Name: culturing and electrophysiology of cells on nrcc patch-clamp chips
Uploaded: 2012-02-07T12:00:00
Duration: 10 min 36 s
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Les auteurs tiennent à remercier Alexei Bogdanov pour la fabrication de patch-clamp de jetons au CCFDP et Hue Tran, Ping Zhao et Matthew Shiu pour assistance lors du montage. Naweed Syed a été pris en charge par un institut canadien de recherche en santé (IRSC) de subvention. Collin Luk est le récipiendaire du CRSNG et de l&#39;Alberta Heritage Foundation for Medical Research (AHFMR) bourses d&#39;études.

1. La fabrication de puces Le processus décrit dans 6 résultats dans un 3 um d&#39;épaisseur autonome film, une faible résistance 1 Mohm et un accès à surface lisse d&#39;entonnoir en forme qui facilite l&#39;ouverture d&#39;un sceau intime avec la cellule 9, voir la figure 2. Les puces sont individualisés et collées dans des emballages en plexiglas avec l&#39;ouverture face à un trou de connexion de la puce à un canal souterrain. Le collage est distribué d&#39;une manière qui minimise la capacité de dérivation pour une valeur nominale 17 pF. Les colis sont équipés de deux piles de 1,5 mm de diamètre et 6 mm tubes de verre longues que les ports fluidiques (Figure 3). <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3288/3288fig2.jpg" /> Figure 2. Microscope électronique à balayage d&#39;un faisceau d&#39;ions focalisé section d&#39;un SCGDV patch-clamp puce montre une surface de silicium lisse dioxyde de carbone et en forme d&#39;entonnoir qui favorise les contacts cellulaires intimes, et un orifice de faible profondeur qui représente une faible accès resistance. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3288/3288fig2.jpg" /> Figure 3. Une puce est collée au fond du flacon de culture dans un paquet de plexiglas équipé fluidique souterraines et des tubes de verre. 2. Stérilisation, l&#39;amorçage et les tests Les étapes suivantes doivent être effectuées dans une enceinte de sécurité biologique pour éviter la contamination ou de brancher de l&#39;ouverture. <ul type="disc"><li> Stériliser jetons dans un nettoyeur de base Harrick plasma (www.harrickplasma.com) avec une pression de 0.1 à 0.3 mbar air résiduel pendant 15 min à la puissance maximale de 18 W. Les autres systèmes de plasma d&#39;air peut être utilisé, avec une densité de puissance comparable (24 mW / cm 3) et à maintenir le produit de la densité de puissance et la constante de temps. Le traitement par plasma rend aussi les puces hydrophile, qui facilite l&#39;amorçage. </li><li> Monter des tubes de verre avec tube stérile Laboratoire de silicone Silastic, 1mm x 2mm ID OD (Cole ParmerCat. # 96115 à 08), sur un côté 3inch, 1 pouce de l&#39;autre côté. </li><li> Remplissez fluidique à travers les tubes avec une solution stérile de tampon standard filtrée phosphate (PBS), en s&#39;assurant qu&#39;aucune bulle est piégée. </li><li> Clip du tube de silicone longtemps mise sous pression du PBS à partir du côté le plus court à 1 atm. Une piscine de PBS qui suinte à travers l&#39;ouverture pourrait être visible dans le flacon. Clip de l&#39;offre sous pression de la PBS et détacher le tube de silicone court à partir de cette offre. </li><li> Remplissez le flacon avec filtration PBS à l&#39;aide d&#39;une seringue. </li><li> Immerger une Ag / Ag: électrode de Cl dans le tube court et une contre-électrode dans le flacon. Un impédancemètre est utilisé pour confirmer que la résistance d&#39;accès se situe entre 300kohm et 3Mohm et la capacité de shunt est entre 10pF et 25pF. Une puce avec une diminution de la résistance est susceptible d&#39;avoir une fuite, et une capacité plus élevée est considérée comme impropre pour une utilisation comme il peut ne pas capturer les plus rapides la dynamique de l&#39;électrophysiologie de la cellule 6. Une puce avec une capacité plus faibleou une résistance plus élevée est considérée comme branché, mais il pourrait simplement s&#39;agir d&#39;une bulle est piégée dans l&#39;orifice. Certaines puces sont un nouveau test après 1H et constaté que l&#39;impédance électrochimique correcte. </li><li> Rincer le canal fluidique avec de l&#39;eau déminéralisée stérile; vider le flacon dessus et rincer avec le même, à deux reprises. </li><li> Immergez la puce emballé avec des tubes dans l&#39;eau fraîche désionisée stérile pendant 30 minutes puis de charger avec d&#39;autres puces dans un récipient stérile rempli avec de l&#39;eau déminéralisée stérile. Cela garantit que les puces restent hydrophile et protégés de toute contamination. </li></ul> 3. Préparation Chips dans le laboratoire de biologie cellulaire Les étapes suivantes sont effectuées dans une hotte laminaire HEPA filtré de flux en utilisant les techniques d&#39;asepsie, toutes les solutions utilisées dans cette procédure doit être filtrée stérilisés avant leur utilisation à l&#39;aide d&#39;un filtre 0.22μm. <ul type="disc"><li> Ouvrez un conteneur à puce sous une hotte laminaire HEPA filtré débit et retirer des jetons de container face vers le bas pour éviter l&#39;excavation éventuels contaminants flottants dans le flacon haut. </li><li> Rincer haut de flacon de 2x à puce avec l&#39;eau fraîchement filtrée désionisée stérile afin de retirer tous les débris résiduels de la surface de la puce. </li><li> Aspirer l&#39;eau stérile déionisée hors du flacon en haut. </li><li> Branchez une extrémité du tube silastic attaché à la chaîne fluidique à une seringue stérile sous pression contenant de l&#39;eau filtrée désionisée. Dans notre système, les seringues remplies de solution sont mis sous pression par la connexion à un réservoir d&#39;air comprimé réglé à 20 psi. Pour assurer la stérilité, l&#39;air est filtré (filtre de 0,22 um) avant l&#39;entrée dans la seringue et de notre système dispose également d&#39;une vanne de marche / arrêt qui nous permet d&#39;arrêter ou de faire pression en cas de besoin. </li><li> Utilisation d&#39;une pince hémostatique, serrer l&#39;extrémité de sortie de la tubulure. </li><li> Ouvrir le soupapes allumées / éteintes pour mettre sous pression la solution. </li><li> À rincer le fluide subterranen de la puce avec l&#39;eau fraîche déminéralisée stérile, déblocage l&#39;extrémité de sortie du tube. </li><li> Pour desCE l&#39;eau à travers l&#39;ouverture, fixer l&#39;extrémité de sortie de la tubulure avec une pince hémostatique. </li><li> Pour éviter le drainage de l&#39;eau, serrer les extrémités d&#39;entrée et de sortie de la tubulure avec une pince à bec et fermer la marche / arrêt vannes. </li><li> Détachez l&#39;extrémité d&#39;entrée du tube de la seringue. </li><li> Insérer les bouchons de verre dans les deux extrémités du tube et enlever les pinces hémostatiques. </li><li> Remplissez le flacon avec de l&#39;eau dessus steriled filtre désionisée. </li><li> Placer le couvercle d&#39;une boîte de 35 mm stérile dans la base d&#39;un plat de 100 mm stérile </li><li> Puce Déposer sur le dessus du couvercle de 35 mm et la couverture avec 100 couvercle de boîte de mm. </li><li> Puces d&#39;image afin de s&#39;assurer que la membrane et l&#39;ouverture des puces sont exempts de débris et / ou des bulles d&#39;air. Dans notre laboratoire, nous utilisons un microscope droit et un objectif 20x longue distance de travail. </li><li> Si des débris et / ou des bulles d&#39;air sont présents, à plusieurs reprises rincer le canal fluidique et le flacon haut. Si les débris et / ou des bulles d&#39;air ne peuvent pas être enlevé de la puce est éliminé. </li><li> Une fois que les puces sontimagé, retourner à hotte à écoulement laminaire et débrancher les deux extrémités de la tubulure. </li><li> Attacher une extrémité de la tubulure à une seringue sous pression contenant les milieux physiologiques. </li><li> Serrer l&#39;extrémité de sortie de la tubulure avec une pince hémostatique </li><li> Ouvrir la vanne de pression, retirer la pince hémostatique de l&#39;extrémité de sortie de la fluidique et rincer le canal fluidique avec les milieux physiologiques </li><li> À rincer le fluide souterrain avec les milieux physiologiques, ouvrir le soupapes allumées / éteintes et enlever la pince hémostatique de l&#39;extrémité de sortie de la tubulure. </li><li> Pour forcer les milieux physiologiques à travers l&#39;ouverture, fixer l&#39;extrémité de sortie de la tubulure avec une pince hémostatique. </li><li> Pince extrémité d&#39;entrée de la tubulure avec une pince hémostatique et fermer l&#39;soupapes allumées / éteintes. </li><li> Retirez l&#39;extrémité d&#39;entrée du tube de la seringue et branchez les deux extrémités du tube avec des bouchons glas. </li><li> Retirer les pinces hémostatiques. </li><li> Enlevez l&#39;eau du flacon en haut. </li><li> Remplissez le flacon dessus avec filtre stérilisés milieux physiologiques. </li><li>Placez le dos à puce dans le plat de 100 mm de Petri. </li><li> Placer la base d&#39;un plat de 35 mm dans la boîte de 100 mm et le remplir avec de l&#39;eau désionisée filtre stérilisé pour enrichir l&#39;humidité. </li><li> Couvrir le plat jusqu&#39;à ce qu&#39;il soit temps pour le placage </li></ul> 4. Placage cellulaire des neurones d&#39;escargots Les puces de patch-clamp peut être approprié pour une variété de préparations. Nous sommes en train de tester nos puces avec des mammifères primaires neurones corticaux et ont obtenu des résultats préliminaires avec des cellules cultivées pendant 14 jours 7, qui indique que notre protocole de stérilisation est adéquate et que les puces ne sont pas cytotoxiques à long terme des cultures. Pour l&#39;application de ce protocole, les neurones d&#39;escargots ont été choisis parce qu&#39;ils représentent un modèle simple, mais bien établie pour étudier neuronale électrophysiologie 11, et c&#39;est avec ces cellules que nous avons obtenu les résultats les plus significatifs à ce jour 10. L&#39;isolement des cellules et des procédures détaillées de la culture ontété décrit précédemment 12, 13. <ul type="disc"><li> Retirer la coquille externe de 2-3 mois Lymnaea stagnalis vieux forceps émoussé et les animaux anesthésier dans une solution saline contenant Lymnaea Listerine 10%. Toutes les étapes subséquentes réalisée de manière aseptique à l&#39;intérieur d&#39;une hotte flux d&#39;air laminaire avec un équipement de dissection stérilisé et des solutions à la température ambiante. </li><li> Remplacer les milieux physiologiques dans les fluidique avec la solution d&#39;enregistrement approprié à l&#39;aide d&#39;une pipette Eppendorf. Dans le cas de neurones Lymnaea la solution contient (en mM): 50 KCl, MgCl 2 5, 5 éthylènebis (oxyéthylènenitrilo) tétraacétique (EGTA) et 5 4 - (2-hydroxyéthyl)-1-pipérazineéthanesulfonique (HEPES; pH 7,4 , 130 mOsm) 14 </li><li> Epingler les escargots dans un plat rempli de Sylgard Lymnaea une solution saline et de supprimer cerveau entier tel que décrit précédemment 13 </li><li> Traiter le isolatcerveaux éd dans les médias définis (DM) avec trypsine (solution à 0,2%, Sigma, catalogue # T-9201) pour 18 minutes, suivie par un traitement en DM et inhibiteur de la trypsine (Sigma, de soja, Catalogue # T-9003) pendant 15 minutes. </li><li> Epingler les cerveaux dans un plat rempli de Sylgard petite osmolarité élevée définie médias (HODM - DM avec le glucose ajouté, 750 pi de solution de glucose 1M à 20 ml de DM). </li><li> En utilisant des pinces fines et les ciseaux de dissection, retirer la gaine extérieure et intérieure des ganglions de l&#39;intérêt, d&#39;exposer les neurones. </li><li> En utilisant une pipette en verre poli feu rempli de HODM et attaché à une microseringue, appliquer une aspiration douce près de la cellule d&#39;intérêt (gauche dorsale pédale 1) jusqu&#39;à ce que le neurone se détache du cerveau et est suspendu dans la pipette. </li><li> La pipette de verre est ensuite déplacé et trempée dans neuropuces individuels lorsque l&#39;éloignement de la douceur microseringue permet aux neurones d&#39;être légèrement poussé hors de la pipette et placé au-dessus des trous de raccordement individuels sur les puces.</li><li> Laisser les cellules tranquille pendant un minimum de 2h à température ambiante afin de promouvoir leur attachement à la surface de la puce qui entoure l&#39;ouverture. </li></ul> 5. Des enregistrements électrophysiologiques Pour connecter les puces à l&#39;amplificateur (dans notre cas un amplificateur Multiclamp 700B, Molecular Devices, Foster City, CA, Etats-Unis) <ul type="disc"><li> Remplacer la solution dans le fluide souterrain et dans le flacon puce avec les solutions d&#39;enregistrement appropriées. Dans le cas de neurones Lymnaea, les chambres de culture supérieures sont remplis d&#39;une solution saline Lymnaea (en mM: 51,3 NaCl, KCl 1,7, 4 CaCl 2, MgCl 2 et 1,5) tamponnée à un pH de 7,9 à 14 HEPES. </li><li> Pour plus de stabilité, de la colle la puce sur une lame de verre et le placer sous un microscope. </li><li> Pour connecter la puce à l&#39;amplificateur (dans notre cas un amplificateur Multiclamp 700B, Molecular Devices, Foster City, CA, Etats-Unis), couper un bout du tube et insérez une SilveFil r qui est relié à la tête-étape. </li><li> Placer l&#39;électrode de référence dans le flacon supérieure de la puce. </li><li> La puce est maintenant prêt pour l&#39;enregistrement. </li><li> Appliquer une étape 5 mV avec l&#39;amplificateur pour mesurer la résistance totale (R t) et déterminer la configuration des neurones: cellule attenante (R t&gt; 1 GQ); cellules entières (Rt = 50-100 transitoires MQ ainsi capacitif, ce qui indique la rupture des membranes sur l&#39;ouverture), ou pas de sceau (R t &lt;5 MW). Dans notre dernière série d&#39;expériences 10, 58 pour cent% des cellules avaient joints à haute résistance et, de ceux, 80% des cellules ont montré des réponses excitables. </li></ul> 6. Les résultats représentatifs <ul type="disc"><li> Appliquer dépolarisant impulsions de courant (20 incrément pA) au neurone (dans ce cas LPeD1). </li><li> Tenez le neurone à près Vm à son potentiel de repos (~ - 60 mV). </li><li> Observez les réponses à ces impulsions dépolarisantes. Potentiels d&#39;action devrait surréactionêtre observé si le neurone est viable. </li><li> La figure 4 montre un résultat représentatif qui est discuté en détail dans les 14, 15. </li></ul><img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/3288/3288fig4.jpg" /> Réponses de tension Figure 4. (En haut) d&#39;un neurone à LPeD1 série graduée de intracellulaires des impulsions de courant (ci-dessous). Les impulsions de courant ont été appliqués à Vm = - 60 mV. Dépannage <ul type="disc"><li> Avant de placage, copeaux d&#39;image pour déterminer si la membrane et l&#39;ouverture sont exempts de débris et adapté pour le placage. Nous utilisons un microscope droit et un objectif 20x longue distance de travail. Dans notre dernière série d&#39;expériences 1, 67 pour cent% de copeaux ont été amorcée avec succès de cette manière. </li><li> Si des débris et / ou des bulles d&#39;air sont présents jetez puce et essayer un autre. </li><li> Divers traitements de surface (plasma) ou revêtements (PDL, PEI, etc) peut être essayé, mais le succès peut être très dépendant de type de celluleutilisée. </li><li> La composition de la fluidique (&quot;pipette&quot;) dans une solution critique pour la formation de la giga-joint et l&#39;ensemble de cellules-. Ajuster la solution, en accordant une attention à l&#39;osmolarité, le pH, et le maquillage ionique. </li><li> Pour la culture à plus long terme, commencer par les médias dans le canal microfluidique, puis passer à pipeter une solution avant l&#39;enregistrement par la gravité de perfusion douce alimenté (~ 0,5 ml / min). </li></ul>

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Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

SCGDV patch-clamp plate-forme d&#39;interrogation à puce est un outil potentiellement puissant pour haute dosages contenu de l&#39;information pharmaceutiques et d&#39;enquêter sur des modèles in vitro de la maladie. Ses avantages par rapport aux pipettes en verre sont une résistance faible accès, qui est un avantage pour sonder les grandes cellules, et en dépit d&#39;une capacité un peu plus grande se traduira par la dynamique comparables pour les petites cellules. Cellulaire spontanée à joints d&#39;ouverture ont été obtenus en routine, et l&#39;entrée de cellules entières a été observé que 14 spontanée. Un nette différence entre les puces et la méthode de pipette de verre est le fait que la sonde est une partie de la boîte de culture cellulaire et n&#39;est pas manuellement mis en contact avec la membrane cellulaire. La culture de cellules, peut-être une partie de réseaux fonctionnels, les résultats dans des modèles plus biologiquement pertinentes comme modèles de maladies, et un mécanisme différent pour obtenir des cellules haute pour sonder les phoques 16. Cependant, par contraste avec des suspensions cellulaires aspiration, Canot être utilisé pour positionner une cellule sur la sonde. Neurones d&#39;escargots, comme d&#39;autres grandes cellules, se prêtent à un positionnement manuel sur le dessus de la sonde. Pour le placement des cellules plus petites nécessitant des temps de culture plus longues, nous avons éliminé la nécessité de toute manipulation et de garder une forte probabilité de l&#39;obtention d&#39;un joint d&#39;étanchéité par des polypeptides d&#39;adhésion de structuration sur le dessus des sondes pour placer les cellules au-dessus des sondes, et a démontré des cellules sur le sonde 17,18. SCGDV développe aussi un polyimide microfluidique patch-clamp puce 19 avec une capacité comparable à celle du verre de pipette. Le but ultime de ce projet est un multiple des sondes de patch-clamp à puce qui permet le contrôle simultané de l&#39;activité électrophysiologique des neurones engagés dans plusieurs comportement du réseau à la résolution des canaux ioniques individuels 14. Cette méthode est une méthode complémentaire à haute résolution réseaux d&#39;électrodes multi-20.

culturing and electrophysiology of cells on nrcc patch-clamp chips

En raison de sa sensibilité exquise et la capacité de surveiller et de contrôler des cellules individuelles au niveau des canaux ioniques, patch-clamp est l&#39;étalon-or de l&#39;électrophysiologie appliquée aux modèles de maladies et les écrans aussi bien pharmaceutiques 1. La méthode implique traditionnellement doucement en contact une cellule avec une pipette en verre remplie d&#39;une solution physiologique dans le but d&#39;isoler une parcelle de la membrane sous son sommet 2. Une électrode inséré dans la pipette capture d&#39;ions de canal activité dans la pièce de membrane ou, lorsque la rupture, pour la cellule entière. Dans la dernière décennie, de patch-clamp puces ont été proposés comme une alternative 3, 4: un film en suspension sépare le milieu physiologique du milieu de culture, et une ouverture microfabriqué dans le film remplace le sommet de la pipette. Patch-clamp puces ont été intégrés dans les systèmes automatisés et commercialisées pour criblage à haut débit 5. Pour incrla facilité de débit, ils comprennent la livraison fluidique de cellules provenant de la suspension, leur positionnement sur l&#39;ouverture par aspiration, et des routines automatisées pour détecter cellule-à-sonde joints, entrer en mode cellule entière. Nous avons présenté un rapport sur ​​la fabrication d&#39;un silicium de patch-clamp puce avec une impédance optimale et la forme orifice qui permet l&#39;enregistrement de haute qualité de potentiels d&#39;action dans les neurones d&#39;escargots d&#39;élevage 6; récemment, nous avons également fait état ​​de progrès vers l&#39;interrogation neurones de mammifères 7. Nos patch-clamp puces sont fabriquées au Centre canadien de fabrication de dispositifs photoniques 8, une fonderie commerciale, et sont disponibles en grande série. Nous sommes désireux de s&#39;engager dans des collaborations avec des électrophysiologistes pour valider l&#39;utilisation de la technologie CNRC dans différents modèles. Les copeaux sont utilisées selon le schéma général représenté dans la figure 1: la puce de silicium est au fond d&#39;un flacon de culture plexiglas et l&#39;arrière de l&#39;ouverture est reliée à une souterraine Channel munie de tubes à chaque extrémité de l&#39;emballage. Les cellules sont cultivées dans le flacon et la cellule au-dessus de la sonde est contrôlée par une électrode de mesure insérée dans les deux channel.The en dehors des ports fluidiques faciliter l&#39;échange d&#39;une solution avec une perturbation minimale de la cellule, ce qui est un avantage par rapport aux pipettes en verre pour intracellulaire perfusion. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3288/3288fig1.jpg" /> Figure 1. Principe de la mesure à l&#39;aide de la SCGDV patch-clamp puce Nous détaillons ici les protocoles de stérilisation et d&#39;amorcer les puces, les charger avec le milieu, la plaque entre eux avec des cellules, et enfin les utiliser pour les enregistrements électrophysiologiques.

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Culturing and Electrophysiology of Cells on NRCC Patch-clamp Chips

Nous montrons comment plane de patch-clamp puces fabriquées au sein du Conseil national de recherches du Canada sont stérilisés, apprêté, chargé avec le milieu, plaqué avec des cellules, et utilisé pour les enregistrements électrophysiologiques.

La culture et l&#39;électrophysiologie des cellules sur la SCGDV de patch-clamp Chips

Due to its exquisite sensitivity and the ability to monitor and control individual cells at the level of ion channels, patch-clamping is the gold standard ...

culturing-and-electrophysiology-of-cells-on-nrcc-patch-clamp-chips

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

Patch clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated from a variety of species have been described previously1-4 but this video represents the first application of those techniques to hair cells from zebrafish. Here we demonstrate a method to isolate healthy, intact hair cells from all of the inner ear end-organs: saccule, lagena, utricle and semicircular canals. Further, we demonstrate the diversity in hair cell size and morphology and give an example of the kinds of patch clamp recordings that can be obtained. The advantage of the use of this zebrafish model system over others stems from the availability of zebrafish mutants that affect both hearing and balance. In combination with the use of transgenic lines and other techniques that utilize genetic analysis and manipulation, the cell isolation and electrophysiological methods introduced here should facilitate greater insight into the roles hair cells play in mediating these sensory modalities.

The purpose of this video is to demonstrate procedures for obtaining healthy, intact hair cells from the inner ear organs of adult zebrafish and then using them for patch clamp studies aimed at characterizing the biophysical properties of their voltage-gated channels.

Les enregistrements de patch-clamp en cellules ciliées de l&#39;oreille Isolé du poisson zèbre

Patch  clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated  from a variety of species have been described previously1-4 but this  ...

Recherche

Neurosciences

Whole Cell Patch Clamp for Investigating the Mechanisms of Infrared Neural Stimulation

It has been demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to elicit electrical responses in neural tissue, independent of any further modification of the target tissue. Infrared neural stimulation has been reported in a variety of peripheral and sensory neural tissue in vivo, with particular interest shown in stimulation of neurons in the auditory nerve. However, while INS has been shown to work in these settings, the mechanism (or mechanisms) by which infrared light causes neural excitation is currently not well understood. The protocol presented here describes a whole cell patch clamp method designed to facilitate the investigation of infrared neural stimulation in cultured primary auditory neurons. By thoroughly characterizing the response of these cells to infrared laser illumination in vitro under controlled conditions, it may be possible to gain an improved understanding of the fundamental physical and biochemical processes underlying infrared neural stimulation.

Infrared nerve stimulation has been proposed as an alternative to electrical stimulation in a range of nerve types, including those associated with the auditory system. This protocol describes a patch clamp method for studying the mechanism of infrared nerve stimulation in a culture of primary auditory neurons.

Whole Patch Clamp cellulaire pour étudier les mécanismes de la stimulation neurale infrarouge

It has been  demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to  elicit electrical responses in neural tissue, independent of ...

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable history as a model of nervous system function, with particular significance in studies of learning and memory. The typical preparations for such studies are ones in which the sensory and motoneurons are left intact in a minimally dissected animal, or a technically elaborate neuronal co-culture of individual sensory and motoneurons. Less common is the isolated neuronal preparation in which small clusters of nominally homogeneous neurons are dissociated into single cells in short term culture. Such isolated cells are useful for the biophysical characterization of ion currents using patch clamp techniques, and targeted modulation of these conductances. A protocol for preparing such cultures is described. The protocol takes advantage of the easily identifiable glutamatergic sensory neurons of the pleural and buccal ganglia, and describes their dissociation and minimal maintenance in culture for several days without serum.

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

We describe the dissection of the nervous system of the marine sea hare Aplysia after anesthesia, the isolation of neurons for short term-tissue culture, and recordings of single cell ion currents via the patch clamp technique.

Isolation des neurones sensoriels de<em&gt; Aplysia californica</em&gt; Patch pour les enregistrements de serrage des courants glutamatergiques

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable  history as a model of nervous system function, with particular significance in  studies ...

Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells

Mauthner cells (M-cells) are large reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key neurons involved in a characteristic behavior known as the C-start or escape response that occurs when the organism perceives a threat. The M-cell has been extensively studied in adult goldfish where it has been shown to receive a wide range of excitatory, inhibitory and neuromodulatory signals1. We have been examining M-cell activity in embryonic zebrafish in order to study aspects of synaptic development in a vertebrate preparation. In the late 1990s Ali and colleagues developed a preparation for patch clamp recording from M-cells in zebrafish embryos, in which the CNS was largely intact2,3,4. The objective at that time was to record synaptic activity from hindbrain neurons, spinal cord neurons and trunk skeletal muscle while maintaining functional synaptic connections within an intact brain-spinal cord preparation. This preparation is still used in our laboratory today. To examine the mechanisms underlying developmental synaptic plasticity, we record excitatory (AMPA and NMDA-mediated)5,6 and inhibitory (GABA and glycine) synaptic currents from developing M-cells. Importantly, this unique preparation allows us to return to the same cell (M-cell) from preparation to preparation to carefully examine synaptic plasticity and neuro-development in an embryonic organism. The benefits provided by this preparation include 1) intact, functional synaptic connections onto the M-cell, 2) relatively inexpensive preparations, 3) a large supply of readily available embryos 4) the ability to return to the same cell type (i.e. M-cell) in every preparation, so that synaptic development at the level of an individual cell can be examined from fish to fish, and 5) imaging of whole preparations due to the transparent nature of the embryos.

We have developed an intact brain-spinal cord preparation to record and monitor electrical activity via patch clamp recording from the Mauthner neurons and other reticulospinal cells in zebrafish embryos. Thus, we are able to record excitatory and inhibitory synaptic currents, voltage-gated channel activity and action potentials from key neurons in a developing embryo.

Patch-clamp enregistrements de cellules embryonnaires de poisson zèbre Mauthner

Mauthner cells (M-cells) are large  reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key  neurons involved in a characteristic ...

A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System

The patch-clamp technique is today the most well-established method for recording electrical activity from individual neurons or their subcellular compartments. Nevertheless, achieving stable recordings, even from individual cells, remains a time-consuming procedure of considerable complexity. Automation of many steps in conjunction with efficient information display can greatly assist experimentalists in performing a larger number of recordings with greater reliability and in less time. In order to achieve large-scale recordings we concluded the most efficient approach is not to fully automatize the process but to simplify the experimental steps and reduce the chances of human error while efficiently incorporating the experimenter's experience and visual feedback. With these goals in mind we developed a computer-assisted system which centralizes all the controls necessary for a multi-electrode patch-clamp experiment in a single interface, a commercially available wireless gamepad, while displaying experiment related information and guidance cues on the computer screen. Here we describe the different components of the system which allowed us to reduce the time required for achieving the recording configuration and substantially increase the chances of successfully recording large numbers of neurons simultaneously.

Multi-electrode patch-clamp recordings constitute a complex task. Here we show how, by automating of many of the experimental steps, it is possible to accelerate the process leading to qualitative improvement in performance and number of recordings.

Un multi-électrode système de patch-clamp assistée par ordinateur

The patch-clamp technique is today the most  well-established method for recording electrical activity from individual  neurons or their subcellular ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal population (10-20%), but show a high level of physiological, morphological, and neurochemical heterogeneity, reflecting their diverse functions. Therefore, investigation of interneurons provides important insights into the organization principles and function of neuronal circuits. This, however, requires an integrated physiological and neuroanatomical approach for the selection and identification of individual interneuron types. Whole-cell patch-clamp recording from acute brain slices of transgenic animals, expressing fluorescent proteins under the promoters of interneuron-specific markers, provides an efficient method to target and electrophysiologically characterize intrinsic and synaptic properties of specific interneuron types. Combined with intracellular dye labeling, this approach can be extended with post-hoc morphological and immunocytochemical analysis, enabling systematic identification of recorded neurons. These methods can be tailored to suit a broad range of scientific questions regarding functional properties of diverse types of cortical neurons.

Cortical networks are controlled by a small, but diverse set of inhibitory interneurons. Functional investigation of interneurons therefore requires targeted recording and rigorous identification. Described here is a combined approach involving whole-cell recordings from single or synaptically-coupled pairs of neurons with intracellular labeling, post-hoc morphological and immunocytochemical analysis.

De cellules entières de patch-clamp enregistrements de Morphologically- et interneurones hippocampiques neurochemically identifiés

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

Recordings cellules entières Patch-clamp en tranches cérébrales

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding these fundamental functions will shed light on the information transfer in these neurons. Dendritic patch-clamp recordings provide the possibility to directly examine the electrical properties of dendrites and underlying voltage-gated ion channels. However, these fine structures are not easily accessible to patch pipettes because of their small diameter. This report describes a step-by-step procedure to collect stable and reliable recordings from the dendrites of dopaminergic neurons in acute slices. Electrophysiological measurements are combined with post hoc recovery of cell morphology. Successful experiments rely on improved preparation of slices, solutions and pipettes, adequate adjustment of the optics and stability of the pipette in contact with the recorded structure. Standard principles of somatic patch-clamp recording are applied to dendrites but with a gentler approach of the pipette. These versatile techniques can be implemented to address various questions concerning the excitable properties of dendrites.

Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro.

Subcellulaires Recordings Patch-clamp du Domaine somato de nigrales Dopamine Neurones

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding ...

Patch Clamp Recording of Starburst Amacrine Cells in a Flat-mount Preparation of Deafferentated Mouse Retina

The mammalian retina is a layered tissue composed of multiple neuronal types. To understand how visual signals are processed within its intricate synaptic network, electrophysiological recordings are frequently used to study connections among individual neurons. We have optimized a flat-mount preparation for patch clamp recording of genetically marked neurons in both GCL (ganglion cell layer) and INL (inner nuclear layer) of mouse retinas. Recording INL neurons in flat-mounts is favored over slices because both vertical and lateral connections are preserved in the former configuration, allowing retinal circuits with large lateral components to be studied. We have used this procedure to compare responses of mirror-partnered neurons in retinas such as the cholinergic starburst amacrine cells (SACs).

This protocol demonstrates how to perform whole-cell patch clamp recording on retinal neurons from a flat-mount preparation.

Patch Clamp Enregistrement de cellules amacrines Starburst dans un plat de montage Préparation de Deafferentated Souris Retina

The mammalian retina is a layered tissue composed of multiple neuronal types. To understand how visual signals are processed within its intricate synaptic ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate electrical processes in target cells. In this context, ion selectivity of a channelrhodopsin is of particular importance. This article describes the investigation of chloride selectivity for a recently identified anion-conducting channelrhodopsin of Proteomonas sulcata via electrophysiological patch-clamp recordings on HEK293 cells. The experimental procedure for measuring light-gated photocurrents demands a fast switchable &#8211; ideally monochromatic &#8211; light source coupled into the microscope of an otherwise conventional patch-clamp setup. Preparative procedures prior to the experiment are outlined involving preparation of buffered solutions, considerations on liquid junction potentials, seeding and transfection of cells, and pulling of patch pipettes. The actual recording of current-voltage relations to determine the reversal potentials for different chloride concentrations takes place 24 h to 48 h after transfection. Finally, electrophysiological data are analyzed with respect to theoretical considerations of chloride conduction.

This article describes how the ion selectivity of channelrhodopsin is determined with electrophysiological whole-cell patch-clamp recordings using HEK293 cells. Here, the experimental procedure for investigating chloride selectivity of an anion-selective channelrhodopsin is demonstrated. However, the procedure is transferable to other channelrhodopsins of distinct selectivity.