Name: culturing and electrophysiology of cells on nrcc patch-clamp chips
Uploaded: 2012-02-07T12:00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culturing and Electrophysiology of Cells on NRCC Patch-clamp Chips at JoVE.com

Författarna vill att bekräfta Alexei Bogdanov för tillverkning av patch-clamp chips på CPFC och Hue Tran, Ping Zhao och Matthew Shiu för hjälp med montering. Naweed Syed fick stöd av en kanadensisk Institute of Health Research (CIHR) bidrag. Collin Luk är mottagare av NSERC och Alberta Heritage Foundation för medicinsk forskning (AHFMR) doktorandanställning.

1. Chiptillverkningen Den process som beskrivs i 6 resulterar i en 3 | im tjock självstående filmen, en låg 1 Mohm tillgång motstånd och en slät yta trattformad öppning som underlättar en intim tätning med cellen 9, se figur 2. Flisen avdelad och limmas i plexiglas paket med öppningen mot ett hål som förbinder chip till en underjordisk kanal. Limningen dispenseras på ett sätt som minimerar shuntkapacitans till en nominell 17 pF. Paket är försedda med två 1,5 mm diameter och 6 mm långa glasrör som fluidic portarna (Figur 3). <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/3288/3288fig2.jpg" /> Figur 2. Svepelektronmikrofotografi av en fokuserad jonstråle sektion av en NRCC patch-clamp-chipet visar en slät yta kiseldioxid och trattform som gynnar intima cellkontakter och ett grunt öppning som står för en låg åtkomst resistance. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/3288/3288fig2.jpg" /> Figur 3. En krets är limmad vid botten av kulturen flaskan i en plexiglas-paketet försedd med underjordiska fluidik och glasrör. 2. Sterilisering, priming och testning Följande steg skall utföras i en biologi säkerhetsbänk för att undvika förorening eller igensättning av öppningen. <ul type="disc"><li> Sterilisera marker i en Harrick grundläggande plasma renare (www.harrickplasma.com) med en 0,1-0,3 mbar kvarvarande lufttrycket i 15 minuter vid maximal effekt 18 W. Andra luftplasma system kan användas, med jämförbar effekttäthet (24 mW / cm 3) och att hålla produkten av effekttätheten och tidskonstanten. Plasmabehandlingen gör också flisen hydrofil, vilket underlättar initiering. </li><li> Montera glasrör med steril Silastic Laboratory silikonslang, 1 mm ID x 2 mm OD (Cole ParmerKat. # 96.115-08), 3inch på ena sidan, en tum på den andra sidan. </li><li> Fyll Fluidics genom rören med sterilfiltreras standard fosfatbuffertlösning (PBS), vilket gör att ingen bubbla fångas. </li><li> Kläm fast långa silikonslang samtidigt trycksätta PBS från kortsidan vid 1 atm. En pool av PBS sipprar genom öppningen kan vara synliga i flaskan. Klipp den trycksatta leverans av PBS och ta den korta silikonslangen från leverans. </li><li> Fyll flaskan med filtrerad PBS med hjälp av en spruta. </li><li> Doppa en Ag / Ag: Cl elektrod i det korta röret och en motelektrod i flaskan. En impedans mätare används för att bekräfta att tillgången motståndet är mellan 300kohm och 3Mohm och shuntkapacitans är mellan 10 pF och 25pF. Ett chip med en lägre resistans har sannolikt en läcka, och en högre kapacitans anses olämplig för användning som det kanske inte fånga snabbaste dynamiken i cellens elektrofysiologi 6. Ett chip med en lägre kapacitanseller högre resistans anses pluggas, fastän det kan helt enkelt vara att en bubbla har fastnat i mynningen. Vissa flisen testas efter 1H, och befanns ha den korrekta elektrokemisk impedans. </li><li> Spola den fluidala kanal med sterilt avjoniserat vatten; tömma vial och skölj med densamma, två gånger. </li><li> Sänk ned förpackade chip med rör i färskt sterilt avjoniserat vatten under 30 minuter och sedan ladda med andra marker i en steril behållare fylld med sterilt avjoniserat vatten. Detta säkerställer att chips kvar hydrofila och skyddas från föroreningar. </li></ul> 3. Chips beredning i cellbiologi lab Följande steg utförs i en filtrerad HEPA laminärt flöde med aseptisk teknik måste alla lösningar som används i detta förfarande filtreras steriliseras före användning med hjälp av en 0,22 filter. <ul type="disc"><li> Öppna ett chip behållare under en filtrerad HEPA laminärt flöde och ta bort marker från contaexaminator nedåt för att undvika ösa eventuella flytande föroreningar i toppen flaskan. </li><li> Skölj toppen av flaskan med chipet 2x med färskt filtrerades sterilt avjoniserat vatten för att avlägsna eventuellt kvarvarande skräp från spånytan. </li><li> Aspirera sterilt avjoniserat vatten från toppen flaskan. </li><li> Ansluta en ände av silikonplaströr fäst vid fluidiska kanal till en trycksatt spruta innehållande sterilt filtrerat avjoniserat vatten. I vårt system, sprutor fyllda med lösningen är trycksatt genom anslutning till en tryckluft tank satt till 20 psi. För att säkerställa sterilitet, luften filtreras (0,22 m filter) före inträdet i sprutan och vårt system har också en på / av ventil som tillåter oss att stoppa eller utöva påtryckningar när det behövs. </li><li> Användning av en hemostat, klämma fast den utgående änden av röret. </li><li> Öppna på / av ventilerna för att trycksätta lösningen. </li><li> Att skölja subterranen fluidisk av chipset med färskt sterilt avjoniserat vatten, frikoppla den utgående änden av röret. </li><li> Att förce vattnet upp genom öppningen, klämma utgången änden av röret med en hemostat. </li><li> Att undvika att vatten avlopp, klämmer de ingående och utgående ändar av röret med en peanger och stänga på / av ventiler. </li><li> Lösgöra den ingående änden av röret från sprutan. </li><li> Sätt glas pluggar i båda ändarna av röret och avlägsna hemostater. </li><li> Fyll upp flaskan med filter steriled avjoniserat vatten. </li><li> Placera locket på en 35 mm steril skål in i botten av en 100 mm skål sterilt </li><li> Placera marker på toppen av 35 mm lock och täck med 100 mm skål lock. </li><li> Image chips för att säkerställa att membranet och öppningen av markerna är fria från skräp och / eller luftbubblor. I vårt labb använder vi en upprätt mikroskop och en 20x långt arbetsavstånd mål. </li><li> Om skräp och / eller luftbubblor förekommer upprepade gånger spola fluidiska kanal och toppen injektionsflaska. Om skräpet och / eller luftbubblor inte kan avlägsnas chipet kastas. </li><li> Då chipsen äravbildas, återgå till huv med laminärt flöde och koppla båda ändarna av röret. </li><li> Fästa en ände av slangen till ett trycksatt spruta innehållande fysiologiska media. </li><li> Klämma den utgående änden av röret med en hemostat </li><li> Öppna tryckventil, ta bort hemostat från utgången slutet av Fluidics och spola fluidiska kanalen med fysiologiska media </li><li> Att skölja underjordiska fluidic med fysiologiska media, öppna on / off ventiler och ta bort hemostat från utgången slutet av slangen. </li><li> Att tvinga de fysiologiska media upp genom öppningen, klämma fast den utgående änden av röret med en hemostat. </li><li> Klämma ingångsänden av slangen med en hemostat och stänga på / av-ventiler. </li><li> Avlägsna den ingående änden av röret från sprutan och pluggen båda ändarna av röret med glas pluggar. </li><li> Ta bort peanger. </li><li> Avlägsna vattnet från den övre flaskan. </li><li> Fylla den övre flaskan med filtersteriliserade fysiologiska media. </li><li>Placera chipet tillbaka in i 100 mm Petri-skål. </li><li> Placera basen av en 35 mm platta i 100 mm skål och fyll den med filter steriliserat avjoniserat vatten för att berika fukt. </li><li> Täck skålen tills det är dags för plätering </li></ul> 4. Cell plätering av snigel nervceller De patch-clamp-chips kan vara lämplig för en mängd olika beredningar. Vi testar för närvarande våra marker med däggdjur primära kortikala neuron och har fått preliminära resultat med celler som odlats under 14 dagar 7, vilket tyder på att vår sterilisering protokoll är adekvat och att chips inte är cytotoxiska i långsiktiga kulturer. För detta protokoll, var snigel nervceller valdes eftersom de representerar en enkel men väl etablerad modell för att studera neuronal elektrofysiologi 11, och det är med de celler som vi har fått de viktigaste resultaten hittills 10. Detaljerad cellisolering-och kultur hartidigare beskrivits 12, 13. <ul type="disc"><li> Ta bort den yttre skalet från 2-3 månader gamla Lymnaea stagnalis med trubbiga pincett och bedöva djur i Lymnaea saltlösning innehållande 10% Listerine. Alla efterföljande steg utfördes aseptiskt i en laminärt luftflöde huv med steriliserat dissektion utrustning och lösningar vid rumstemperatur. </li><li> Byt fysiologiska medier i Fluidics med lämpliga inspelningen lösningen med en Eppendorf-pipett. I fallet med Lymnaea neuroner lösningen innehåller (i mM): 50 KCl, 5 MgCl2, 5 etylenbis (oxietylennitrilo) tetraättiksyra (EGTA) och 5 4 - (2-hydroxietyl)-1-piperazinetansulfonsyra (HEPES, pH 7,4 ; 130 mOsm) 14 </li><li> Nåla sniglarna i en Sylgard skål fylld med Lymnaea saltlösning och ta bort hela hjärnan som tidigare beskrivits 13 </li><li> Behandla ISOLATed hjärnorna i definierade medier (DM) med trypsin enzym (0,2% lösning, Sigma, katalog # T-9201) i 18 minuter, följt av behandling i DM och trypsininhibitor (Sigma, sojabönor, Katalog # T-9003) under 15 minuter. </li><li> Nåla hjärnan i en liten Sylgard skål fylld med hög osmolaritet definieras media (HODM - DM med glukos till; 750 pl 1 M glukoslösning till 20 ml DM). </li><li> Användning fin pincett och saxar dissektion, ta bort det yttre och inre hölje av ganglia av intresse, att exponera de neuroner. </li><li> Med hjälp av en brand polerat glaspipett fylld med HODM och fäst en mikrospruta, tillämpa skonsam sugkraft nära cellen av intresse (vänstra pedalen dorsal 1) tills neuron lossnar från hjärnan och är upphängd i pipetten. </li><li> Den glaspipett sedan flyttas och doppas i enskilda neurochips där lätt utvisning från mikrosprutan tillåter nervceller som försiktigt pressas ut ur pipetten och placeras på toppen av de enskilda plåstret hålen på chips.</li><li> Tillåta cellerna att stå orörd under ett minimum av 2 timmar vid rumstemperatur för att främja deras fastsättning på spånytan omger öppningen. </li></ul> 5. Elektrofysiologiska registreringar Att ansluta marker till förstärkaren (i vårt fall en Multiclamp 700B förstärkare, Molecular Devices, Foster City, CA, USA) <ul type="disc"><li> Byt lösningen i den underjordiska fluidiska och chipet flaskan med lämpliga inspelning lösningar. I fallet med Lymnaea neuroner, är de övre kultur kamrarna fylls med Lymnaea saltlösning (i mM: 51,3 NaCl, 1,7 KCl, 4 CaCl2, och 1,5 MgCl2) buffrad till pH 7,9 med HEPES 14. </li><li> För stabilitet, lim chipet på en glasskiva och placera den under ett mikroskop. </li><li> För att ansluta chip till förstärkaren (i vårt fall en Multiclamp 700B förstärkare, Molecular Devices, Foster City, CA, USA), skär den ena änden av slangen och sätta in en Silver tråd, som är ansluten till huvudet steg. </li><li> Placera referenselektroden i den övre flaskan av chipet. </li><li> Chipet är nu klar för inspelning. </li><li> Applicera ett 5 mV steg med förstärkaren för att mäta totala motståndet (R t) och bestämma utformningen av nervceller: cell-anslutna (R t&gt; 1 GQ), hel-cell (Rt = 50-100 MQ plus kapacitiv transienter, vägledande av membranet spricker över öppningen), eller någon tätning (Rt &lt;5 MQ). I vår sista uppsättning av experiment 10, hade 58% procent av cellerna hög resistans tätningar och av dessa visade 80% av cellerna retbara svar. </li></ul> 6. Representativa resultat <ul type="disc"><li> Tillämpas depolariserande strömpulser (20 pA inkrement) till neuron (i detta fall LPeD1). </li><li> Håll neuron i Vm nära sin vilopotential (~ - 60 mV). </li><li> Observera svaren på dessa depolariserande pulser. Överskridande aktionspotentialer börobserveras om neuron är genomförbar. </li><li> Figur 4 visar ett representativt resultat som diskuteras i detalj i 14, 15. </li></ul><img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/3288/3288fig4.jpg" /> Figur 4. Voltage svar (övre del) en LPeD1 neuron till graderad serie av intracellulära strömpulser (nedan). De nuvarande pulser tillämpas vid Vm = - 60mV. Felsökning <ul type="disc"><li> Innan plätering, för att visuellt chips avgöra om membranet och bländare är fria från skräp och lämpar sig för plätering. Vi använder en upprätt mikroskop och en 20x långt arbetsavstånd mål. I vår sista uppsättning av experiment 1, var 67% procent av marker med framgång grundade på detta sätt. </li><li> Om skräp och / eller luftbubblor finns kasta chip och prova en annan. </li><li> Olika ytbehandlingar (plasma) eller beläggningar (PDL, PEI etc.) kan prövas, men framgång kan vara mycket beroende av celltypanvändas. </li><li> Kompositionen av den fluidala (&quot;pipett&quot;)-lösning i kritisk för bildningen av giga-tätningen och hel-cell. Justera lösning uppmärksamma osmolaritet, pH och joniska makeup. </li><li> För längre sikt kultur, börja med media i mikroflödessystem kanal växla sedan till pipettera lösningen före inspelningen via skonsam gravitationen matas perfusion (~ 0,5 ml / min). </li></ul>

<ol>
	<li>Walz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch-Clamp+Analysis:+Advanced+Techniques.">Patch-Clamp Analysis: Advanced Techniques.</a> Neuromethods. , 38 (2007).</li><li>Neher, E., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-channel+currents+recorded+from+membrane+of+denervated+frog+muscle+fibers.">Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibers.</a> Nature. 260, 799-802 (1976).</li><li>Behrends, J. C., Fertig, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+14:+Planar+Patch-clamp.">Ch. 14: Planar Patch-clamp.</a> Neuromethods. , (2007).</li><li>Fertig, N., Tilke, A., Blick, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+integration+of+isolated+cell+membrane+patches+in+a+nanomachined+aperture.">Stable integration of isolated cell membrane patches in a nanomachined aperture.</a> Applied Physics Letters. 77, 1218-1220 (2000).</li><li>Dunlop, J., Bowlby, M., Peri, R., Vasilyev, D., Arias, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+electrophysiology:+an+emerging+paradigm+for+ion-channel+screening+and+hysiology.">High-throughput electrophysiology: an emerging paradigm for ion-channel screening and hysiology.</a> Nat. Rev. Drug. Discov. 7 (4), 358-368 (2008).</li><li>Py, C., Denhoff, M., Martina, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+silicon+patch-clamp+chip+permits+high-fidelity+recording+of+ion+channel+activity+from+functionally+defined+neurons.">A novel silicon patch-clamp chip permits high-fidelity recording of ion channel activity from functionally defined neurons.</a> Biotechnology and Bioengineering. 107 (4), 593-600 (2010).</li><li>Martinez, D., Martina, M., Kremer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+patch-clamp+chips+for+mammalian+cell+applications.">Development of patch-clamp chips for mammalian cell applications.</a> Micro and Nanosystems. 2 (4), (2010).</li><li>Py, C., Salim, D., Monette, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+to+aperture+interaction+in+patch-clamp+chips+visualized+by+fluorescence+microscopy+and+focused-ion+beam+sections.">Cell to aperture interaction in patch-clamp chips visualized by fluorescence microscopy and focused-ion beam sections.</a> Biotechnology &#38; Bioengineering. 108, 1395-1403 (2011).</li><li>Martina, M., Luk, C., Py, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrogation+of+Cultured+Neurons+using+Patch-Clamp+Chips.">Interrogation of Cultured Neurons using Patch-Clamp Chips.</a> Journal of Neural Engineering. 8, 034002 (2011).</li><li>Bell, H. J., Syed, N. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-induced+modulation+of+the+respiratory+CPG.">Hypoxia-induced modulation of the respiratory CPG.</a> Frontiers in bioscience : a journal and virtual library. 14, 3825-3835 (2009).</li><li>Syed, N. I., Bulloch, A. G. M., Lukowiak, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+reconstruction+of+the+respiratory+central+pattern+generator+of+the+mollusk+Lymnaea.">In vitro reconstruction of the respiratory central pattern generator of the mollusk Lymnaea.</a> Science. 250, 282-285 (1990).</li><li>Syed, N. I., Zaidi, H., Lovell, P., Windhorst, U., Johansson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+reconstruction+of+neuronal+circuits:+A+simple+model+system+approach.">In vitro reconstruction of neuronal circuits: A simple model system approach.</a> Modern techniques in neuroscience research. , (1999).</li><li>Martina, M., Luk, C., Py, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrogation+of+Cultured+Neurons+using+Patch-Clamp+Chips.">Interrogation of Cultured Neurons using Patch-Clamp Chips.</a> Journal of Neural Engineering. 8, 034002 (2011).</li><li>Py, C., Denhoff, M., Martina, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silicon+patch-clamp+chip+suitable+for+high-fidelity+recording+of+ion+channel+activity+from+cultured+neurons.">Silicon patch-clamp chip suitable for high-fidelity recording of ion channel activity from cultured neurons.</a> Biotechnology and Bioengineering. 107 (4), (2010).</li><li>Ong, W. -. L., Yobas, L., Ong, W. -. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+missing+factor+in+chip-based+patch+clamp+assay:+gigaseal.">A missing factor in chip-based patch clamp assay: gigaseal.</a> Journal of Physics: Conference Series. 34, 187 (2006).</li><li>Charrier, A., Martinez, D., Monette, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+placement+and+guidance+on+substrates+for+neurochip+interfaces.">Cell placement and guidance on substrates for neurochip interfaces.</a> Biotechnology and Bioengineering. 105, 368-373 (2010).</li><li>Diaz-Quijada, D., Maynard, C. C. o. m. a. s., Monette, T., Py, R., A, C. K. r. a. n. t. i. s., Mealing, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+Patterning+with+Chemisorbed+Chemical+Cues+for+Advancing+Neurochip+Applications.">Surface Patterning with Chemisorbed Chemical Cues for Advancing Neurochip Applications.</a> Industrial &#38; Engineering Chemistry Research. 50 (17), 10029-10035 (2011).</li><li>Martinez, D., Py, C., Denhoff, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-fidelity+patch-clamp+recordings+from+neurons+cultured+on+a+polymer+microchip.">High-fidelity patch-clamp recordings from neurons cultured on a polymer microchip.</a> Biomedical Microdevices. 12, 977-97 (2010).</li><li>Taketani, M., Baudry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Advances in Network Electrophysiology: Using Multi-Electrode Arrays. , (2006).</li></ol>

Inga intressekonflikter deklareras.

NRCC s patch-clamp chip förhör plattformen är ett potentiellt kraftfullt verktyg för höga läkemedelsinformation innehåll analyser och för att undersöka in vitro modeller av sjukdom. Dess fördelar jämfört med glaspipetter är en låg tillgång motstånd vilket är en fördel att undersöka stora celler, och trots en något större kapacitans kommer att resultera i jämförbara dynamik för mindre celler. Spontan cell till bländare sälar har rutinmässigt erhållits och hela cellinmatning har observerats vara spontan 14. En tydlig skillnad mellan chipsen och glaspipett metod är det faktum att sonden är en del av cellkulturen skålen och är inte manuellt bringas i kontakt med cellmembranet. Odling av celler, möjligen en del av funktionella nätverk, resulterar i mer biologiskt relevanta modeller som sjukdom modeller, och en annan mekanism för att säkerställa hög cell för att undersöka sälar 16. Emellertid, till skillnad från cellsuspensioner, aspiration cannot användas för att positionera en cell på sonden. Snigel neuroner, vilket andra stora celler, är mottagliga för manuell positionering på toppen av sonden. För mindre celler kräver längre kultur tid har vi undanröjt behovet av någon manipulering och hålla en hög sannolikhet att erhålla en tätning av polypeptider mönstring adhesion på toppen av proberna för att placera cellerna på toppen av proberna, och visade placeringen av cellerna på Sonden 17,18. NRCC utvecklar också en polyimid mikroflödessystem patch-clamp chip 19 med en kapacitans som är jämförbar med den hos glaspipett. Det yttersta målet för projektet är en multipel-prober patch-clamp chip som gör det möjligt att samtidigt övervakning av elektrofysiologiska aktivitet av flera nervceller som deltar i nätverket beteende vid upplösning av individuella jonkanaler 14. Denna metod är en hög upplösning kompletterande metod till flera elektrodgrupperna 20.

culturing and electrophysiology of cells on nrcc patch-clamp chips

På grund av dess utsökta känslighet och förmåga att övervaka och kontrollera enskilda celler på nivå jonkanaler är patch-clamping den gyllene standarden för elektrofysiologi tillämpas på sjukdomsmodeller och farmaceutiska skärmar både 1. Metoden innefattar traditionellt försiktigt bringa en cell med en glaspipett fylld med en fysiologisk lösning i avsikt att isolera en lapp av membranet under dess spets 2. En elektrod införd i pipetten fångar jonkanalaktivitet i membranet lapp eller, när brustit, för hela cellen. Under det senaste årtiondet har patch-clamp chips föreslagits som ett alternativ 3, 4: en upphängd film skiljer fysiologiska mediet från odlingsmediet och en öppning mikrofabricerade i filmen ersätter toppen av pipetten. Patch-clamp chips har integrerats i automatiserade system och kommersialiseras för high-throughput screening 5. Att incrunderlätta genomströmningen, omfattar de fluidic leverans av celler från suspension, deras placering på öppningen genom sugning, och automatiserade rutiner för att upptäcka cell-till-sond tätningar och ingå hel cell-läge. Vi har rapporterat om tillverkning av en kisel patch-clamp-chip med optimerad impedans och mynning form som tillåter inspelning med hög kvalitet på aktionspotentialer i odlade snigel neuroner 6, nyligen har vi också rapporterat framsteg när förhör däggdjur nervceller 7. Våra patch-clamp chips tillverkas i kanadensiska Photonics Fabrication Centre 8, en kommersiell gjuteri, och finns i stora serier. Vi är angelägna om att engagera sig i samarbeten med Elektrofysiologer att validera användningen av NRCC tekniken i olika modeller. Flisen som används enligt det allmänna schemat som visas i figur 1: kiselchipset är vid botten av en Plexiglas kultur flaska och baksidan av öppningen är förbunden med en underjordisk channel försedd med rör vid vardera änden av förpackningen. Cellerna odlas i flaskan och cellen på toppen av sonden övervakas genom en mätelektrod insatt i channel.The två yttre fluidiska portar underlätta lösning utbyte med minimal störning av cellen, vilket är en fördel jämfört med glaspipetter för intracellulär perfusion. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/3288/3288fig1.jpg" /> Figur 1. Mätprincipen använda NRCC patch-clamp chip Vi detalj här protokollen för att sterilisera och prima marker, ladda dem med medium, tallrik dem med celler och slutligen använda dem för elektrofysiologiska inspelningar.

Watch this Scientific Journal Video about Culturing and Electrophysiology of Cells on NRCC Patch-clamp Chips at JoVE.com

Culturing and Electrophysiology of Cells on NRCC Patch-clamp Chips

Vi visar hur plan patch-clamp chips tillverkas vid National Research Council of Canada steriliseras primas, laddad med medium, klädd med celler och används för elektrofysiologiska inspelningar.

Odling och Elektrofysiologi av celler på NRCC Patch-clamp Chips

Due to its exquisite sensitivity and the ability to monitor and control individual cells at the level of ion channels, patch-clamping is the gold standard ...

culturing-and-electrophysiology-of-cells-on-nrcc-patch-clamp-chips

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

Patch clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated from a variety of species have been described previously1-4 but this video represents the first application of those techniques to hair cells from zebrafish. Here we demonstrate a method to isolate healthy, intact hair cells from all of the inner ear end-organs: saccule, lagena, utricle and semicircular canals. Further, we demonstrate the diversity in hair cell size and morphology and give an example of the kinds of patch clamp recordings that can be obtained. The advantage of the use of this zebrafish model system over others stems from the availability of zebrafish mutants that affect both hearing and balance. In combination with the use of transgenic lines and other techniques that utilize genetic analysis and manipulation, the cell isolation and electrophysiological methods introduced here should facilitate greater insight into the roles hair cells play in mediating these sensory modalities.

The purpose of this video is to demonstrate procedures for obtaining healthy, intact hair cells from the inner ear organs of adult zebrafish and then using them for patch clamp studies aimed at characterizing the biophysical properties of their voltage-gated channels.

Patch clamp inspelningar i Inre celler öronhår isolerad från Zebrafish

Patch  clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated  from a variety of species have been described previously1-4 but this  ...

Whole Cell Patch Clamp for Investigating the Mechanisms of Infrared Neural Stimulation

It has been demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to elicit electrical responses in neural tissue, independent of any further modification of the target tissue. Infrared neural stimulation has been reported in a variety of peripheral and sensory neural tissue in vivo, with particular interest shown in stimulation of neurons in the auditory nerve. However, while INS has been shown to work in these settings, the mechanism (or mechanisms) by which infrared light causes neural excitation is currently not well understood. The protocol presented here describes a whole cell patch clamp method designed to facilitate the investigation of infrared neural stimulation in cultured primary auditory neurons. By thoroughly characterizing the response of these cells to infrared laser illumination in vitro under controlled conditions, it may be possible to gain an improved understanding of the fundamental physical and biochemical processes underlying infrared neural stimulation.

Infrared nerve stimulation has been proposed as an alternative to electrical stimulation in a range of nerve types, including those associated with the auditory system. This protocol describes a patch clamp method for studying the mechanism of infrared nerve stimulation in a culture of primary auditory neurons.

Whole Cell Patch Clamp för att undersöka mekanismer Infraröd nervstimulering

It has been  demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to  elicit electrical responses in neural tissue, independent of ...

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable history as a model of nervous system function, with particular significance in studies of learning and memory. The typical preparations for such studies are ones in which the sensory and motoneurons are left intact in a minimally dissected animal, or a technically elaborate neuronal co-culture of individual sensory and motoneurons. Less common is the isolated neuronal preparation in which small clusters of nominally homogeneous neurons are dissociated into single cells in short term culture. Such isolated cells are useful for the biophysical characterization of ion currents using patch clamp techniques, and targeted modulation of these conductances. A protocol for preparing such cultures is described. The protocol takes advantage of the easily identifiable glutamatergic sensory neurons of the pleural and buccal ganglia, and describes their dissociation and minimal maintenance in culture for several days without serum.

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

We describe the dissection of the nervous system of the marine sea hare Aplysia after anesthesia, the isolation of neurons for short term-tissue culture, and recordings of single cell ion currents via the patch clamp technique.

Isolering av sensoriska neuroner av<em&gt; Aplysia californica</em&gt; För Patch Clamp Inspelningar av glutamaterg Currents

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable  history as a model of nervous system function, with particular significance in  studies ...

Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells

Mauthner cells (M-cells) are large reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key neurons involved in a characteristic behavior known as the C-start or escape response that occurs when the organism perceives a threat. The M-cell has been extensively studied in adult goldfish where it has been shown to receive a wide range of excitatory, inhibitory and neuromodulatory signals1. We have been examining M-cell activity in embryonic zebrafish in order to study aspects of synaptic development in a vertebrate preparation. In the late 1990s Ali and colleagues developed a preparation for patch clamp recording from M-cells in zebrafish embryos, in which the CNS was largely intact2,3,4. The objective at that time was to record synaptic activity from hindbrain neurons, spinal cord neurons and trunk skeletal muscle while maintaining functional synaptic connections within an intact brain-spinal cord preparation. This preparation is still used in our laboratory today. To examine the mechanisms underlying developmental synaptic plasticity, we record excitatory (AMPA and NMDA-mediated)5,6 and inhibitory (GABA and glycine) synaptic currents from developing M-cells. Importantly, this unique preparation allows us to return to the same cell (M-cell) from preparation to preparation to carefully examine synaptic plasticity and neuro-development in an embryonic organism. The benefits provided by this preparation include 1) intact, functional synaptic connections onto the M-cell, 2) relatively inexpensive preparations, 3) a large supply of readily available embryos 4) the ability to return to the same cell type (i.e. M-cell) in every preparation, so that synaptic development at the level of an individual cell can be examined from fish to fish, and 5) imaging of whole preparations due to the transparent nature of the embryos.

We have developed an intact brain-spinal cord preparation to record and monitor electrical activity via patch clamp recording from the Mauthner neurons and other reticulospinal cells in zebrafish embryos. Thus, we are able to record excitatory and inhibitory synaptic currents, voltage-gated channel activity and action potentials from key neurons in a developing embryo.

Patch Clamp Inspelningar från embryonala Zebrafish Mauthner Cells

Mauthner cells (M-cells) are large  reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key  neurons involved in a characteristic ...

A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System

The patch-clamp technique is today the most well-established method for recording electrical activity from individual neurons or their subcellular compartments. Nevertheless, achieving stable recordings, even from individual cells, remains a time-consuming procedure of considerable complexity. Automation of many steps in conjunction with efficient information display can greatly assist experimentalists in performing a larger number of recordings with greater reliability and in less time. In order to achieve large-scale recordings we concluded the most efficient approach is not to fully automatize the process but to simplify the experimental steps and reduce the chances of human error while efficiently incorporating the experimenter's experience and visual feedback. With these goals in mind we developed a computer-assisted system which centralizes all the controls necessary for a multi-electrode patch-clamp experiment in a single interface, a commercially available wireless gamepad, while displaying experiment related information and guidance cues on the computer screen. Here we describe the different components of the system which allowed us to reduce the time required for achieving the recording configuration and substantially increase the chances of successfully recording large numbers of neurons simultaneously.

Multi-electrode patch-clamp recordings constitute a complex task. Here we show how, by automating of many of the experimental steps, it is possible to accelerate the process leading to qualitative improvement in performance and number of recordings.

Ett Datorstödd Multi-elektrod Patch-clamp System

The patch-clamp technique is today the most  well-established method for recording electrical activity from individual  neurons or their subcellular ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal population (10-20%), but show a high level of physiological, morphological, and neurochemical heterogeneity, reflecting their diverse functions. Therefore, investigation of interneurons provides important insights into the organization principles and function of neuronal circuits. This, however, requires an integrated physiological and neuroanatomical approach for the selection and identification of individual interneuron types. Whole-cell patch-clamp recording from acute brain slices of transgenic animals, expressing fluorescent proteins under the promoters of interneuron-specific markers, provides an efficient method to target and electrophysiologically characterize intrinsic and synaptic properties of specific interneuron types. Combined with intracellular dye labeling, this approach can be extended with post-hoc morphological and immunocytochemical analysis, enabling systematic identification of recorded neurons. These methods can be tailored to suit a broad range of scientific questions regarding functional properties of diverse types of cortical neurons.

Cortical networks are controlled by a small, but diverse set of inhibitory interneurons. Functional investigation of interneurons therefore requires targeted recording and rigorous identification. Described here is a combined approach involving whole-cell recordings from single or synaptically-coupled pairs of neurons with intracellular labeling, post-hoc morphological and immunocytochemical analysis.

Hel-cell Patch-clamp Inspelningar från Morphologically- och neurokemiskt identifierade Hippocampus Interneuroner

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

Hel-cell patch-clamp inspelningar i hjärnan skivor

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding these fundamental functions will shed light on the information transfer in these neurons. Dendritic patch-clamp recordings provide the possibility to directly examine the electrical properties of dendrites and underlying voltage-gated ion channels. However, these fine structures are not easily accessible to patch pipettes because of their small diameter. This report describes a step-by-step procedure to collect stable and reliable recordings from the dendrites of dopaminergic neurons in acute slices. Electrophysiological measurements are combined with post hoc recovery of cell morphology. Successful experiments rely on improved preparation of slices, solutions and pipettes, adequate adjustment of the optics and stability of the pipette in contact with the recorded structure. Standard principles of somatic patch-clamp recording are applied to dendrites but with a gentler approach of the pipette. These versatile techniques can be implemented to address various questions concerning the excitable properties of dendrites.

Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro.

Subcellulära Patch-clamp inspelningar från somatodendritisk området nigrala dopaminneuroner

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding ...

Patch Clamp Recording of Starburst Amacrine Cells in a Flat-mount Preparation of Deafferentated Mouse Retina

The mammalian retina is a layered tissue composed of multiple neuronal types. To understand how visual signals are processed within its intricate synaptic network, electrophysiological recordings are frequently used to study connections among individual neurons. We have optimized a flat-mount preparation for patch clamp recording of genetically marked neurons in both GCL (ganglion cell layer) and INL (inner nuclear layer) of mouse retinas. Recording INL neurons in flat-mounts is favored over slices because both vertical and lateral connections are preserved in the former configuration, allowing retinal circuits with large lateral components to be studied. We have used this procedure to compare responses of mirror-partnered neurons in retinas such as the cholinergic starburst amacrine cells (SACs).

This protocol demonstrates how to perform whole-cell patch clamp recording on retinal neurons from a flat-mount preparation.

Patch Clamp Registrering av Starburst amakrina celler i en platt-mount Framställning av Deafferentated mus Retina

The mammalian retina is a layered tissue composed of multiple neuronal types. To understand how visual signals are processed within its intricate synaptic ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate electrical processes in target cells. In this context, ion selectivity of a channelrhodopsin is of particular importance. This article describes the investigation of chloride selectivity for a recently identified anion-conducting channelrhodopsin of Proteomonas sulcata via electrophysiological patch-clamp recordings on HEK293 cells. The experimental procedure for measuring light-gated photocurrents demands a fast switchable &#8211; ideally monochromatic &#8211; light source coupled into the microscope of an otherwise conventional patch-clamp setup. Preparative procedures prior to the experiment are outlined involving preparation of buffered solutions, considerations on liquid junction potentials, seeding and transfection of cells, and pulling of patch pipettes. The actual recording of current-voltage relations to determine the reversal potentials for different chloride concentrations takes place 24 h to 48 h after transfection. Finally, electrophysiological data are analyzed with respect to theoretical considerations of chloride conduction.

This article describes how the ion selectivity of channelrhodopsin is determined with electrophysiological whole-cell patch-clamp recordings using HEK293 cells. Here, the experimental procedure for investigating chloride selectivity of an anion-selective channelrhodopsin is demonstrated. However, the procedure is transferable to other channelrhodopsins of distinct selectivity.