Name: culturing and electrophysiology of cells on nrcc patch-clamp chips
Uploaded: 2012-02-07T12:00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culturing and Electrophysiology of Cells on NRCC Patch-clamp Chips at JoVE.com

Yazarlar imalat montaj ile yardım için yama klemp Rütbeni fişleri ve Hue Tran, Ping Zhao ve Matthew Shiu, Alexei Bogdanov dolayı teşekkür etmek istiyoruz. Naweed Syed Sağlık Araştırması (CIHR) hibe Kanada Enstitüsü tarafından desteklenmiştir. Collin Luk NSERC ve Tıbbi Araştırma Enstitüsü (AHFMR) studentships Alberta Heritage Vakfı alıcı.

1. Chip imalat 3 mikron kalınlığında kendi başına durabilen bir film, düşük 1 Mohm erişim direnci ve hücre 9 ile samimi bir mühür kolaylaştıran bir düz yüzeyli huni şekilli diyafram 6 sonuç açıklanan süreç, şekil 2&#39;ye bakınız. Cips çipi bir yeraltı kanalına bağlayan bir delik karşı karşıya diyafram ile singulated ve pleksiglas paketleri yapıştırılmalıdır. Yapıştırma nominal 17 pF, şant kapasitans en aza indirir bir şekilde dağıtılır. Paketleri iki adet 1.5 mm çapında ve akışkan limanlar olarak 6 mm uzunluğunda cam tüpler (Şekil 3) ile donatılmıştır. <img alt="Şekil 2." src="/files/ftp_upload/3288/3288fig2.jpg" /> Şekil 2 yama klemp bir NRCC çip odaklı iyon demeti bölümünde elektron mikroskobu Tarama yumuşak bir silikon dioksit yüzey ve samimi hücre bağlantıları yana huni şekli ve sığ bir delik düşük bir erişim dayanımı hesapları olduğunu gösterire. <img alt="Şekil 2." src="/files/ftp_upload/3288/3288fig2.jpg" /> Şekil 3,, yeraltı akışkansal ve cam tüpler ile donatılmış bir Pleksiglas paketi, bir çip içinde, kültür flakonun dibinde yapıştırılır. 2. Sterilizasyon, doldurma ve test Aşağıdaki adımları, diyafram kirlenme veya tıkanmayı önlemek için bir biyoloji güvenlik kabini yapılmalıdır. <ul type="disc"><li> 18 W. Diğer hava plazma sistemleri maksimum güçte 15 dakika için 0.1-0.3 mbar artık hava basıncı ile harrick temel plazma temizleyici (www.harrickplasma.com) cips sterilize karşılaştırılabilir güç yoğunluğu (24 mW ile kullanılabilir / cm 3) ve güç yoğunluğu ve ürünün sabit tutmak. Plazma tedavisi de astar kolaylaştıran, cips hidrofilik vermektedir. </li><li> Steril silastik Laboratuvar silikon tüp, 1mm ID x 2mm OD (Cole Parmer cam tüpler FitCat. # 96115-08) bir tarafında, 3 inç, diğer tarafta 1 inç. </li><li> Hiçbir kabarcık tutulur emin olun, steril filtre standart Fosfat Tampon Çözeltisi (PBS) ile tüpler aracılığıyla akışkansal doldurun. </li><li> 1 atm kısa kenarı PBS basınçlandırma ise uzun silikon tüp Clip. Delikten sızan, PBS bir havuz, flakon görünür olabilir. PBS basınçlı kaynağı Klip ve bu kaynağı kısa bir silikon tüp ayırmak. </li><li> Flakon, PBS bir şırınga kullanılarak filtrelendiğini ile doldurun. </li><li> Cl kısa tüp elektrot ve bir şişe içinde bir karşı elektrot ve Ag / Ag bırakın. 10pF ve 25pF arasında 300kohm ve 3Mohm ve şant kapasitans arasındaki empedans metre erişim direnci olduğunu onaylamak için kullanılır. Düşük bir dirence sahip bir çip, bir kaçak olması muhtemeldir ve bu hücrenin elektrofizyoloji 6 hızlı dinamikleri yakalamak olmayabilir gibi yüksek bir kapasitans kullanım için uygunsuz olarak kabul edilir. Daha düşük bir kapasitans ile bir yongaveya daha yüksek bir direnç, bir kabarcık delik içinde sıkışıp basitçe olabilir rağmen, takılı olarak kabul edilir. Bazı yonga, 1H sonra yeniden test edilmiş ve doğru elektrokimyasal empedans sahip bulundu. </li><li> Akışkan kanalı steril deiyonize su ile yıkayın; üst flakonun boşaltılması ve aynı iki kez durulayın. </li><li> Steril deiyonize su ile dolu steril bir kapta diğer çipleri ile yüklemek taze steril deiyonize su tüpleri ile paketlenmiş yonga sonra 30 dakika bırakın. Bu çipleri hidrofilik ve kirlenmeye karşı korunuyor kalmasını sağlar. </li></ul> 3. Hücre biyolojisi laboratuvarı cips hazırlama Aşağıdaki adımları aseptik teknikler kullanarak bir HEPA filtreli laminer akış kaputu yapılmaktadır, bu yordamı kullanılan tüm çözümler 0.22μm bir filtre kullanarak kullanmadan önce sterilize filtre edilmesi gerekir. <ul type="disc"><li> HEPA filtreli bir laminer akış kaputun altında bir çip kutuyu açın ve conta fişleri kaldırmakasimtotik üst şişeye mümkün yüzen kirletici karıştırıyordu önlemek için yüz aşağı. </li><li> Çip yüzeyde herhangi bir kalıntı enkaz kaldırmak için taze filtre steril deiyonize su ile çip 2x flakon üst durulayın. </li><li> Üst flakon kapalı steril deiyonize su aspire edin. </li><li> Silastik hortumu arasında akışkan kanalı steril süzülmüş deiyonize su içeren basınçlı bir şırınga ekli bir ucunu. Sistemimizde, solüsyonuyla doldurulmuş şırıngalar 20psi üzere ayarlanmış bir sıkıştırılmış hava tankı için bir bağlantı ile basınçlı hale gelirler. Sterilite sağlamak için, hava şırınga girmesinden önce (0.22 mikron filtre) filtre edilmiş ve bizim sistemi de gerektiğinde bize baskı durdurmak veya uygulamak için izin veren bir açma / kapama vanası vardır. </li><li> Hortumu arasında çıkış ucu kullanarak, bir hemostat kelepçe. </li><li> Çözüm basınç / vanaları kapatın açın. </li><li> Taze steril deiyonize su ile çip subterranen akışkan durulama, boru çıkış çözülme. </li><li> Için içindiyafram aracılığıyla ce su, bir hemostat ile boru çıkış sonunda kelepçe. </li><li> Suyu drenajı önlemek için bir hemostat birlikte, boru giriş ve çıkış uçları kelepçe ve / açma kapama vanaları kapatın. </li><li> Şırıngadan boru giriş sonuna ayırın. </li><li> Hortumun her iki ucunda cam fişleri takın ve hemostat çıkarın. </li><li> Üst flakon, filtre steriled deiyonize su ile doldurun. </li><li> 35 mm steril çanak kapağı 100 mm steril çanak üssü haline getirin </li><li> 100 mm çanak kapağı ile 35 mm kapak ve kapağın üstünde yer çip. </li><li> Görüntü cips cips membran ve diyafram enkaz ve / veya hava kabarcıkları serbest olmasını sağlamak için laboratuarımızda biz dik bir mikroskop ve 20x uzun çalışma mesafesi objektif kullanın. </li><li> Enkaz ve / veya hava kabarcıkları varsa, akışkan kanalı ve üst flakon tekrar tekrar yıkayın. Enkaz ve / veya hava kabarcıkları kaldırıldı edilemezse çip atılır. </li><li> Cips kezlaminer akış kapağı, görüntülü dönmek ve hortumun her iki ucunda çıkarın. </li><li> Tek bir borudan ucunu fizyolojiksel ortam içeren basınçlı bir şırınga. </li><li> , Bir hemostat ile hortumun çıkış ucunda Kıskaç </li><li> Basınç vanasını açın, hemostat akışkansal çıkış ucundan kaldırmak ve, fizyolojik medya ile Mikroakışkan kanal yıkayın </li><li> Yeraltı akışkan fizyolojik medya ile durulayın / vanaları kapalı, açık ve Hortumun çıkış hemostatı kaldırın. </li><li> Fizyolojiksel ortam delikten zorlamak için, bir hemostat ile hortumun çıkış ucu kelepçe. </li><li> Hemostat ile boru giriş sonuna Kelepçe ve / açma kapama vanaları kapatın. </li><li> Hortumu plug şırınga ve her iki ucunda hortumu glas fişli giriş ucu çıkarın. </li><li> Hemostat çıkarın. </li><li> Üst şişeden su çıkarın. </li><li> Filtre steril fizyolojik medya ile üst flakon doldurun. </li><li>100 mm petri içine çip geri yerleştirin. </li><li> 35 mm çanak taban 100 mm kabına yerleştirin ve nem zenginleştirmek için filtre steril deiyonize su ile doldurun. </li><li> Kaplama için zamanı gelene kadar çanak Kapak </li></ul> 4. Salyangoz nöronlarının hücre kaplama Yama-kelepçe yongaları, çeşitli preparatları için uygun olabilir. Şu anda memeli Primer kortikal nöron dökülmesinin test ve sterilizasyon protokolü yeterli olduğunu gösterir ve cips, uzun vadeli kültürlerinde sitotoksik olmadığı 14 gün 7, kültüre hücreleri ile elde edilen ilk sonuçlar. Onlar, nöronal elektrofizyoloji 11 okumak için basit ama köklü bir modeli temsil eder, çünkü bu bizim için en önemli sonuçları tarihi 10 edindiğiniz bu hücreler ile, bu protokolün amacı doğrultusunda, salyangoz nöronlarının seçilmiştir. Ayrıntılı hücre izolasyonu ve kültürü prosedürleri varÖnceden 12, 13 tarif edilmiştir. <ul type="disc"><li> Çıkarın, Listerine içeren% 10 Lymnaea tuzlu künt forseps ve uyutmak hayvanlar ile 2-3 aylık Lymnaea stagnalis dış kabuk. Tüm sonraki basamaklar oda sıcaklığında sterilize diseksiyonu ekipman ve çözümleri ile bir laminer hava akımı kaput içinde aseptik yapıldı. </li><li> Eppendorf pipet kullanarak uygun kayıt çözümü ile akışkansal fizyolojik ortam değiştirin. Durumda Lymnaea nöronların çözüm içerir (mM): 50 KCl, 5 MgCl2, 5 etilenbis (oxyethylenenitrilo) tetraasetik asit (EGTA) ve 5. 4 - (2-hidroksietil)-1-piperazinetansülfonik asit (HEPES, pH 7.4. 130 mOsm) 14 </li><li> Pin Lymnaea tuzlu su ile dolu bir Sylgard kabına salyangoz ve daha önce 13 olarak açıklanan tüm beyin kaldırmak </li><li> Isolat tedavi18 dakika 15 dakika tedavi için DM ve tripsin inhibitörü (Sigma, Soya, Katalog # T-9003) takip ed tripsin enzimi ile tanımlanan medya beyinleri (DM) (% 0.2 &#39;Çözüm, Sigma, Katalog # T-9201). </li><li> (-; 1M glukoz çözeltisi 20 mL DM 750 uL glukoz eklendi DM HODM) medya tanımlanan yüksek ozmolarite dolu küçük Sylgard, çanak beyinleri Pin. </li><li> Ince forseps ve diseksiyon makas kullanarak, nöronlar açığa ilgi gangliyonların dış ve iç kılıf çıkarın. </li><li> , Ilgi (sol pedalı dorsal 1) hücre yakınındaki nazik emme uygulamak,, nöron beyin ayrılır ve, pipet içinde süspanse edilmekte kadar bir yangın cilalı cam pipet ile doldurulur HODM ve Mikroşırınga iliştirilir. </li><li> Cam pipet sonra taşındı ve yumuşak sınırdışı mikroenjektör, nöronlar pipetle yavaşça dışarı itti ve fiş tek tek yama deliklerin üstüne yerleştirilir üzere sağlar bireysel neurochips daldırılır.</li><li> Hücreleri, diyafram çevreleyen çip yüzeyine bağlılıklarını teşvik etmek için oda sıcaklığında en az 2 saat boyunca rahatsız edilmeden oturup bekleyin. </li></ul> 5. Elektrofizyolojik kayıtlar (Bizim durumumuzda bir Multiclamp 700B amplifikatör, Molecular Devices, Foster City, CA, USA) amplifikatöre yongaları bağlamak için <ul type="disc"><li> Çözüm, yeraltı Mikroakışkan ve uygun kayıt çözümleri ile çip şişe içinde değiştirin. , HEPES ile pH 7.9,, Lymnaea nöronların durumda üst kültürü odalarına (mM: 51,3 NaCl, 1.7 KCl, 4 CaCI2 ve 1.5 MgCİ2) Lymnaea tuzlu su ile doldurulmuştur tamponlu 14 </li><li> Kararlılık için, yapıştırıcı bir cam slayt üzerine çip ve mikroskop altında yerleştirin. </li><li> Amplifikatör (bizim durumumuzda bir Multiclamp 700B amplifikatör, Molecular Devices, Foster City, CA, USA) çip bağlamak için, hortumun bir ucunu kesti ve Silve eklemekr tel hangi kafa-sahne bağlanmıştır. </li><li> Üste çipi şişe içinde referans elektrotu yerleştirin. </li><li> Çip şimdi kayıt için hazırdır. </li><li> Tüm hücreli (Rt = 50-100 M artı kapasitif geçişlerini, hücre ekli (R t&gt; 1 GΩ) gösterge niteliğinde: toplam direncini ölçmek (Rt) ve nöronların yapılandırması belirlemek için amplifikatör ile bir 5 mV adım uygulayın ya da hiç mühür (M R t &lt;5), membran diyafram üzerinde rüptürü). Son deneyler 10 hücreleri,% 58 oranında yüksek direnç contalar vardı ve bu hücreler,% 80 uyarılabilen yanıtları gösterdi. </li></ul> 6. Temsilcisi Sonuçlar <ul type="disc"><li> Depolarizan akım darbeleri (20 pA artış), nöron (Bu durumda LPeD1 yılında) uygulayın. </li><li> Vm yakın dinlenme potansiyeli (- 60 mV ~) nöron tutun. </li><li> Depolarizan bakliyat tepkileri gözlemleyin. Overshooting aksiyon potansiyellerinöron uygulanabilir olup olmadığını görülebilir. </li><li> Şekil 4, 14, 15 &#39;de ayrıntılı olarak ele alınmaktadır temsili bir sonucunu göstermektedir. </li></ul><img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/3288/3288fig4.jpg" /> Şekil 4. Gerilim yanıtları intrasellüler akım darbeleri (aşağıda), kademeli dizi LPeD1 nöron (üstte). 60mV - akım darbeleri Vm = uygulanmıştır. Sorun Giderme <ul type="disc"><li> Membran ve diyafram enkaz ücretsiz ve kaplama için uygun olup olmadığını kaplama önce, görüntü yongaları belirlemek için. Biz dik bir mikroskop ve 20x uzun çalışma mesafesi objektif kullanın. Bizim son deneyler 1, cips% 67 oranında başarıyla bu şekilde astarlanmalıdır. </li><li> Enkaz ve / veya hava kabarcıkları varsa fiş atmak ve başka bir tane deneyin. </li><li> Çeşitli yüzey işlemleri (plazma) veya kaplamalar (PDL, PEI vb.) Denenebilir, ancak başarı hücre tipine son derece bağlı olabilirkullanılmıştır. </li><li> Kritik bir mühür giga-ve, bütün-hücre formasyonu için akışkan çözeltisi (&quot;pipet&quot;) bileşimi. Osmolarite, pH ve iyonik makyaj dikkat, çözüm ayarlayın. </li><li> Uzun vadede kültür için, sonra nazik yerçekimi beslemeli perfüzyon (~ 0.5 ml / dak) üzerinden kayıt önce çözüm Pipeti geçiş, mikroakışkan kanalı medya ile başlar. </li></ul>

<ol>
	<li>Walz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch-Clamp+Analysis:+Advanced+Techniques.">Patch-Clamp Analysis: Advanced Techniques.</a> Neuromethods. , 38 (2007).</li><li>Neher, E., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-channel+currents+recorded+from+membrane+of+denervated+frog+muscle+fibers.">Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibers.</a> Nature. 260, 799-802 (1976).</li><li>Behrends, J. C., Fertig, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+14:+Planar+Patch-clamp.">Ch. 14: Planar Patch-clamp.</a> Neuromethods. , (2007).</li><li>Fertig, N., Tilke, A., Blick, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+integration+of+isolated+cell+membrane+patches+in+a+nanomachined+aperture.">Stable integration of isolated cell membrane patches in a nanomachined aperture.</a> Applied Physics Letters. 77, 1218-1220 (2000).</li><li>Dunlop, J., Bowlby, M., Peri, R., Vasilyev, D., Arias, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+electrophysiology:+an+emerging+paradigm+for+ion-channel+screening+and+hysiology.">High-throughput electrophysiology: an emerging paradigm for ion-channel screening and hysiology.</a> Nat. Rev. Drug. Discov. 7 (4), 358-368 (2008).</li><li>Py, C., Denhoff, M., Martina, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+silicon+patch-clamp+chip+permits+high-fidelity+recording+of+ion+channel+activity+from+functionally+defined+neurons.">A novel silicon patch-clamp chip permits high-fidelity recording of ion channel activity from functionally defined neurons.</a> Biotechnology and Bioengineering. 107 (4), 593-600 (2010).</li><li>Martinez, D., Martina, M., Kremer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+patch-clamp+chips+for+mammalian+cell+applications.">Development of patch-clamp chips for mammalian cell applications.</a> Micro and Nanosystems. 2 (4), (2010).</li><li>Py, C., Salim, D., Monette, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+to+aperture+interaction+in+patch-clamp+chips+visualized+by+fluorescence+microscopy+and+focused-ion+beam+sections.">Cell to aperture interaction in patch-clamp chips visualized by fluorescence microscopy and focused-ion beam sections.</a> Biotechnology &#38; Bioengineering. 108, 1395-1403 (2011).</li><li>Martina, M., Luk, C., Py, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrogation+of+Cultured+Neurons+using+Patch-Clamp+Chips.">Interrogation of Cultured Neurons using Patch-Clamp Chips.</a> Journal of Neural Engineering. 8, 034002 (2011).</li><li>Bell, H. J., Syed, N. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-induced+modulation+of+the+respiratory+CPG.">Hypoxia-induced modulation of the respiratory CPG.</a> Frontiers in bioscience : a journal and virtual library. 14, 3825-3835 (2009).</li><li>Syed, N. I., Bulloch, A. G. M., Lukowiak, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+reconstruction+of+the+respiratory+central+pattern+generator+of+the+mollusk+Lymnaea.">In vitro reconstruction of the respiratory central pattern generator of the mollusk Lymnaea.</a> Science. 250, 282-285 (1990).</li><li>Syed, N. I., Zaidi, H., Lovell, P., Windhorst, U., Johansson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+reconstruction+of+neuronal+circuits:+A+simple+model+system+approach.">In vitro reconstruction of neuronal circuits: A simple model system approach.</a> Modern techniques in neuroscience research. , (1999).</li><li>Martina, M., Luk, C., Py, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrogation+of+Cultured+Neurons+using+Patch-Clamp+Chips.">Interrogation of Cultured Neurons using Patch-Clamp Chips.</a> Journal of Neural Engineering. 8, 034002 (2011).</li><li>Py, C., Denhoff, M., Martina, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silicon+patch-clamp+chip+suitable+for+high-fidelity+recording+of+ion+channel+activity+from+cultured+neurons.">Silicon patch-clamp chip suitable for high-fidelity recording of ion channel activity from cultured neurons.</a> Biotechnology and Bioengineering. 107 (4), (2010).</li><li>Ong, W. -. L., Yobas, L., Ong, W. -. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+missing+factor+in+chip-based+patch+clamp+assay:+gigaseal.">A missing factor in chip-based patch clamp assay: gigaseal.</a> Journal of Physics: Conference Series. 34, 187 (2006).</li><li>Charrier, A., Martinez, D., Monette, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+placement+and+guidance+on+substrates+for+neurochip+interfaces.">Cell placement and guidance on substrates for neurochip interfaces.</a> Biotechnology and Bioengineering. 105, 368-373 (2010).</li><li>Diaz-Quijada, D., Maynard, C. C. o. m. a. s., Monette, T., Py, R., A, C. K. r. a. n. t. i. s., Mealing, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+Patterning+with+Chemisorbed+Chemical+Cues+for+Advancing+Neurochip+Applications.">Surface Patterning with Chemisorbed Chemical Cues for Advancing Neurochip Applications.</a> Industrial &#38; Engineering Chemistry Research. 50 (17), 10029-10035 (2011).</li><li>Martinez, D., Py, C., Denhoff, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-fidelity+patch-clamp+recordings+from+neurons+cultured+on+a+polymer+microchip.">High-fidelity patch-clamp recordings from neurons cultured on a polymer microchip.</a> Biomedical Microdevices. 12, 977-97 (2010).</li><li>Taketani, M., Baudry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Advances in Network Electrophysiology: Using Multi-Electrode Arrays. , (2006).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Yama-klemp yonga NRCC sorgulama platformu, yüksek bilgi içeriği ilaç deneyleri için potansiyel olarak güçlü bir araçtır ve hastalığın in vitro modeller araştırmak için. Büyük hücreler yoklamak bir avantajı, bir düşük erişim direnci, cam pipet ile karşılaştırıldığında avantajları vardır, ve biraz daha büyük bir kapasitans rağmen küçük hücreler karşılaştırılabilir dinamiği neden olur. Rutin diyafram mühürler spontan hücre elde edilmiştir ve bütün hücreye girişi spontan 14 olduğu saptanmıştır. Probun, hücre kültürü çanağı parçasıdır ve elle, hücre membranı ile temas getirilen gerçeğine arasında açık bir fark, cips ve cam pipet yöntemi olup. Hücreleri kültür, muhtemelen fonksiyonel ağları parçası, hastalık modelleri olarak daha fazla biyolojik olarak amaca uygun modeller sonuçları ve mühürler 16 yoklamak için yüksek hücre güvenliğini sağlamak için farklı bir mekanizma. Ancak, hücre süspansiyonları ile kontrast, aspirasyon bulaşmıyort, prob bir hücre konumlandırmak için kullanılacaktır. Salyangoz nöronlar, diğer büyük hücreler olarak, probun üstüne manuel konumlandırma uygundurlar. Hücrelere artık kültür kez gerektiren küçük hücreler için, biz herhangi bir manipülasyon için ihtiyacı ortadan kalktığı ve prob üst hücrelere yerleştirmek için problar üstüne, desenlendirme adezyon polipeptidlerin tarafından bir mühür elde etme olasılığı yüksek tutmak ve göstermiştir yerleştirme prob 17,18. NRCC aynı zamanda gelişmekte olan bir cam pipet ile karşılaştırılabilir bir kapasitans mikroakışkan yama kelepçe çip 19 poliimid. Bu projenin nihai hedefi, bireysel iyon kanalları 14 çözünürlükte ağ davranışı yapan birkaç nöronlarının elektrofizyolojik aktivitenin eş zamanlı izleme sağlar. Çoklu problar patch-klemp yonga Bu yöntem, yüksek çözünürlükte bir çoklu-elektrot dizilerin 20 tamamlayıcı bir yöntemdir.

culturing and electrophysiology of cells on nrcc patch-clamp chips

Onun zarif duyarlılık ve iyon kanallarının düzeyinde tek tek hücrelerin izlenmesi ve kontrol etme yeteneği sayesinde, yama-klemp Elektrofizyolojinin altın standart hem 1 hastalık modelleri ve ilaç ekranlar uygulanır. Bu yöntem, geleneksel bir cam pipet ile bir hücre tarafından doldurulacak bir yama membran, doruğuna 2 altında izole etmek için bir fizyolojik çözelti yavaşça başvurmadan içerir. Pipet takılı bir elektrot, membran rüptürü yama veya tüm hücre içinde iyon kanal aktivitesini yakalar. Son on yıl içinde, patch-klemp cips, 3, 4 alternatif olarak ileri sürülmüştür: bir asma film kültür ortamından fizyolojik orta ayırır ve, film microfabricated bir diyafram pipet apeks değiştirir. Patch-klemp çipleri otomasyon sistemleri entegre ve yüksek throughput tarama 5 için satışa sunulmuştur. Incrhacmi kolaylığı, hücre-probe mühürler algılamak ve tüm hücre moduna girmek için akışkan süspansiyon hücreleri teslimat, emme diyafram üzerinde konumlarını ve otomatik rutinleri içerir. Biz optimize empedans ve aksiyon potansiyelleri 6 kültürlü salyangoz nöronlar yüksek kaliteli kayıt izin delik şekli patch-klemp bir silikon çip üretim bildirdin; son zamanlarda, biz de memeli nöronlar 7 sorguya doğru ilerleme var. Patch-klemp cips Kanada Fotonik Üretim Merkezi 8, ticari bir döküm imal ve büyük seriler mevcuttur. Biz, farklı modellerde NRCC teknoloji kullanımı doğrulamak için electrophysiologists ile işbirliği yapmaya istekli. Şekil 1&#39;de temsil genel şemasına göre yongaları kullanılır: silikon çip bir pleksiglas kültür şişe ve diyafram arka alt bir yeraltı chann için bağlıEl paketinin iki ucunda tüpleri ile donatılmıştır. Hücreler flakon kültüre ve sonda üst hücre ölçüm elektrodu, akışkan portları hücreye az düzeyde rahatsızlık vererek çözüm alışverişini kolaylaştırmak dışında iki channel.The takılı bir tarafından izlenir; intrasellüler için cam pipetler göre bu bir avantaj perfüzyon. <img alt="Şekil 1." src="/files/ftp_upload/3288/3288fig1.jpg" /> Şekil 1. yama klemp NRCC çip kullanan ölçüm prensibi Biz burada detay sterilize ve asal cips, onlara yük hücreleri ile orta, plaka, ve nihayet elektrofizyolojik kayıtlar için bunları kullanmak için protokolleri.

Watch this Scientific Journal Video about Culturing and Electrophysiology of Cells on NRCC Patch-clamp Chips at JoVE.com

Culturing and Electrophysiology of Cells on NRCC Patch-clamp Chips

Biz hücreler ile kaplanmış orta yüklenen astarlanmalıdır Kanada Ulusal Araştırma Konseyi, sterilize edilir,, fabrikasyon ve elektrofizyolojik kayıtlar için kullanılan düzlemsel patch-klemp cips göstermektedir.

Hücreler NRCC Patch-klemp Chips kültür ve Elektrofizyoloji

Due to its exquisite sensitivity and the ability to monitor and control individual cells at the level of ion channels, patch-clamping is the gold standard ...

culturing-and-electrophysiology-of-cells-on-nrcc-patch-clamp-chips

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

Patch clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated from a variety of species have been described previously1-4 but this video represents the first application of those techniques to hair cells from zebrafish. Here we demonstrate a method to isolate healthy, intact hair cells from all of the inner ear end-organs: saccule, lagena, utricle and semicircular canals. Further, we demonstrate the diversity in hair cell size and morphology and give an example of the kinds of patch clamp recordings that can be obtained. The advantage of the use of this zebrafish model system over others stems from the availability of zebrafish mutants that affect both hearing and balance. In combination with the use of transgenic lines and other techniques that utilize genetic analysis and manipulation, the cell isolation and electrophysiological methods introduced here should facilitate greater insight into the roles hair cells play in mediating these sensory modalities.

The purpose of this video is to demonstrate procedures for obtaining healthy, intact hair cells from the inner ear organs of adult zebrafish and then using them for patch clamp studies aimed at characterizing the biophysical properties of their voltage-gated channels.

İç Kulak Saç Hücreleri Patch Clamp Kayıtlar İzole Zebrafish gelen

Patch  clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated  from a variety of species have been described previously1-4 but this  ...

Nörobilim

Whole Cell Patch Clamp for Investigating the Mechanisms of Infrared Neural Stimulation

It has been demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to elicit electrical responses in neural tissue, independent of any further modification of the target tissue. Infrared neural stimulation has been reported in a variety of peripheral and sensory neural tissue in vivo, with particular interest shown in stimulation of neurons in the auditory nerve. However, while INS has been shown to work in these settings, the mechanism (or mechanisms) by which infrared light causes neural excitation is currently not well understood. The protocol presented here describes a whole cell patch clamp method designed to facilitate the investigation of infrared neural stimulation in cultured primary auditory neurons. By thoroughly characterizing the response of these cells to infrared laser illumination in vitro under controlled conditions, it may be possible to gain an improved understanding of the fundamental physical and biochemical processes underlying infrared neural stimulation.

Infrared nerve stimulation has been proposed as an alternative to electrical stimulation in a range of nerve types, including those associated with the auditory system. This protocol describes a patch clamp method for studying the mechanism of infrared nerve stimulation in a culture of primary auditory neurons.

Kızılötesi Sinir Stimülasyon en mekanizmaları incelenmesi için tüm Hücre Patch Kelepçe

It has been  demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to  elicit electrical responses in neural tissue, independent of ...

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable history as a model of nervous system function, with particular significance in studies of learning and memory. The typical preparations for such studies are ones in which the sensory and motoneurons are left intact in a minimally dissected animal, or a technically elaborate neuronal co-culture of individual sensory and motoneurons. Less common is the isolated neuronal preparation in which small clusters of nominally homogeneous neurons are dissociated into single cells in short term culture. Such isolated cells are useful for the biophysical characterization of ion currents using patch clamp techniques, and targeted modulation of these conductances. A protocol for preparing such cultures is described. The protocol takes advantage of the easily identifiable glutamatergic sensory neurons of the pleural and buccal ganglia, and describes their dissociation and minimal maintenance in culture for several days without serum.

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

We describe the dissection of the nervous system of the marine sea hare Aplysia after anesthesia, the isolation of neurons for short term-tissue culture, and recordings of single cell ion currents via the patch clamp technique.

Duyusal nöronlar izolasyonu<em&gt; Aplysia californica</em&gt; Glutamaterjik Akımlar Patch Kelepçe Kayıtlar için

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable  history as a model of nervous system function, with particular significance in  studies ...

Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells

Mauthner cells (M-cells) are large reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key neurons involved in a characteristic behavior known as the C-start or escape response that occurs when the organism perceives a threat. The M-cell has been extensively studied in adult goldfish where it has been shown to receive a wide range of excitatory, inhibitory and neuromodulatory signals1. We have been examining M-cell activity in embryonic zebrafish in order to study aspects of synaptic development in a vertebrate preparation. In the late 1990s Ali and colleagues developed a preparation for patch clamp recording from M-cells in zebrafish embryos, in which the CNS was largely intact2,3,4. The objective at that time was to record synaptic activity from hindbrain neurons, spinal cord neurons and trunk skeletal muscle while maintaining functional synaptic connections within an intact brain-spinal cord preparation. This preparation is still used in our laboratory today. To examine the mechanisms underlying developmental synaptic plasticity, we record excitatory (AMPA and NMDA-mediated)5,6 and inhibitory (GABA and glycine) synaptic currents from developing M-cells. Importantly, this unique preparation allows us to return to the same cell (M-cell) from preparation to preparation to carefully examine synaptic plasticity and neuro-development in an embryonic organism. The benefits provided by this preparation include 1) intact, functional synaptic connections onto the M-cell, 2) relatively inexpensive preparations, 3) a large supply of readily available embryos 4) the ability to return to the same cell type (i.e. M-cell) in every preparation, so that synaptic development at the level of an individual cell can be examined from fish to fish, and 5) imaging of whole preparations due to the transparent nature of the embryos.

We have developed an intact brain-spinal cord preparation to record and monitor electrical activity via patch clamp recording from the Mauthner neurons and other reticulospinal cells in zebrafish embryos. Thus, we are able to record excitatory and inhibitory synaptic currents, voltage-gated channel activity and action potentials from key neurons in a developing embryo.

Embriyonik Zebra balığı Mauthner Hücreler Patch Kelepçe Kayıtlar

Mauthner cells (M-cells) are large  reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key  neurons involved in a characteristic ...

A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System

The patch-clamp technique is today the most well-established method for recording electrical activity from individual neurons or their subcellular compartments. Nevertheless, achieving stable recordings, even from individual cells, remains a time-consuming procedure of considerable complexity. Automation of many steps in conjunction with efficient information display can greatly assist experimentalists in performing a larger number of recordings with greater reliability and in less time. In order to achieve large-scale recordings we concluded the most efficient approach is not to fully automatize the process but to simplify the experimental steps and reduce the chances of human error while efficiently incorporating the experimenter's experience and visual feedback. With these goals in mind we developed a computer-assisted system which centralizes all the controls necessary for a multi-electrode patch-clamp experiment in a single interface, a commercially available wireless gamepad, while displaying experiment related information and guidance cues on the computer screen. Here we describe the different components of the system which allowed us to reduce the time required for achieving the recording configuration and substantially increase the chances of successfully recording large numbers of neurons simultaneously.

Multi-electrode patch-clamp recordings constitute a complex task. Here we show how, by automating of many of the experimental steps, it is possible to accelerate the process leading to qualitative improvement in performance and number of recordings.

Bilgisayar destekli Çoklu elektrot Patch-kelepçe Sistemi

The patch-clamp technique is today the most  well-established method for recording electrical activity from individual  neurons or their subcellular ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal population (10-20%), but show a high level of physiological, morphological, and neurochemical heterogeneity, reflecting their diverse functions. Therefore, investigation of interneurons provides important insights into the organization principles and function of neuronal circuits. This, however, requires an integrated physiological and neuroanatomical approach for the selection and identification of individual interneuron types. Whole-cell patch-clamp recording from acute brain slices of transgenic animals, expressing fluorescent proteins under the promoters of interneuron-specific markers, provides an efficient method to target and electrophysiologically characterize intrinsic and synaptic properties of specific interneuron types. Combined with intracellular dye labeling, this approach can be extended with post-hoc morphological and immunocytochemical analysis, enabling systematic identification of recorded neurons. These methods can be tailored to suit a broad range of scientific questions regarding functional properties of diverse types of cortical neurons.

Cortical networks are controlled by a small, but diverse set of inhibitory interneurons. Functional investigation of interneurons therefore requires targeted recording and rigorous identification. Described here is a combined approach involving whole-cell recordings from single or synaptically-coupled pairs of neurons with intracellular labeling, post-hoc morphological and immunocytochemical analysis.

Morphologically- ve nörokimyasal tanımlanan hipokampal internöronlardan gelen tüm hücre Patch-kelepçe Kayıtlar

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

Beyin Dilimleri tüm hücre Patch-kelepçe Kayıtlar

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding these fundamental functions will shed light on the information transfer in these neurons. Dendritic patch-clamp recordings provide the possibility to directly examine the electrical properties of dendrites and underlying voltage-gated ion channels. However, these fine structures are not easily accessible to patch pipettes because of their small diameter. This report describes a step-by-step procedure to collect stable and reliable recordings from the dendrites of dopaminergic neurons in acute slices. Electrophysiological measurements are combined with post hoc recovery of cell morphology. Successful experiments rely on improved preparation of slices, solutions and pipettes, adequate adjustment of the optics and stability of the pipette in contact with the recorded structure. Standard principles of somatic patch-clamp recording are applied to dendrites but with a gentler approach of the pipette. These versatile techniques can be implemented to address various questions concerning the excitable properties of dendrites.

Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro.

Nigral Dopamin Nöronlar somatodendritik Domain hücre içi Patch-kelepçe Kayıtlar

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding ...

Patch Clamp Recording of Starburst Amacrine Cells in a Flat-mount Preparation of Deafferentated Mouse Retina

The mammalian retina is a layered tissue composed of multiple neuronal types. To understand how visual signals are processed within its intricate synaptic network, electrophysiological recordings are frequently used to study connections among individual neurons. We have optimized a flat-mount preparation for patch clamp recording of genetically marked neurons in both GCL (ganglion cell layer) and INL (inner nuclear layer) of mouse retinas. Recording INL neurons in flat-mounts is favored over slices because both vertical and lateral connections are preserved in the former configuration, allowing retinal circuits with large lateral components to be studied. We have used this procedure to compare responses of mirror-partnered neurons in retinas such as the cholinergic starburst amacrine cells (SACs).

This protocol demonstrates how to perform whole-cell patch clamp recording on retinal neurons from a flat-mount preparation.

Deafferentated Fare Retina bir düz montaj Hazırlık patlaması amacrine hücreleri Yama Kelepçe Kaydı

The mammalian retina is a layered tissue composed of multiple neuronal types. To understand how visual signals are processed within its intricate synaptic ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate electrical processes in target cells. In this context, ion selectivity of a channelrhodopsin is of particular importance. This article describes the investigation of chloride selectivity for a recently identified anion-conducting channelrhodopsin of Proteomonas sulcata via electrophysiological patch-clamp recordings on HEK293 cells. The experimental procedure for measuring light-gated photocurrents demands a fast switchable &#8211; ideally monochromatic &#8211; light source coupled into the microscope of an otherwise conventional patch-clamp setup. Preparative procedures prior to the experiment are outlined involving preparation of buffered solutions, considerations on liquid junction potentials, seeding and transfection of cells, and pulling of patch pipettes. The actual recording of current-voltage relations to determine the reversal potentials for different chloride concentrations takes place 24 h to 48 h after transfection. Finally, electrophysiological data are analyzed with respect to theoretical considerations of chloride conduction.

This article describes how the ion selectivity of channelrhodopsin is determined with electrophysiological whole-cell patch-clamp recordings using HEK293 cells. Here, the experimental procedure for investigating chloride selectivity of an anion-selective channelrhodopsin is demonstrated. However, the procedure is transferable to other channelrhodopsins of distinct selectivity.