Name: culturing and electrophysiology of cells on nrcc patch-clamp chips
Uploaded: 2012-02-07T12:00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culturing and Electrophysiology of Cells on NRCC Patch-clamp Chips at JoVE.com

De auteurs willen Alexei Bogdanov te erkennen voor de fabricage van patch-clamp chips op de CPFC, en Hue Tran, Ping Zhao en Matthew Shiu helpen bij de montage. Naweed Syed werd ondersteund door een Canadese Institute of Health Research (CIHR) subsidie. Collin Luk is de ontvanger van NSERC en Alberta Heritage Foundation for Medical Research (AHFMR) studiebeurzen.

1. Chip fabricage De werkwijze beschreven in 6 heeft een 3 pm dikke zichzelf staande film laag 1 MOhm toegang weerstand en een glad oppervlak trechtervormige opening die een innig afdichting met de cel 9 vergemakkelijkt, zie figuur 2. De chips worden singulated en gelijmd in plexiglas pakketten met de opening geconfronteerd met een gat het aansluiten van de chip naar een ondergrondse kanaal. De lijmen wordt afgegeven zodanig dat de shunt capaciteit minimaliseert een nominale 17 pF. Pakketten worden uitgerust met twee diameter van 1,5 mm en 6 mm glazen buizen vloeibare poorten (figuur 3). <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3288/3288fig2.jpg" /> Figuur 2. Scanning electronen microscoop van een focused ion beam gedeelte van een NRCC patch-clamp chip toont een glad oppervlak en siliciumdioxide trechtervorm dat intieme cel contacten bevordert, en een ondiepe opening die goed is voor een lage instap resistance. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3288/3288fig2.jpg" /> Figuur 3. Een chip gelijmd aan de onderzijde van de cultuur flacon in een plexiglas pakket voorzien ondergrondse vloeistofcomponenten en glazen buizen. 2. Sterilisatie, priming en testen De volgende stappen moeten worden uitgevoerd in een biologie veiligheidskabinet om besmetting of het aansluiten van de opening te voorkomen. <ul type="disc"><li> Steriliseren chips in een Harrick basis plasma reiniger (www.harrickplasma.com) met een 0.1-0.3 mbar resterende luchtdruk gedurende 15 min bij het maximale vermogen van 18 W. Andere luchtplasma kunnen worden gebruikt, met vergelijkbare vermogensdichtheid (24 mW / cm 3) te regelen en het product van vermogen dichtheid en tijdconstante. De plasmabehandeling maakt ook de chips hydrofiele Dit vergemakkelijkt priming. </li><li> Fit glazen buizen met een steriele Silastic Laboratorium silicone, 1mm ID x 2mm OD (Cole ParmerCat. # 96115-08), 3inch enerzijds 1 inch aan de andere zijde. </li><li> Vul vloeistofcomponenten door de buizen met steriel gefilterd standaard fosfaatbufferoplossing (PBS), zorg ervoor dat er geen luchtbel is opgesloten. </li><li> Knip de lange siliconenslang terwijl de druk in het PBS van de korte zijde op 1 atm. Een pool van PBS sijpelt door de opening kan zijn zichtbaar in de flacon. Klik de druk aanvoeren van de PBS en maak de korte siliconen tube van die levering. </li><li> Vul flacon met gefilterd PBS behulp van een injectiespuit. </li><li> Dompel een Ag / Ag: Cl-elektrode in de korte buis en een tegenelektrode in de flacon. Een impedantie meter wordt gebruikt om te bevestigen dat de toegang weerstand ligt tussen 300kohm en 3Mohm en de shunt capaciteit ligt tussen de 10pF en 25pF. Een chip met een lagere weerstand waarschijnlijk een lek, en een hogere capaciteit geldt als niet gebruikt aangezien het niet vangen de snelste dynamiek van elektrofysiologische de cel 6. Een chip met een lagere capaciteitof hoger weerstand als aangesloten, terwijl het eenvoudig kan zijn dat een luchtbel opgesloten in de opening. Sommige chips worden opnieuw getest na 1H en voldoet aan de juiste elektrochemische impedantie hebben. </li><li> Spoel de vloeibare kanaal met steriel gedeïoniseerd water, leeg de top flacon en spoel met hetzelfde, twee keer. </li><li> Dompel de verpakte chip met buizen in zoet steriel gedeïoniseerd water voor 30min laad vervolgens met andere chips in een steriele container gevuld met steriel gedeïoniseerd water. Dit zorgt ervoor dat chips blijven hydrofiele en beschermd tegen vervuiling. </li></ul> 3. Chips voorbereiding in de celbiologie lab De volgende stappen worden uitgevoerd in een HEPA-filter laminaire stroming kap met behulp van aseptische technieken, moeten alle oplossingen die gebruikt worden in deze procedure worden gefilterd gesteriliseerd met behulp van een 0.22μm filter. <ul type="disc"><li> Open een chip bak onder een HEPA-gefilterde laminaire stroming kap en verwijder de chips van container naar beneden om te voorkomen dat scheppen mogelijk zwevende verontreinigingen in de top flacon. </li><li> Spoel bovenkant van het flesje van de chip 2x met vers gefilterd steriel gedeïoniseerd water om eventuele resten van vuil te verwijderen van de chip oppervlak. </li><li> Zuig steriel gedeïoniseerd water uit de top flacon. </li><li> Sluit een uiteinde van de buis silastic aan de vloeibare kanaal een druk spuit met steriel gefiltreerd gedeïoniseerd water. In ons systeem, spuiten gevuld met oplossing zijn onder druk door aansluiting op een perslucht tank ingesteld op 20psi. Om de steriliteit te garanderen, wordt de lucht gefilterd (0,22 um filter) vóór binnenkomst in de spuit en ons systeem heeft ook een aan / uit klep die ons in staat stelt om te stoppen of druk uit te oefenen als dat nodig is. </li><li> Met behulp van een hemostaat, klem de uitgang van de slang. </li><li> Open de aan / uit kleppen aan de oplossing onder druk. </li><li> Om de subterranen vloeibare van de chip afspoelen met steriel gedeïoniseerd water, vrij wilt de uitgang van de slang. </li><li> Om voorce het water omhoog door de opening, klemt u de uitgang van de buis met een hemostat. </li><li> Om de waterafvoer te vermijden, klem de input en output uiteinden van de buis met een hemostats en sluit de aan / uit kleppen. </li><li> Maak de ingang uiteinde van de slang van de injectiespuit. </li><li> Plaats glas worden aangesloten op beide uiteinden van de buizen en verwijder de hemostats. </li><li> Vul top flacon met filter steriled gedeïoniseerd water. </li><li> Plaats het deksel van een 35 mm steriele schaal in de basis van een 100 mm steriele gerecht </li><li> Plaats chip op het deksel 35 mm en deksel met 100 mm schaal deksel. </li><li> Afbeelding chips dat de membraan en opening van de chips zijn vrij van vuil en / of luchtbellen. In ons laboratorium wij een opstaande microscoop 20x lange werkafstand doel te gebruiken. </li><li> Als er stof en / of luchtbellen aanwezig zijn, herhaaldelijk spoelen vloeibare kanaal en top flacon. Indien het puin en / of lucht kan worden verwijderd chip verwijderd. </li><li> Zodra de chipsafgebeeld, terug te keren naar laminaire stroming kap en trek beide uiteinden van de buizen. </li><li> Bevestig een uiteinde van de slang aan op een onder druk spuit met fysiologische media. </li><li> Klem de uitgang van de buis met een hemostat </li><li> Open drukventiel, verwijder de hemostaat van de uitgang einde van de vloeistofcomponenten en spoel de vloeibare kanaal met fysiologische media </li><li> Om de ondergrondse vloeibare met fysiologische media spoelen, opent u de aan / uit kleppen en verwijder de hemostaat van de uitgang uiteinde van de slang. </li><li> Om de fysiologische media opdrijven door de opening, klemt u de uitgang van de buis met een hemostat. </li><li> Klem ingang uiteinde van de slang met een hemostat en sluit de aan / uit kleppen. </li><li> Verwijder de ingang uiteinde van de slang uit de spuit en steek beide uiteinden van de buis met glas pluggen. </li><li> Verwijder de hemostats. </li><li> Verwijder het water van boven flacon. </li><li> Vul de bovenste flacon met filter gesteriliseerd fysiologische media. </li><li>Plaats de chip terug in de 100 mm petrischaal. </li><li> Plaats de voet van een 35 mm schaal in de 100 mm schotel en vul deze met filter gesteriliseerd gedeïoniseerd water om de luchtvochtigheid te verrijken. </li><li> Dek de schaal af tot het tijd is voor plating </li></ul> 4. Cel beplating van slak neuronen De patch-clamp chips kunnen geschikt zijn voor verschillende preparaten. We zijn momenteel testen van onze chips met zoogdieren primaire corticale neuronen en hebben verkregen voorlopige resultaten met cellen gekweekt gedurende 14 dagen 7, wat erop wijst dat onze sterilisatie-protocol adequaat is en dat de chips zijn niet cytotoxisch in lange termijn culturen. Voor de toepassing van dit protocol werden slak neuronen gekozen omdat ze een eenvoudige, maar goed gevestigde model voor neuronale elektrofysiologie 11 te bestuderen, en het is met die cellen dat we de belangrijkste resultaten tot nu toe 10 verkregen. Gedetailleerde celisolatie en cultuur proceduresis eerder beschreven 12, 13. <ul type="disc"><li> Verwijder de buitenste schil van 2-3 maanden oud Lymnaea stagnalis met stompe pincet en Anesthetize dieren in Lymnaea zoutoplossing die 10% Listerine. Alle volgende stappen uitgevoerd aseptisch in een laminaire luchtstroom kap met gesteriliseerd dissectie apparatuur en oplossingen bij kamertemperatuur. </li><li> Vervang de fysiologische media in de vloeistofcomponenten met de juiste opname oplossing met behulp van een Eppendorf pipet. Bij Lymnaea neuronen oplossing bevat (in mM) 50 KCl, 5 MgCl2, 5 ethyleenbis (oxyethylenenitrilo) tetra-azijnzuur (EGTA) en 5 4 - (2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic zuur (HEPES, pH 7,4 , 130 mOsm) 14 </li><li> Speld de slakken in een Sylgard schaal gevuld met Lymnaea zoutoplossing en verwijder hele brein, zoals eerder beschreven 13 </li><li> Behandel de isolated hersenen in bepaalde media (DM) met trypsine enzym (0,2%, Sigma, Catalog # T-9201) gedurende 18 minuten gevolgd door behandeling in DM en trypsine inhibitor (Sigma, soja, Catalog # T-9003) gedurende 15 minuten. </li><li> Speld de hersenen in een kleine Sylgard schaal gevuld met een hoge osmolariteit gedefinieerde media (HODM - DM met glucose toegevoegd, 750 ul van 1 M glucose-oplossing om 20 mL DM). </li><li> Met behulp van fijne pincet en dissectie schaar, verwijder de buitenste en binnenste omhulsel van de ganglia van belang, het blootstellen van de neuronen. </li><li> Met behulp van een brand geslepen glazen pipet gevuld met HODM en bevestigd aan een injectiespuit zachtjes zuig de buurt van de cel van belang (linker pedaal dorsale 1) tot het neuron los van de hersenen en is geschorst in de pipet. </li><li> De glazen pipet wordt dan verplaatst en gedompeld in individuele neurochips waar zachte verwijdering van het micro-kan de neuronen om voorzichtig naar buiten worden gedrukt de pipet en geplaatst op de top van de individuele patch gaten op de chips.</li><li> Laat cellen ongestoord zitten minste 2 uur bij kamertemperatuur de bevestiging bevorderen de chip oppervlak rond de opening. </li></ul> 5. Elektrofysiologische registraties De chips aansluiten aan de versterker (in ons geval een Multiclamp 700B versterker, Molecular Devices, Foster City, CA, USA) <ul type="disc"><li> Plaats de oplossing in de vloeibare ondergrondse en de chip flacon met de juiste registratie oplossingen. Bij Lymnaea neuronen de bovenste cultuur kamers zijn gevuld met Lymnaea zoutoplossing (in mM: 51,3 NaCl, 1,7 KCl, 4 CaCl2 en 1.5 MgCl2) gebufferd tot pH 7,9 met HEPES 14. </li><li> Voor de stabiliteit, lijm de chip op een glasplaatje en het onder een microscoop te plaatsen. </li><li> Om de chip te sluiten op de versterker (in ons geval een Multiclamp 700B versterker, Molecular Devices, Foster City, CA, USA), snij een uiteinde van de slang en plaats een Silver draad die is aangesloten op de hoofd-fase. </li><li> Plaats de referentie-elektrode in de top flacon van de chip. </li><li> De chip is nu klaar voor opname. </li><li> Breng een 5 mV stap met de versterker om de totale weerstand te meten (R t) en bepalen de configuratie van de neuronen: cel-ingeschreven (R t&gt; 1 GΩ); whole-cell (Rt = 50-100 MΩ plus capacitieve transiënten, indicatieve van membraan scheuren over het diafragma), of geen zegel (R t &lt;5 MΩ). In onze laatste set van experimenten 10, 58% procent van de cellen met hoge weerstand afdichtingen had, en van die 80% van de cellen toonde opgewonden reacties. </li></ul> 6. Representatieve resultaten <ul type="disc"><li> Breng depolariserende stroompulsen (20 pA increment) het neuron (in dit geval LPeD1). </li><li> Houd het neuron bij Vm dicht bij haar rustpotentiaal (~ - 60 mV). </li><li> Houd u aan de antwoorden op deze depolariserende pulsen. Overschrijding actiepotentialen moetworden waargenomen als het neuron levensvatbaar is. </li><li> Figuur 4 toont een representatief resultaat dat in detail besproken in 14, 15. </li></ul><img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/3288/3288fig4.jpg" /> Figuur 4. Spanning reacties (top) een LPeD1 neuron aan graded reeks intracellulaire stroompulsen (onder). De stroompulsen werden op Vm = - 60mV. Problemen oplossen <ul type="disc"><li> Voordat plating, het beeld chips te bepalen of membraan en diafragma zijn vrij van vuil en geschikt voor plating. We maken gebruik van een rechte microscoop en een 20x lange werkafstand doelstelling. In onze laatste set van experimenten 1, werden 67% procent van de chips met succes voorbereid op die manier. </li><li> Als er stof en / of luchtbellen aanwezig zijn gooi-chip en probeer een andere. </li><li> Diverse oppervlaktebehandelingen (plasma) of coatings (PDL, PEI, etc.) kunnen worden geprobeerd, maar het succes kan zijn sterk afhankelijk van celtypegebruikt. </li><li> De samenstelling van de vloeibare (&quot;pipet&quot;) oplossing in kritieke voor de vorming van de giga-afdichting en de hele cellen. Pas oplossing, met aandacht voor osmolariteit, pH en ionische make-up. </li><li> Voor de langere termijn cultuur, te beginnen met de media in microfluïdische kanaal, schakel dan vóór pipetteer oplossing om de opname via de zachte zwaartekracht gevoede perfusie (~ 0,5 ml / min). </li></ul>

<ol>
	<li>Walz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch-Clamp+Analysis:+Advanced+Techniques.">Patch-Clamp Analysis: Advanced Techniques.</a> Neuromethods. , 38 (2007).</li><li>Neher, E., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-channel+currents+recorded+from+membrane+of+denervated+frog+muscle+fibers.">Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibers.</a> Nature. 260, 799-802 (1976).</li><li>Behrends, J. C., Fertig, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+14:+Planar+Patch-clamp.">Ch. 14: Planar Patch-clamp.</a> Neuromethods. , (2007).</li><li>Fertig, N., Tilke, A., Blick, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+integration+of+isolated+cell+membrane+patches+in+a+nanomachined+aperture.">Stable integration of isolated cell membrane patches in a nanomachined aperture.</a> Applied Physics Letters. 77, 1218-1220 (2000).</li><li>Dunlop, J., Bowlby, M., Peri, R., Vasilyev, D., Arias, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+electrophysiology:+an+emerging+paradigm+for+ion-channel+screening+and+hysiology.">High-throughput electrophysiology: an emerging paradigm for ion-channel screening and hysiology.</a> Nat. Rev. Drug. Discov. 7 (4), 358-368 (2008).</li><li>Py, C., Denhoff, M., Martina, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+silicon+patch-clamp+chip+permits+high-fidelity+recording+of+ion+channel+activity+from+functionally+defined+neurons.">A novel silicon patch-clamp chip permits high-fidelity recording of ion channel activity from functionally defined neurons.</a> Biotechnology and Bioengineering. 107 (4), 593-600 (2010).</li><li>Martinez, D., Martina, M., Kremer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+patch-clamp+chips+for+mammalian+cell+applications.">Development of patch-clamp chips for mammalian cell applications.</a> Micro and Nanosystems. 2 (4), (2010).</li><li>Py, C., Salim, D., Monette, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+to+aperture+interaction+in+patch-clamp+chips+visualized+by+fluorescence+microscopy+and+focused-ion+beam+sections.">Cell to aperture interaction in patch-clamp chips visualized by fluorescence microscopy and focused-ion beam sections.</a> Biotechnology &#38; Bioengineering. 108, 1395-1403 (2011).</li><li>Martina, M., Luk, C., Py, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrogation+of+Cultured+Neurons+using+Patch-Clamp+Chips.">Interrogation of Cultured Neurons using Patch-Clamp Chips.</a> Journal of Neural Engineering. 8, 034002 (2011).</li><li>Bell, H. J., Syed, N. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-induced+modulation+of+the+respiratory+CPG.">Hypoxia-induced modulation of the respiratory CPG.</a> Frontiers in bioscience : a journal and virtual library. 14, 3825-3835 (2009).</li><li>Syed, N. I., Bulloch, A. G. M., Lukowiak, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+reconstruction+of+the+respiratory+central+pattern+generator+of+the+mollusk+Lymnaea.">In vitro reconstruction of the respiratory central pattern generator of the mollusk Lymnaea.</a> Science. 250, 282-285 (1990).</li><li>Syed, N. I., Zaidi, H., Lovell, P., Windhorst, U., Johansson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+reconstruction+of+neuronal+circuits:+A+simple+model+system+approach.">In vitro reconstruction of neuronal circuits: A simple model system approach.</a> Modern techniques in neuroscience research. , (1999).</li><li>Martina, M., Luk, C., Py, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrogation+of+Cultured+Neurons+using+Patch-Clamp+Chips.">Interrogation of Cultured Neurons using Patch-Clamp Chips.</a> Journal of Neural Engineering. 8, 034002 (2011).</li><li>Py, C., Denhoff, M., Martina, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silicon+patch-clamp+chip+suitable+for+high-fidelity+recording+of+ion+channel+activity+from+cultured+neurons.">Silicon patch-clamp chip suitable for high-fidelity recording of ion channel activity from cultured neurons.</a> Biotechnology and Bioengineering. 107 (4), (2010).</li><li>Ong, W. -. L., Yobas, L., Ong, W. -. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+missing+factor+in+chip-based+patch+clamp+assay:+gigaseal.">A missing factor in chip-based patch clamp assay: gigaseal.</a> Journal of Physics: Conference Series. 34, 187 (2006).</li><li>Charrier, A., Martinez, D., Monette, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+placement+and+guidance+on+substrates+for+neurochip+interfaces.">Cell placement and guidance on substrates for neurochip interfaces.</a> Biotechnology and Bioengineering. 105, 368-373 (2010).</li><li>Diaz-Quijada, D., Maynard, C. C. o. m. a. s., Monette, T., Py, R., A, C. K. r. a. n. t. i. s., Mealing, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+Patterning+with+Chemisorbed+Chemical+Cues+for+Advancing+Neurochip+Applications.">Surface Patterning with Chemisorbed Chemical Cues for Advancing Neurochip Applications.</a> Industrial &#38; Engineering Chemistry Research. 50 (17), 10029-10035 (2011).</li><li>Martinez, D., Py, C., Denhoff, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-fidelity+patch-clamp+recordings+from+neurons+cultured+on+a+polymer+microchip.">High-fidelity patch-clamp recordings from neurons cultured on a polymer microchip.</a> Biomedical Microdevices. 12, 977-97 (2010).</li><li>Taketani, M., Baudry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Advances in Network Electrophysiology: Using Multi-Electrode Arrays. , (2006).</li></ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

NRCC&#39;s patch-clamp chip ondervraging platform is een potentieel krachtig hulpmiddel voor hoge informatie-inhoud farmaceutische testen en te onderzoeken in vitro modellen van de ziekte. De voordelen ten opzichte van glas pipetten een laag toegang weerstand, die een voordeel grote cellen probe, en ondanks een iets grotere capaciteit resulteert in dynamiek vergelijkbare kleinere cellen. Spontane cel om diafragma zegels zijn routinematig verkregen, en hele celinvoer is waargenomen dat spontane 14 te zijn. Een duidelijk verschil tussen chips en het glas pipet methode is dat de probe deel van de cel kweekschaal en niet handmatig in contact gebracht met de celmembraan. Het kweken van cellen, eventueel van functionele netwerken, resulteert in biologisch relevante modellen ziektemodellen en een ander mechanisme voor het vastzetten hoge cel sonde afdichtingen 16. Echter, in tegenstelling tot celsuspensies, aspiratie cannot worden gebruikt om een ​​cel op de sonde positioneren. Slak neuronen, zoals andere grote cellen, vatbaar zijn voor manuele positionering van de sonde. Voor kleinere cellen die een langere tijd cultuur hebben wij overbodig maakte een manipulatie en houdt een grote kans op het verkrijgen van een afdichting met patronen hechting Polypeptiden bovenop de probes cellen bovenop de probes en aangetoond plaatsing van cellen op de probe 17,18. NRCC wordt ook aan een polyimide microfluïdisch patch-clamp chip 19 met een capaciteit vergelijkbaar met die van glas pipet. Het uiteindelijke doel van dat project is een multiple-probes patch-clamp-chip die het mogelijk maakt de gelijktijdige controle van de elektrofysiologische activiteit van een aantal neuronen betrokken zijn in het netwerk van gedrag bij de resolutie van de individuele ionkanalen 14. Deze methode is een hoge resolutie complementaire methode multi-elektrode arrays 20.

culturing and electrophysiology of cells on nrcc patch-clamp chips

Door zijn uitstekende gevoeligheid en het vermogen om te bewaken en controleren van individuele cellen op het niveau van ionkanalen, patch-spannen is de gouden standaard van elektrofysiologie toegepast op de ziekte-modellen en farmaceutische schermen zowel 1. De werkwijze omvat gewoonlijk zacht contact brengen van een cel met een glazen pipet opgevuld met een fysiologische oplossing om een stuk het membraan isoleren onder de top 2. Een elektrode geplaatst in de pipet legt ionkanaal activiteit in het membraan pleister of wanneer gescheurd voor de gehele cel. In het laatste decennium patch-clamp chips zijn voorgesteld als alternatief 3, 4: een onderbroken film scheidt de fysiologische medium uit het kweekmedium en een opening in de film microfabricated vervangt de top van de pipet. Patch-clamp chips zijn geïntegreerd in geautomatiseerde systemen en op de markt voor high-throughput screening 5. Om incrgemakkelijk doorvoer zij omvatten de vloeibare levering van cellen van suspensie, de positie van het diafragma door afzuigen en geautomatiseerde routines cel-probe afdichtingen detecteren en sluiten gehele cel mode. We hebben gerapporteerd over de fabricage van een silicium patch-clamp chip met geoptimaliseerde impedantie en opening vorm die de hoge kwaliteit opname van actiepotentialen in gekweekte neuronen slak 6 toelaat, onlangs hebben we ook gemeld vooruitgang op weg naar het ondervragen van zoogdieren neuronen 7. Onze patch-clamp chips worden vervaardigd op de Canadese Photonics Fabrication Center 8, een commerciële gieterij, en zijn verkrijgbaar in grote series. We staan ​​te popelen om deel te nemen in samenwerking met elektrofysiologen het gebruik van de NRCC technologie in verschillende modellen te valideren. De chips worden gebruikt volgens de algemene regeling in figuur 1 weergegeven: de chip is aan de bodem van een plexiglas cultuur flacon en de achterzijde van de opening is verbonden met een ondergrondse-zendersel uitgerust met buizen aan weerszijden van het pakket. Cellen gekweekt in de flacon de cel van de sonde wordt bewaakt door een meetelectrode opgenomen in de twee buitenste channel.The vloeibare poorten oplossing, gemakkelijker met minimale verstoring van de cel is een voordeel ten opzichte van glas pipetten voor intracellulaire perfusie. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3288/3288fig1.jpg" /> Figuur 1. Principe van de meting met behulp van de NRCC patch-clamp-chip We detail hier de protocollen te steriliseren en ontluchten van de chips, ze laden met medium, plaat ze met cellen, en uiteindelijk deze te gebruiken voor elektrofysiologische opnamen.

Watch this Scientific Journal Video about Culturing and Electrophysiology of Cells on NRCC Patch-clamp Chips at JoVE.com

Culturing and Electrophysiology of Cells on NRCC Patch-clamp Chips

We laten zien hoe vlakke patch-clamp chips gefabriceerd op de National Research Council of Canada worden gesteriliseerd, gegrond, geladen met medium, bedekt met cellen, en gebruikt voor elektrofysiologische opnamen.

Kweken en Elektrofysiologie van cellen op NRCC Patch-clamp Chips

Due to its exquisite sensitivity and the ability to monitor and control individual cells at the level of ion channels, patch-clamping is the gold standard ...

culturing-and-electrophysiology-of-cells-on-nrcc-patch-clamp-chips

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

Patch clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated from a variety of species have been described previously1-4 but this video represents the first application of those techniques to hair cells from zebrafish. Here we demonstrate a method to isolate healthy, intact hair cells from all of the inner ear end-organs: saccule, lagena, utricle and semicircular canals. Further, we demonstrate the diversity in hair cell size and morphology and give an example of the kinds of patch clamp recordings that can be obtained. The advantage of the use of this zebrafish model system over others stems from the availability of zebrafish mutants that affect both hearing and balance. In combination with the use of transgenic lines and other techniques that utilize genetic analysis and manipulation, the cell isolation and electrophysiological methods introduced here should facilitate greater insight into the roles hair cells play in mediating these sensory modalities.

The purpose of this video is to demonstrate procedures for obtaining healthy, intact hair cells from the inner ear organs of adult zebrafish and then using them for patch clamp studies aimed at characterizing the biophysical properties of their voltage-gated channels.

Patch Clamp Opnamen in Binnen-oorhaar cellen geïsoleerd uit zebravis

Patch  clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated  from a variety of species have been described previously1-4 but this  ...

Whole Cell Patch Clamp for Investigating the Mechanisms of Infrared Neural Stimulation

It has been demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to elicit electrical responses in neural tissue, independent of any further modification of the target tissue. Infrared neural stimulation has been reported in a variety of peripheral and sensory neural tissue in vivo, with particular interest shown in stimulation of neurons in the auditory nerve. However, while INS has been shown to work in these settings, the mechanism (or mechanisms) by which infrared light causes neural excitation is currently not well understood. The protocol presented here describes a whole cell patch clamp method designed to facilitate the investigation of infrared neural stimulation in cultured primary auditory neurons. By thoroughly characterizing the response of these cells to infrared laser illumination in vitro under controlled conditions, it may be possible to gain an improved understanding of the fundamental physical and biochemical processes underlying infrared neural stimulation.

Infrared nerve stimulation has been proposed as an alternative to electrical stimulation in a range of nerve types, including those associated with the auditory system. This protocol describes a patch clamp method for studying the mechanism of infrared nerve stimulation in a culture of primary auditory neurons.

Whole Cell Patch Clamp voor Onderzoek naar de mechanismen van Infrarood Neural Stimulatie

It has been  demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to  elicit electrical responses in neural tissue, independent of ...

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable history as a model of nervous system function, with particular significance in studies of learning and memory. The typical preparations for such studies are ones in which the sensory and motoneurons are left intact in a minimally dissected animal, or a technically elaborate neuronal co-culture of individual sensory and motoneurons. Less common is the isolated neuronal preparation in which small clusters of nominally homogeneous neurons are dissociated into single cells in short term culture. Such isolated cells are useful for the biophysical characterization of ion currents using patch clamp techniques, and targeted modulation of these conductances. A protocol for preparing such cultures is described. The protocol takes advantage of the easily identifiable glutamatergic sensory neurons of the pleural and buccal ganglia, and describes their dissociation and minimal maintenance in culture for several days without serum.

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

We describe the dissection of the nervous system of the marine sea hare Aplysia after anesthesia, the isolation of neurons for short term-tissue culture, and recordings of single cell ion currents via the patch clamp technique.

Isolatie van sensorische neuronen van<em&gt; Aplysia californica</em&gt; Voor Patch Clamp Recordings van Glutamaterge Currents

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable  history as a model of nervous system function, with particular significance in  studies ...

Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells

Mauthner cells (M-cells) are large reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key neurons involved in a characteristic behavior known as the C-start or escape response that occurs when the organism perceives a threat. The M-cell has been extensively studied in adult goldfish where it has been shown to receive a wide range of excitatory, inhibitory and neuromodulatory signals1. We have been examining M-cell activity in embryonic zebrafish in order to study aspects of synaptic development in a vertebrate preparation. In the late 1990s Ali and colleagues developed a preparation for patch clamp recording from M-cells in zebrafish embryos, in which the CNS was largely intact2,3,4. The objective at that time was to record synaptic activity from hindbrain neurons, spinal cord neurons and trunk skeletal muscle while maintaining functional synaptic connections within an intact brain-spinal cord preparation. This preparation is still used in our laboratory today. To examine the mechanisms underlying developmental synaptic plasticity, we record excitatory (AMPA and NMDA-mediated)5,6 and inhibitory (GABA and glycine) synaptic currents from developing M-cells. Importantly, this unique preparation allows us to return to the same cell (M-cell) from preparation to preparation to carefully examine synaptic plasticity and neuro-development in an embryonic organism. The benefits provided by this preparation include 1) intact, functional synaptic connections onto the M-cell, 2) relatively inexpensive preparations, 3) a large supply of readily available embryos 4) the ability to return to the same cell type (i.e. M-cell) in every preparation, so that synaptic development at the level of an individual cell can be examined from fish to fish, and 5) imaging of whole preparations due to the transparent nature of the embryos.

We have developed an intact brain-spinal cord preparation to record and monitor electrical activity via patch clamp recording from the Mauthner neurons and other reticulospinal cells in zebrafish embryos. Thus, we are able to record excitatory and inhibitory synaptic currents, voltage-gated channel activity and action potentials from key neurons in a developing embryo.

Patch Clamp Recordings van embryonale zebravis Mauthner Cells

Mauthner cells (M-cells) are large  reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key  neurons involved in a characteristic ...

A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System

The patch-clamp technique is today the most well-established method for recording electrical activity from individual neurons or their subcellular compartments. Nevertheless, achieving stable recordings, even from individual cells, remains a time-consuming procedure of considerable complexity. Automation of many steps in conjunction with efficient information display can greatly assist experimentalists in performing a larger number of recordings with greater reliability and in less time. In order to achieve large-scale recordings we concluded the most efficient approach is not to fully automatize the process but to simplify the experimental steps and reduce the chances of human error while efficiently incorporating the experimenter's experience and visual feedback. With these goals in mind we developed a computer-assisted system which centralizes all the controls necessary for a multi-electrode patch-clamp experiment in a single interface, a commercially available wireless gamepad, while displaying experiment related information and guidance cues on the computer screen. Here we describe the different components of the system which allowed us to reduce the time required for achieving the recording configuration and substantially increase the chances of successfully recording large numbers of neurons simultaneously.

Multi-electrode patch-clamp recordings constitute a complex task. Here we show how, by automating of many of the experimental steps, it is possible to accelerate the process leading to qualitative improvement in performance and number of recordings.

Een Computer-assisted Multi-elektrode Patch-clamp System

The patch-clamp technique is today the most  well-established method for recording electrical activity from individual  neurons or their subcellular ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal population (10-20%), but show a high level of physiological, morphological, and neurochemical heterogeneity, reflecting their diverse functions. Therefore, investigation of interneurons provides important insights into the organization principles and function of neuronal circuits. This, however, requires an integrated physiological and neuroanatomical approach for the selection and identification of individual interneuron types. Whole-cell patch-clamp recording from acute brain slices of transgenic animals, expressing fluorescent proteins under the promoters of interneuron-specific markers, provides an efficient method to target and electrophysiologically characterize intrinsic and synaptic properties of specific interneuron types. Combined with intracellular dye labeling, this approach can be extended with post-hoc morphological and immunocytochemical analysis, enabling systematic identification of recorded neurons. These methods can be tailored to suit a broad range of scientific questions regarding functional properties of diverse types of cortical neurons.

Cortical networks are controlled by a small, but diverse set of inhibitory interneurons. Functional investigation of interneurons therefore requires targeted recording and rigorous identification. Described here is a combined approach involving whole-cell recordings from single or synaptically-coupled pairs of neurons with intracellular labeling, post-hoc morphological and immunocytochemical analysis.

Whole-cell patch-clamp opnamen van Morphologically- en neurochemisch-geïdentificeerde hippocampus Interneurons

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

Whole-cell patch-clamp opnamen in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding these fundamental functions will shed light on the information transfer in these neurons. Dendritic patch-clamp recordings provide the possibility to directly examine the electrical properties of dendrites and underlying voltage-gated ion channels. However, these fine structures are not easily accessible to patch pipettes because of their small diameter. This report describes a step-by-step procedure to collect stable and reliable recordings from the dendrites of dopaminergic neurons in acute slices. Electrophysiological measurements are combined with post hoc recovery of cell morphology. Successful experiments rely on improved preparation of slices, solutions and pipettes, adequate adjustment of the optics and stability of the pipette in contact with the recorded structure. Standard principles of somatic patch-clamp recording are applied to dendrites but with a gentler approach of the pipette. These versatile techniques can be implemented to address various questions concerning the excitable properties of dendrites.

Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro.

Subcellulaire Patch-clamp opnamen in het somatodendritische Domein van nigrale Dopamine Neuronen

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding ...

Patch Clamp Recording of Starburst Amacrine Cells in a Flat-mount Preparation of Deafferentated Mouse Retina

The mammalian retina is a layered tissue composed of multiple neuronal types. To understand how visual signals are processed within its intricate synaptic network, electrophysiological recordings are frequently used to study connections among individual neurons. We have optimized a flat-mount preparation for patch clamp recording of genetically marked neurons in both GCL (ganglion cell layer) and INL (inner nuclear layer) of mouse retinas. Recording INL neurons in flat-mounts is favored over slices because both vertical and lateral connections are preserved in the former configuration, allowing retinal circuits with large lateral components to be studied. We have used this procedure to compare responses of mirror-partnered neurons in retinas such as the cholinergic starburst amacrine cells (SACs).

This protocol demonstrates how to perform whole-cell patch clamp recording on retinal neurons from a flat-mount preparation.

Patch Clamp Registratie van Starburst amacrine Cellen in een flat-mount voorbereiding van Deafferentated Mouse Retina

The mammalian retina is a layered tissue composed of multiple neuronal types. To understand how visual signals are processed within its intricate synaptic ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate electrical processes in target cells. In this context, ion selectivity of a channelrhodopsin is of particular importance. This article describes the investigation of chloride selectivity for a recently identified anion-conducting channelrhodopsin of Proteomonas sulcata via electrophysiological patch-clamp recordings on HEK293 cells. The experimental procedure for measuring light-gated photocurrents demands a fast switchable &#8211; ideally monochromatic &#8211; light source coupled into the microscope of an otherwise conventional patch-clamp setup. Preparative procedures prior to the experiment are outlined involving preparation of buffered solutions, considerations on liquid junction potentials, seeding and transfection of cells, and pulling of patch pipettes. The actual recording of current-voltage relations to determine the reversal potentials for different chloride concentrations takes place 24 h to 48 h after transfection. Finally, electrophysiological data are analyzed with respect to theoretical considerations of chloride conduction.

This article describes how the ion selectivity of channelrhodopsin is determined with electrophysiological whole-cell patch-clamp recordings using HEK293 cells. Here, the experimental procedure for investigating chloride selectivity of an anion-selective channelrhodopsin is demonstrated. However, the procedure is transferable to other channelrhodopsins of distinct selectivity.