأنواع الأخوة الغامبية وكذلك معدلات الإصابة الطفيلي لا تختلف إحصائيا استنادا إلى اختبار خي مربع McNemar في (الشكل 3). تم حساب حساسية (٪) كما TP / (TP + FN) * 100 حيث TP يدل على ايجابيات صحيح ويدل على FN السلبيات كاذبة. تم تحديد خصوصية (٪) كما TN / (TN + FP) * 100 حيث يدل TN السلبيات الحقيقية وFP يدل على ايجابيات كاذبة. نوعية الحمض النووي (<html> وأظهرت ND4) PCR حساسية وخصوصية 93٪ 82٪ للنهج Chelex مقارنة لمعيار الذهب التمليح أنشئت من البروتوكول و. وكانت القيم المقابلة من حساسية ونوعية 100٪ و 78٪ على التوالي، وذلك باستخدام الأنواع الأخوة PCR تحديد و92٪ و 80٪ على التوالي لP. المنجلية الكشف PCR. أدى إضافة إلى BSA مخاليط رد فعل في زيادة عامة من ايجابيات PCR (الشكل 3) بسبب تخفيف من مثبطات PCR 14، لChelex على حد سواء وتبسيط العادية التمليح من البروتوكول. ومع ذلك، كان هذا الارتفاع ليس إلا دلالة إحصائية للحصول على جودة DNA (PCR ND4) على مقتطفات Chelex (P = 0.039). أليل محددة انزيم الهضم قيود على P. DHFR المنجلية (أو غيرها من الجينات المستهدفة) AMPLICON تمكن من التنميط الجيني منتصف الأمعاء والغدة اللعابية الإصابات بمرض الملاريا المقاومة للأدوية لالأليلات (الشكل 4، والبيانات الغدة اللعابية لا تظهر). <table bo</html style=";text-align:right;direction:rtl">rder = &quot;1&quot;&gt; <tbody><tr><td colspan="2"> بسيطة Chelex الداخلي </td><td colspan="2"> التمليح من الإجراءات القياسية </td></tr><tr><td> خطوات </td><td> الكواشف </td><td> خطوات </td><td> الكواشف </td></tr><tr><td><ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة إلى عينة 1.5 مل أنبوب microfuge والتجانس في 100 ميكرولتر من 1X PBS / 1٪ حل سابونين (2 دقيقة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترك في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور في 20000 x ج لمدة 2 دقيقة وتجاهل طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ميكرولتر من 1X PBS وتخلط بلطف vortexing حظات (3 ثانية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور في 20000 x ج لمدة 2 دقيقة وتجاهل طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 25 ميكرولتر من Chelex ث / V 20٪ في الماء منزوع الأيونات و 75 ميكرولتر المياه منزوع الأيونات العقيمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيرس ثقب في غطاء أنبوب العينة باستخدام، عقيمة الساخنة إبرة تحت الجلد 23G ومحتويات أنبوب يغلي لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور أنبوب microfuge في 20000 x ج لمدة 1 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل طاف في قارورة معقمة وprelabeled متجر حل DNA في -20 درجة مئوية حتى استخدام (2.5 ميكرولتر في 25 ميكرولتر رد فعل PCR). </li></ol></td><td> PBS سابونين Chelex-100 الخرز </td><td><ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة إلى عينة 1.5 مل أنبوب microfuge والتجانس في 100 ميكرولتر العازلة * بندر مع DEPC 1٪ (2 دقيقة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان في C ° 65 لل1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 15 ميكرولتر الباردة البوتاسيوم M 8 خلات. المزيج بلطف واحتضان على الجليد لمدة 45 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور عينة في أنابيب microfuge في 20000 XG لمدة 10 دقيقة ونقل إلى أنبوب طاف جديدة مل 1.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 250 ميكرولتر من الايثانول 100٪ وتخلط جيدا بواسطة أنبوب في قلب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان عينة في RT لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور في عينات 20000 XG لمدة 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح وتجاهل طاف، وترك حتى يجف تماما بيليه في الأنبوب (30 مفي). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة تعليق بيليه في 20 ميكرولتر من 0.1X + ريبونوكلياز SSC (10 ميكروغرام / مل) بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 80 ميكرولتر المياه DEPC وتخزينها في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام. </li></ol></td><td> Diethylpyrocarbonate (DEPC) * بندر الاحتياطي: كلوريد الصوديوم 0.1 M السكروز 0.2 م 0.1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك EDTA 0.05 متر، ودرجة الحموضة 9.1 0.5٪ SDS في الماء DEPC 8 خلات البوتاسيوم M الإيثانول 0.1X سترات الصوديوم المالحة (SSC) العازلة ريبونوكلياز (10 ميكروغرام / مل) </td></tr><tr><td colspan="2"> الوقت الإجمالي: 37 دقيقة </td><td colspan="2"> إجمالي الوقت: 2 ساعة 47 دقيقة، بالإضافة إلى ليلة وضحاها </td></tr></tbody></table> الجدول 1. الخطوة بالمقارنة خطوة من الكواشف ومتطلبات الوقت لبروتوكول Chelex بسيطة والوقوفارض التمليح من طريقة لاستخراج DNA من عينات البعوض. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/3281/3281fig1.jpg" /> الشكل 1. ND4 مقارنة PCR الميتوكوندريا الحمض النووي للجودة من &quot;C&quot; مبسطة Chelex ومستوى التمليح من &quot;M&quot; مقتطفات على عينات الأنوفيلة مجال الانوفلس. ووقع منتخبا M1 وC1، C2 M2 و، M3 وC3، C4 وM4 والتمليح ومقتطفات من Chelex من نفسه؛ NC، ومراقبة سلبية. عينات البعوض الانوفلس. L، 100 سلم DNA BP. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/3281/3281fig2.jpg" /> الشكل 2 الجزيئية PCR لتحديد بعوض الانوفلس ارابينسيس C1 وM1، M2 وC2، C3 وM3، M4 C4 ودلالة كل منها AMPLICON من التمليح من &quot;M&quot; وتبسيط Chelex مقتطفات &quot;C&quot; DNA لعينات البعوض نفسه؛. AR، الأنوفيلة الانوفلسإيجابية السيطرة؛ L، BP 100 DNA سلم. <img alt="الشكل 3" src="/files/ftp_upload/3281/3281fig3.jpg" /> الشكل 3. الكشف عن ايجابيات والتمليح على Chelex من مقتطفات الحمض النووي لعينات البعوض مجال، مع المقايسات PCR لتحديد الجزيئي للبعوض الانوفلس ارابينسيس (AR) 10، نازعة المفصلية الجينات NADH 4 (ND4) DNA اختبار جودة 11، ومضاد الفولات P مقاومة العقاقير . التنميط الجيني المنجلية DHFR 12 (F-M4). النتائج أظهرت فحوصات لتشغيل مع أو بدون BSA في مزيج التفاعل. وقد استخدم McNemar في اختبار خي مربع لتحديد ما إذا كان الاختلافات بين في المئة من تقارير إنجاز المشروعات إيجابية من الحمض النووي المستخرج من Chelex مبسطة ومستوى التمليح من البروتوكولات كانت ذات دلالة إحصائية. <img alt="الشكل 4" src="/files/ftp_upload/3281/3281fig4.jpg" /> <stroنانوغرام&gt; الشكل 4. تطبيق بروتوكول مبسطة Chelex في التنميط الجيني P. المنجلية الإصابات في البعوض (منتصف القناة الهضمية البيانات معروضة) لالأليلات المقاومة للأدوية. BstN I الهضم على AMPLICON المرافقة كودون 108 من P. DHFR الجينات المنجلية 12 يظهر المسوخ S108T سيكلوغوانيل مقاومة في عينات البعوض (M1-M5؛ منتصف القناة الهضمية البيانات معروضة). U، عسر الهضم 522 BP AMPLICON؛ FCR3، والمختبرات القياسية P. استنساخ المنجلية مراقبة إيجابية تحمل S108T؛ K1، P. مختبر التحكم القياسية المنجلية استنساخ سلبية تحمل سيكلوغوانيل حساسة S108N؛ L، BP 100 DNA سلم.

Watch this Scientific Journal Video about A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp. at JoVE.com

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

يوصف وسيلة سريعة وبأسعار معقولة لاستخراج نوعية طفيل الملاريا وناقلات DNA من عينات البعوض. الاستفادة من خصائص مخلبية من راتنج Chelex، وطريقة بسيطة تمكن من التنميط الجيني طفيليات الملاريا في البعوض مراحل الغدة منتصف القناة الهضمية واللعابية، وكذلك تحديد الجزيئي لل<em&gt; الأنوفيلة</em&gt; الشقيق الأنواع من PCR.

A Chelex بروتوكول بسيط لاستخراج الحمض النووي من<em&gt; الأنوفيلة</em&gt; النيابة.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for  efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and  vector ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Immunology and Infection

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

Genetics

DNA Structure and Function

SCIENTISTS IN ACTION

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

بروتوكول لجمع ويلطخ Hemocytes من الحمى الصفراء البعوض الزاعجة المصرية</em

 Mosquitoes are vectors for a number  of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites  and filarial worms. Laboratories are ...

IgY Technology: Extraction of Chicken Antibodies from Egg Yolk by Polyethylene Glycol (PEG) Precipitation

IgY Technology: Extraction of Chicken Antibodies from Egg Yolk by Polyethylene Glycol PEG Precipitation

IGY التكنولوجيا : استخراج الأجسام المضادة من صفار البيض الدجاج بواسطة البولي ايثيلين جلايكول (PEG) الأمطار

Hens can be immunized by means of  i.m. vaccination (Musculus pectoralis, left and right, injection volume  0.5-1.0 ml) or by means of Gene-Gun ...

High and Low Throughput Screens with Root-knot Nematodes Meloidogyne spp.

High and Low Throughput Screens with Root-knot Nematodes Meloidogyne spp.

شاشات الإنتاجية العالية والمنخفضة مع الجذر عقدة نيماتودا Meloidogyne النيابة.</em

Root-knot nematodes (genus Meloidogyne) are obligate plant parasites. They are extremely polyphagous and considered one of the most economically important ...

A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

بروتوكول بسيط لتجمع الصفائح الدموية بوساطة<em&gt; المتصورة المنجلية</emتبدي الكريات الحمر&gt; بالفيروس في أجواء فقيرة الموارد

P. falciparum causes the majority of severe malarial infections. The pathophysiological mechanisms underlying cerebral malaria (CM) are not fully ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

بروتوكول بسيطة وسريعة لغير إنزيمي فصل الطازجة الأنسجة البشرية لتحليل التسلل اللمفاويات

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

مقاربة بسيطة وفعالة لبناء ناقلات الفيروسات المسخ الوقس

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

Combining Analysis of DNA in a Crude Virion Extraction with the Analysis of RNA from Infected Leaves to Discover New Virus Genomes

الجمع بين تحليل للحمض النووي في مجال استخراج النفط خام Virion بتحليل الحمض النووي الريبي من الأوراق المصابة اكتشاف جينومات الفيروس الجديد

This metagenome approach is used to identify plant viruses with circular DNA genomes and their transcripts. Often plant DNA viruses that occur in low ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

استخراج سريعة وآمنة وبسيطة دليل السرير الحمض النووي للكشف عن الفيروس في عينات الدم كله

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

منصة الفائق لفحص السالمونيلا spp./دوسنتاريا spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Analysis of Fecal Microbiota Dynamics in Lupus-Prone Mice Using a Simple, Cost-Effective DNA Isolation Method

تحليل ديناميكيات الميكروبات البرازية في الفئران المعرضة لمرض الذئبة باستخدام طريقة بسيطة وفعالة من حيث التكلفة لعزل الحمض النووي

Gut microbiota has an important role in educating the immune system. This relationship is extremely important for understanding autoimmune diseases that ...