Name: culturing and electrophysiology of cells on nrcc patch-clamp chips
Uploaded: 2012-02-07T12:00:00
Duration: 10 min 36 s
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著者らは、アセンブリの支援についてはCPFCにおけるパッチクランプチップの製造のためのアレクセイBogdanov、色相トランは、Ping趙とマシュー·シウを承諾したがっています。 Naweed Syedさんは、保健研究所（CIHR）の助成金のカナダの研究所によってサポートされていました。コリンルックはNSERCと医学研究（AHFMR）studentshipsためのアルバータヘリテージ財団の受信者です。

1。チップ製造 3μmの厚さの自立膜を、低1MΩでアクセス抵抗とセル9との親密なシールを容易に滑面漏斗状の開口部6の結果に記載されたプロセスは、図2を参照してください。チップは、地下のチャネルにチップを接続する穴が直面している開口部とプレキシグラスパッケージに個片化と接着されています。接着は、公称17 pFのシャント容量を最小限に抑える方法で分配される。パッケージは2つの1.5 mm径と流体ポートを6 mm長のガラス管（図3）が取り付けられています。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3288/3288fig2.jpg" /> NRCCパッチクランプチップの集束イオンビームセクションの図2走査型電子顕微鏡写真は、滑らかな二酸化ケイ素表面と漏斗状の親密な細胞の接触を支持し、低アクセスresistancのアカウント浅いオリフィスを示しています。E。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3288/3288fig2.jpg" /> 図3チップは地下の流体とガラス管を装備しプレキシグラスパッケージで培養バイアルの底部に接着されています。 2。殺菌、プライミングとテスト 次の手順は、開口部の汚染や閉塞を避けるために、生物学の安全キャビネット内で実行する必要があります。 <ul type="disc"><li> 18 W.その他の空気プラズマシステムの最大電力で15分間0.1から0.3ミリバール残留空気の圧力でHarrick基本的なプラズマクリーナー（www.harrickplasma.com）にチップを滅菌匹敵する電力密度（24 mWので、使用することができ個/ cm 3）と、電力密度と時間の積を一定に保ちます。プラズマ処理はまた、プライミングを容易にする、チップは親水性がレンダリングされます。 </li><li>無菌のシラスティックラボラトリーシリコンチューブ、1ミリメートルID x 2mmのOD（コールパーマーとガラス管に適合猫。片側＃96115から08）、3インチ、反対側に1インチ。 </li><li>に気泡がトラップされていないことを確認し、滅菌濾過し、標準のリン酸緩衝液（PBS）とチューブを介して流体を記入してください。 </li><li> 1気圧の短辺からPBSを加圧しながら、長いシリコンチューブをクリップ。開口部を通って浸透PBSのプールは、バイアル中の目に見えるかもしれません。 PBSの加圧供給をクリップし、その電源から短いシリコンチューブを外します。 </li><li>シリンジを用いて濾過し、PBSでバイアルを記入してください。 </li><li> Clの短い管の電極とバイアル内の対向電極：銀/ Agを浸します。インピーダンスメーターはアクセス抵抗は300kohmと3Mohm間にあるとシャントキャパシタンスは10pFと25pFの間にあることを確認するために使用されています。低い抵抗を持ったチップはリークが発生する可能性があり、それは細胞の電気生理学6の最高速のダイナミクスを捉えることはできません、より高い静電容量は、使用のために不適切と見なされます。低静電容量を持つチップそれは単にバブルがオリフィスにトラップされているかもしれませんけれども以上の抵抗は、プラグインと見なされます。いくつかのチップは、1H後に再テストし、正しい電気化学インピーダンスを有することが明らかにされています。 </li><li>滅菌脱イオン水と流体チャネルをフラッシュし、バイアルを空にして二回、同じで洗い流してください。 </li><li>滅菌脱イオン水で満たされ、滅菌容器内に他のチップでロードして30分間新鮮な滅菌脱イオン水でチューブをパッケージ化チップを浸す。これは、チップは親水性と汚染から保護されたままであることを保証します。 </li></ul> 3。細胞生物学研究室のチップの準備 次の手順は無菌技術を使用してHEPAフィルタ層流フードで実行され、この手順で使用されているすべてのソリューションは、0.22μmフィルターを用いて使用前に滅菌ろ過しなければなりません。 <ul type="disc"><li> HEPAフィルタ層流フードの下にチップコンテナを開き、コンタからチップを取り外す慣性力はトップバイアル中に可能な浮動小数点の汚染物質をすくい避けるためにダウンに直面しています。 </li><li>チップ表面からあらゆる残留破片を除去するために新たにろ過滅菌脱イオン水とチップの2倍のバイアルの上部を洗浄します。 </li><li>バイアルから滅菌脱イオン水を吸引除去する。 </li><li>滅菌濾過し、脱イオン水を含む加圧注射器に流体チャネルに接続されてシラスティックチューブの一端を接続します。私たちのシステムでは、溶液を充填シリンジは20psiに設定され、圧縮空気タンクに接続することにより加圧されています。不稔性を確保するために、空気が注射器に入る前に（0.22μmのフィルター）と私たちのシステムは、必要なときに私たちは圧力を停止するか、または適用することができますオン/オフバルブを持っています。 </li><li>止血剤を使用して、チューブの出力端をクランプします。 </li><li>ソリューションを加圧するためにバルブのオン/オフを開きます。 </li><li>新鮮な滅菌脱イオン水とチップのsubterranen流体をすすぐために、チューブの出力端をクランプ。 </li><li>用に開口部を介してCEが水の上、止血とチューブの出力端をクランプします。 </li><li>排水を避けるために、hemostatsとチューブの入力および出力端部をクランプし、オン/オフバルブを閉じます。 </li><li>シリンジからチューブの入力端を外します。 </li><li>チューブの両端にガラスプラグを挿入し、hemostatsを削除します。 </li><li>フィルタsteriled脱イオン水でバイアルを記入してください。 </li><li> 100ミリメートル滅菌シャーレの底部に35ミリメートル滅菌シャーレの蓋を置きます</li><li> 100 mmディッシュの蓋付きの35ミリ蓋、カバーの上に場所チップ。 </li><li>画像チップは、チップの膜と絞り値で破片、および/ ​​または気泡の自由であることを確認してください。 私たちの研究室では、我々は正立顕微鏡と20倍の長作動距離対物レンズを使用しています 。 </li><li>破片および/または気泡が存在する場合は、繰り返し流体チャネルとバイアルをフラッシュします。破片および/または気泡が除去できない場合はチップは破棄されます。 </li><li>チップはいったん撮像され、層流フードに戻り、チューブの両端を抜いてください。 </li><li>生理的なメディアを含む加圧された注射器にチューブの一端を接続します。 </li><li>止血剤とチューブの出力端をクランプ</li><li>圧力弁を開き、流体の出力端から止血剤を除去し、生理的なメディアとの流体チャネルをフラッシュ</li><li>生理的なメディアと地下流体をすすぐために、オン/オフバルブを開き、チューブの端から止血剤を削除します。 </li><li>開口部を介して生理的なメディアを強制的に実行するには、止血とチューブの出力端をクランプします。 </li><li>止血剤とチューブの入力端をクランプし、バルブのオン/オフして閉じます。 </li><li> GLASプラグの付いたチューブの両端に注射器とプラグからチューブの入力端を削除します。 </li><li> hemostatsを削除します。 </li><li>バイアルから水を除去する。 </li><li>フィルター滅菌生理メディアとのバイアルをご記入ください。 </li><li>100ミリメートルのペトリ皿にチップの背面に配置します。 </li><li> 100 mmディッシュに35 mmのシャーレの底に置き、湿度を豊かにするフィルター滅菌脱イオン水でそれを記入してください。 </li><li>それはメッキのための時間になるまで料理をカバー</li></ul> 4。カタツムリのニューロンの細胞播種パッチクランプチップは、準備の多様適している場合があります。我々は現在、哺乳類の一次皮質ニューロンと私たちのチップをテストして、我々の滅菌プロトコルが適切であることを示し、チップは、長期培養では細胞毒性ではないことを14日間7日培養した細胞での予備的な結果を得ています。彼らは神経細胞の電気生理学11を勉強するための単純ながらも確立されたモデルを表しており、それは我々が日〜10最も重要な結果を得たことをこれらの細胞であるため、このプロトコルの目的のために、カタツムリのニューロンが選ばれました。詳細な細胞単離および培養の手順がある13日以前に12に記載され。 <ul type="disc"><li>鈍鉗子と10％のリステリンを含むLymnaea生理食塩水で麻酔動物を用いた2から3ヶ月のLymnaea stagnalisから外殻を削除します。 室温で滅菌解剖機器やソリューションを層流フード内で無菌的に行われ、後続のすべての手順を実行します。 </li><li>エッペンドルフピペットを使用して、適切な録音ソリューションと流体の生理的媒体を交換してください。 Lymnaeaニューロンの場合の解決策が含まれています（mMで）：50のKCl、5のMgCl 2、5エチレン（oxyethylenenitrilo）四酢酸（EGTA）、5 4 - （2 -ヒドロキシエチル）-1 -ピペラジンカルボン酸（HEPES、pH7.4の、130浸透圧）14 </li><li> Lymnaea生理食塩水で満たされたSylgard皿にカタツムリを固定し、以前に13を説明したように脳全体を削除する</li><li> isolatを扱う15分間DMとトリプシンインヒビター（Sigma社、大豆、カタログ番号T-9003）の治療に続いて18分間トリプシン酵素（0.2％溶液、シグマ、カタログ番号T-9201）と定義されたメディアのedは脳（DM）。 </li><li> （ - ; 20 mLのDMに1Mグルコース溶液750μlのグルコースが追加されたDM HODM）メディアを定義して高浸透圧で満たされた小さなSylgard皿に脳をピン。 </li><li>微細な鉗子と解剖はさみを使用して、神経を露出し、興味のある神経の外側と内側のシースを除去します。 </li><li>ニューロンは脳から切り離されて、ピペットで懸濁しされるまで、火研磨したガラスピペットHODMを充填し、マイクロシリンジに接続されているを使用して、目的の細胞（左ペダル背1）に近い穏やかな吸引を適用します。 </li><li>ガラスピペットは、その後移動し、マイクロシリンジからの穏やかな追放は、ニューロンが静かにピペットから押し出さとチップ上の個々のパッチの穴の上に配置することができ、個々のneurochips中に浸漬されています。</li><li>細胞は、開口部を囲むチップ表面への付着を促進するために、室温で2時間の最小邪魔されずに座ることができます。 </li></ul> 5。電気生理学的記録アンプにチップを接続するには（この例ではMulticlamp 700Bアンプ、分子デバイス、フォスターシティ、カリフォルニア州、米国 ） <ul type="disc"><li>地下の流体で、適切な録音ソリューションでチップバイアル内の溶液を交換してください。 Lymnaeaニューロンの場合には、上部の文化室はLymnaea生理食塩水（mMで：51.3のNaCl、1.7 KClを、4塩化カルシウム、および1.5のMgCl 2）が充填されHEPESでpHを7.9にバッファリング14。 </li><li>安定性のために、接着剤をガラススライド上にチップと顕微鏡下に置きます。 </li><li>アンプ（この例ではMulticlamp 700Bアンプ、分子デバイス、フォスターシティ、カリフォルニア州、米国 ）にチップを接続するには、チューブの一方の端をカットし、シルヴァを挿入ヘッドステージに接続されているrは線。 </li><li>チップのバイアルに参照電極を配置します。 </li><li>チップは現在レコーディングの準備ができています。 </li><li> 、全細胞（RT =示すMΩ50から100に加えて、容量過渡応答、（R T&gt; 1GΩ）のセルに接続された：総抵抗（R t）を測定し、神経細胞の構成を決定するためのアンプと5 mVステップを適用します。の開口部上に膜破裂）、またはしないシール（R トン MΩ&lt;5）。実験10の最後のセットでは、細胞の58％％が高抵抗のシールを持っていて、それらの細胞の80％が興奮性反応を示した。 </li></ul> 6。代表的な結果<ul type="disc"><li>ニューロン（この場合LPeD1で）に電流パルスを（20 pAの増分）脱分極が適用されます。 </li><li>その静止電位へのVMのclose（ - 60 mVの〜）でニューロンを保持します。 </li><li>これらの脱分極パルスに対する応答を観察します。シュート活動電位べきニューロンが利用可能である場合は観察することができます。 </li><li>図4は、14、15に詳細に説明されて代表的な結果を示しています。 </li></ul><img alt="図4" src="/files/ftp_upload/3288/3288fig4.jpg" /> 細胞内の電流パルス（下記参照）の段階的な一連のLPeD1ニューロンの図4の電圧応答（上）。 60mVの - 電流パルスは、VM =で適用された。 トラブルシューティング<ul type="disc"><li>メッキの前に、細胞膜と絞りが破片の自由とメッキに適しているかどうかを判断するための画像チップ。我々は、正立顕微鏡と20倍の長作動距離対物レンズを使用しています。実験1の最後のセットでは、チップの67％％が正常にその方法でプライミングされた。 </li><li>破片および/または気泡が存在する場合はチップを破棄して別のを試してみてください。 </li><li>各種表面処理（プラズマ）やコーティングは（PDL、PEIなど）が試みられるかもしれませんが、成功は細胞の種類に大きく依存しているかもしれません使用されます。 </li><li>ギガシールと全細胞の形成に重要なの流体（ &quot;ピペット&quot;）溶液の組成。浸透圧、pH、およびイオン化粧品に注意を払って、解決策を調整します。 </li><li>長期培養のために、穏やかな重力を与え血流（〜0.5 ml /分）を経由して録音する前にソリューションをピペットに切り替えて、マイクロチャネル内のメディアで始まります。 </li></ul>

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利害の衝突が宣言されません。

NRCCのパッチクランプチップの尋問プラットフォームは、高い情報内容医薬品アッセイのための潜在的に強力なツールであり、疾患の in vitroモデルで調査する。ガラスピペットと比較して、その利点は、大規模な細胞を調べるための利点である低アクセス抵抗であり、やや大きめの容量にもかかわらず、小さなセルに匹敵する動力になります。開口部シールの自発的なセルは、日常的に得られており、全体のセルのエントリは、自発的な14であることが観察されています。チップとガラスピペット法の間に明確な違いは、プローブは、細胞培養皿の一部であり、手動で細胞膜に接触されていないという事実である。細胞を培養、機能ネットワーク、疾患モデルとして多くの生物学的に関連したモデルの結果、シール16を調べるために、高い細胞を保護するための異なるメカニズムの可能性がある部分。しかし、細胞懸濁液と対照的に、吸引cannotはプローブ上のセルを配置するために使用することができます。カタツムリのニューロンは、他の大規模な細胞として、プローブの上に手動位置決めに適している。より長い培養時間を必要とする小さな細胞については、我々は上のセルの配置を任意の操作が不要にし、プローブの上にセルを配置するためのプローブの上にパターニング接着ペプチドによるシールを得るための高い確率を保持し、実証したプローブ17,18。 NRCCは、ガラスピペットと同等の容量を持つマイクロパッチクランプチップ19をポリイミド開発しています。そのプロジェクトの究極の目標は、個々のイオンチャネル14の解像度で、ネットワークの動作に従事し、いくつかのニューロンの電気生理学的活性の同時モニタリングを可能にする複数のプローブパッチクランプチップです。このメソッドは、マルチ電極アレイ20に高解像度補完的な方法です。

culturing and electrophysiology of cells on nrcc patch-clamp chips

その絶妙な感度とイオンチャネルレベルでの個々のセルを監視し、制御する能力のために、パッチクランプは同様の疾患モデルと製薬画面1に印加される電気のゴールドスタンダードです。メソッドは、伝統的に静かにその頂点2の下で膜のパッチを特定するために、生理的溶液で充填されたガラスピペットで細胞を接触させるが含まれます。ピペットに挿入された電極は、セル全体では、破裂膜パッチや、内のイオンチャネル活性をキャプチャします。過去10年間に、パッチクランプチップは別の3、4として提案されている：サスペンドフィルムは、培養培地から生理的媒体を分離し、膜中に微細開口部は、ピペットの先端を置き換えます。パッチクランプチップは自動化されたシステムに統合し、ハイスループットスクリーニング5のために実用化されています。 INCRにスループットを容易に、彼らは、細胞にプローブシールを検出し、全細胞モードに入るための流体懸濁​​液からの細胞の配信、吸引開口部上でのポジショニング、および自動化されたルーチンが含まれています。我々は、培養されたカタツムリのニューロン6の活動電位の高品質な録音を可能にする最適化されたインピーダンスとオリフィス形状のシリコンパッチクランプチップの作製について報告している。最近、我々はまた、哺乳類のニューロン7を尋問に向けた進捗状況を報告しています。私たちのパッチクランプチップは、カナダのフォトニクス製作センター8、商業ファウンドリで試作し、大規模なシリーズで利用できます。我々は、異なるモデルでNRCC技術の使用を検証するためelectrophysiologistsとのコラボレーションに従事することを熱望している。チップは、図1で表される一般的な方式に従って使用されています。シリコンチップは、プレキシグラス培養バイアルの底にあり、開口部の背面は、地下channに接続されていますエルは、パッケージの両端にチューブを装着。これは、細胞内のガラスピペットに比べ優位である。細胞に最小限の障害と解決策の交換を促進する細胞は、バイアル中で培養されており、プローブの上にセルが流体の外部ポートをチャネル2に挿入された測定電極によって監視されている灌流。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3288/3288fig1.jpg" /> 図1。NRCCパッチクランプチップを用いた測定の原理ここでは詳細に殺菌し、内閣総理チップを、細胞と培地、プレート、それらを使用してそれらをロードし、最後に電気生理学的記録のためにそれらを使用するプロトコルを設定します。

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Culturing and Electrophysiology of Cells on NRCC Patch-clamp Chips

我々は、カナダ国立研究評議会で作製した平面パッチクランプチップは、滅菌プライミング、メディアをロードし、細胞を播種し、電気生理学的記録に使用される方法を示しています。

NRCCパッチクランプチップ上で細胞の培養と電気生理学

Due to its exquisite sensitivity and the ability to monitor and control individual cells at the level of ion channels, patch-clamping is the gold standard ...

culturing-and-electrophysiology-of-cells-on-nrcc-patch-clamp-chips

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

Patch clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated from a variety of species have been described previously1-4 but this video represents the first application of those techniques to hair cells from zebrafish. Here we demonstrate a method to isolate healthy, intact hair cells from all of the inner ear end-organs: saccule, lagena, utricle and semicircular canals. Further, we demonstrate the diversity in hair cell size and morphology and give an example of the kinds of patch clamp recordings that can be obtained. The advantage of the use of this zebrafish model system over others stems from the availability of zebrafish mutants that affect both hearing and balance. In combination with the use of transgenic lines and other techniques that utilize genetic analysis and manipulation, the cell isolation and electrophysiological methods introduced here should facilitate greater insight into the roles hair cells play in mediating these sensory modalities.

The purpose of this video is to demonstrate procedures for obtaining healthy, intact hair cells from the inner ear organs of adult zebrafish and then using them for patch clamp studies aimed at characterizing the biophysical properties of their voltage-gated channels.

内耳有毛細胞におけるパッチクランプ記録は、単離されたゼブラフィッシュから

Patch  clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated  from a variety of species have been described previously1-4 but this  ...

神経科学

Whole Cell Patch Clamp for Investigating the Mechanisms of Infrared Neural Stimulation

It has been demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to elicit electrical responses in neural tissue, independent of any further modification of the target tissue. Infrared neural stimulation has been reported in a variety of peripheral and sensory neural tissue in vivo, with particular interest shown in stimulation of neurons in the auditory nerve. However, while INS has been shown to work in these settings, the mechanism (or mechanisms) by which infrared light causes neural excitation is currently not well understood. The protocol presented here describes a whole cell patch clamp method designed to facilitate the investigation of infrared neural stimulation in cultured primary auditory neurons. By thoroughly characterizing the response of these cells to infrared laser illumination in vitro under controlled conditions, it may be possible to gain an improved understanding of the fundamental physical and biochemical processes underlying infrared neural stimulation.

Infrared nerve stimulation has been proposed as an alternative to electrical stimulation in a range of nerve types, including those associated with the auditory system. This protocol describes a patch clamp method for studying the mechanism of infrared nerve stimulation in a culture of primary auditory neurons.

赤外線神経刺激のメカニズムを調査するための全細胞パッチクランプ

It has been  demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to  elicit electrical responses in neural tissue, independent of ...

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable history as a model of nervous system function, with particular significance in studies of learning and memory. The typical preparations for such studies are ones in which the sensory and motoneurons are left intact in a minimally dissected animal, or a technically elaborate neuronal co-culture of individual sensory and motoneurons. Less common is the isolated neuronal preparation in which small clusters of nominally homogeneous neurons are dissociated into single cells in short term culture. Such isolated cells are useful for the biophysical characterization of ion currents using patch clamp techniques, and targeted modulation of these conductances. A protocol for preparing such cultures is described. The protocol takes advantage of the easily identifiable glutamatergic sensory neurons of the pleural and buccal ganglia, and describes their dissociation and minimal maintenance in culture for several days without serum.

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

We describe the dissection of the nervous system of the marine sea hare Aplysia after anesthesia, the isolation of neurons for short term-tissue culture, and recordings of single cell ion currents via the patch clamp technique.

の感覚ニューロンの分離<em&gt;アメフラシカリフォルニ</em&gt;グルタミン酸作動電流のパッチクランプ記録のために

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable  history as a model of nervous system function, with particular significance in  studies ...

Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells

Mauthner cells (M-cells) are large reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key neurons involved in a characteristic behavior known as the C-start or escape response that occurs when the organism perceives a threat. The M-cell has been extensively studied in adult goldfish where it has been shown to receive a wide range of excitatory, inhibitory and neuromodulatory signals1. We have been examining M-cell activity in embryonic zebrafish in order to study aspects of synaptic development in a vertebrate preparation. In the late 1990s Ali and colleagues developed a preparation for patch clamp recording from M-cells in zebrafish embryos, in which the CNS was largely intact2,3,4. The objective at that time was to record synaptic activity from hindbrain neurons, spinal cord neurons and trunk skeletal muscle while maintaining functional synaptic connections within an intact brain-spinal cord preparation. This preparation is still used in our laboratory today. To examine the mechanisms underlying developmental synaptic plasticity, we record excitatory (AMPA and NMDA-mediated)5,6 and inhibitory (GABA and glycine) synaptic currents from developing M-cells. Importantly, this unique preparation allows us to return to the same cell (M-cell) from preparation to preparation to carefully examine synaptic plasticity and neuro-development in an embryonic organism. The benefits provided by this preparation include 1) intact, functional synaptic connections onto the M-cell, 2) relatively inexpensive preparations, 3) a large supply of readily available embryos 4) the ability to return to the same cell type (i.e. M-cell) in every preparation, so that synaptic development at the level of an individual cell can be examined from fish to fish, and 5) imaging of whole preparations due to the transparent nature of the embryos.

We have developed an intact brain-spinal cord preparation to record and monitor electrical activity via patch clamp recording from the Mauthner neurons and other reticulospinal cells in zebrafish embryos. Thus, we are able to record excitatory and inhibitory synaptic currents, voltage-gated channel activity and action potentials from key neurons in a developing embryo.

胚ゼブラフィッシュマウスナー細胞からパッチクランプ記録

Mauthner cells (M-cells) are large  reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key  neurons involved in a characteristic ...

A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System

The patch-clamp technique is today the most well-established method for recording electrical activity from individual neurons or their subcellular compartments. Nevertheless, achieving stable recordings, even from individual cells, remains a time-consuming procedure of considerable complexity. Automation of many steps in conjunction with efficient information display can greatly assist experimentalists in performing a larger number of recordings with greater reliability and in less time. In order to achieve large-scale recordings we concluded the most efficient approach is not to fully automatize the process but to simplify the experimental steps and reduce the chances of human error while efficiently incorporating the experimenter's experience and visual feedback. With these goals in mind we developed a computer-assisted system which centralizes all the controls necessary for a multi-electrode patch-clamp experiment in a single interface, a commercially available wireless gamepad, while displaying experiment related information and guidance cues on the computer screen. Here we describe the different components of the system which allowed us to reduce the time required for achieving the recording configuration and substantially increase the chances of successfully recording large numbers of neurons simultaneously.

Multi-electrode patch-clamp recordings constitute a complex task. Here we show how, by automating of many of the experimental steps, it is possible to accelerate the process leading to qualitative improvement in performance and number of recordings.

コンピュータ支援多電極パッチクランプシステム

The patch-clamp technique is today the most  well-established method for recording electrical activity from individual  neurons or their subcellular ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal population (10-20%), but show a high level of physiological, morphological, and neurochemical heterogeneity, reflecting their diverse functions. Therefore, investigation of interneurons provides important insights into the organization principles and function of neuronal circuits. This, however, requires an integrated physiological and neuroanatomical approach for the selection and identification of individual interneuron types. Whole-cell patch-clamp recording from acute brain slices of transgenic animals, expressing fluorescent proteins under the promoters of interneuron-specific markers, provides an efficient method to target and electrophysiologically characterize intrinsic and synaptic properties of specific interneuron types. Combined with intracellular dye labeling, this approach can be extended with post-hoc morphological and immunocytochemical analysis, enabling systematic identification of recorded neurons. These methods can be tailored to suit a broad range of scientific questions regarding functional properties of diverse types of cortical neurons.

Cortical networks are controlled by a small, but diverse set of inhibitory interneurons. Functional investigation of interneurons therefore requires targeted recording and rigorous identification. Described here is a combined approach involving whole-cell recordings from single or synaptically-coupled pairs of neurons with intracellular labeling, post-hoc morphological and immunocytochemical analysis.

Morphologically-と神経化学的に特定し海馬介在ニューロンからホールセルパッチクランプ記録

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

脳スライスにおける全細胞パッチクランプ記録

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding these fundamental functions will shed light on the information transfer in these neurons. Dendritic patch-clamp recordings provide the possibility to directly examine the electrical properties of dendrites and underlying voltage-gated ion channels. However, these fine structures are not easily accessible to patch pipettes because of their small diameter. This report describes a step-by-step procedure to collect stable and reliable recordings from the dendrites of dopaminergic neurons in acute slices. Electrophysiological measurements are combined with post hoc recovery of cell morphology. Successful experiments rely on improved preparation of slices, solutions and pipettes, adequate adjustment of the optics and stability of the pipette in contact with the recorded structure. Standard principles of somatic patch-clamp recording are applied to dendrites but with a gentler approach of the pipette. These versatile techniques can be implemented to address various questions concerning the excitable properties of dendrites.

Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro.

黒質ドーパミンニューロンの細胞体樹状突起のドメインからの亜細胞パッチクランプ記録

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding ...

Patch Clamp Recording of Starburst Amacrine Cells in a Flat-mount Preparation of Deafferentated Mouse Retina

The mammalian retina is a layered tissue composed of multiple neuronal types. To understand how visual signals are processed within its intricate synaptic network, electrophysiological recordings are frequently used to study connections among individual neurons. We have optimized a flat-mount preparation for patch clamp recording of genetically marked neurons in both GCL (ganglion cell layer) and INL (inner nuclear layer) of mouse retinas. Recording INL neurons in flat-mounts is favored over slices because both vertical and lateral connections are preserved in the former configuration, allowing retinal circuits with large lateral components to be studied. We have used this procedure to compare responses of mirror-partnered neurons in retinas such as the cholinergic starburst amacrine cells (SACs).

This protocol demonstrates how to perform whole-cell patch clamp recording on retinal neurons from a flat-mount preparation.

Deafferentatedマウス網膜のフラットマウントの準備中のスターバーストアマクリン細胞のパッチクランプ記録

The mammalian retina is a layered tissue composed of multiple neuronal types. To understand how visual signals are processed within its intricate synaptic ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate electrical processes in target cells. In this context, ion selectivity of a channelrhodopsin is of particular importance. This article describes the investigation of chloride selectivity for a recently identified anion-conducting channelrhodopsin of Proteomonas sulcata via electrophysiological patch-clamp recordings on HEK293 cells. The experimental procedure for measuring light-gated photocurrents demands a fast switchable &#8211; ideally monochromatic &#8211; light source coupled into the microscope of an otherwise conventional patch-clamp setup. Preparative procedures prior to the experiment are outlined involving preparation of buffered solutions, considerations on liquid junction potentials, seeding and transfection of cells, and pulling of patch pipettes. The actual recording of current-voltage relations to determine the reversal potentials for different chloride concentrations takes place 24 h to 48 h after transfection. Finally, electrophysiological data are analyzed with respect to theoretical considerations of chloride conduction.

This article describes how the ion selectivity of channelrhodopsin is determined with electrophysiological whole-cell patch-clamp recordings using HEK293 cells. Here, the experimental procedure for investigating chloride selectivity of an anion-selective channelrhodopsin is demonstrated. However, the procedure is transferable to other channelrhodopsins of distinct selectivity.