Name: tracking neutrophil intraluminal crawling, transendothelial migration and chemotaxis in tissue by intravital video microscopy
Uploaded: 2011-09-24T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy at JoVE.com

Detta arbete stöddes av ett forskningsanslag från kanadensiska Institutes of Health Research (CIHR, MOP-86.749). L. Liu är mottagare av CIHR New Investigator Award (MSH-95.374).

1. Beredning av Chemoattractant i agarosgel <ol><li> Pipettera 10 ml av 2 × PBS i en 50 ml E-rör och värma upp röret genom att sätta den i en bägare med hett vatten. </li><li> Pipettera 10 ml destillerat vatten och tillsätt 0,4 g agaros pulver i en annan 50 ml E-rör (med locket lite lösa) och hetta upp blandningen tills bara kokning i en mikrovågsugn (för ~ 1 min i en 700-watts mikrovågsugn) . </li><li> Lägg till det uppvärmda 2 × PBS till agaroslösningen rör, snurra blandade lösningen och hålla det...

<ol>
	<li>Liu, L., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+leukocyte+recruitment:+organ-specific+mechanisms+of+action.">Molecular mechanisms of leukocyte recruitment: organ-specific mechanisms of action.</a> Thromb. Haemost. 89, 213-220 (2003).</li><li>Petri, B., Phillipson, M., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiology+of+leukocyte+recruitment:+an+in+vivo+perspective.">The physiology of leukocyte recruitment: an in vivo perspective.</a> J. Immunol. 180, 6439-6446 (2008).</li><li>Phillipson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraluminal+crawling+of+neutrophils+to+emigration+sites:+a+molecularly+distinct+process+from+adhesion+in+the+recruitment+cascade.">Intraluminal crawling of neutrophils to emigration sites: a molecularly distinct process from adhesion in the recruitment cascade.</a> J. Exp. Med. 203, 2569-2575 (2006).</li><li>Wong, C. H., Heit, B., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+regulators+of+leucocyte+chemotaxis+during+inflammation.">Molecular regulators of leucocyte chemotaxis during inflammation.</a> Cardiovasc. Res. 86, 183-191 (2010).</li><li>Gavins, F. N., Chatterjee, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+for+the+study+of+mouse+microcirculation+in+anti-inflammatory+drug+research:+focus+on+the+mesentery+and+cremaster+preparations.">Intravital microscopy for the study of mouse microcirculation in anti-inflammatory drug research: focus on the mesentery and cremaster preparations.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 49, 1-14 (2004).</li><li>Bullen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopic+imaging+techniques+for+drug+discovery.">Microscopic imaging techniques for drug discovery.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 7, 54-67 (2008).</li><li>Hazelwood, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entering+the+Portal:+Understanding+the+Digital+Image+Recorded+Through+a+Microscope.">Entering the Portal: Understanding the Digital Image Recorded Through a Microscope.</a> Imaging Cellular and Molecular Biological Functions. , 3-43 (2007).</li><li>Hickey, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-selectin+facilitates+emigration+and+extravascular+locomotion+of+leukocytes+during+acute+inflammatory+responses+in+vivo.">L-selectin facilitates emigration and extravascular locomotion of leukocytes during acute inflammatory responses in vivo.</a> J. Immunol. 165, 7164-7170 (2000).</li><li>Cara, D. C., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+as+a+tool+for+studying+recruitment+and+chemotaxis.">Intravital microscopy as a tool for studying recruitment and chemotaxis.</a> Methods Mol. Biol. 239, 123-132 (2004).</li><li>Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LSP1+is+an+endothelial+gatekeeper+of+leukocyte+transendothelial+migration.">LSP1 is an endothelial gatekeeper of leukocyte transendothelial migration.</a> J. Exp. Med. 201, 409-418 (2005).</li><li>Heit, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PI3K+accelerates,+but+is+not+required+for,+neutrophil+chemotaxis+to+fMLP.">PI3K accelerates, but is not required for, neutrophil chemotaxis to fMLP.</a> J. Cell Sci. 121, 205-214 (2008).</li></ol>

Intravital mikroskopi är det viktigt verktyg för att avslöja de cellulära och molekylära mekanismer av leukocyt-rekrytering vid inflammation. Kvantitativa visualisering för bestämning av leukocyt-endotel interaktioner i mikrocirkulation av genomskinligt vävnader såsom cremaster muskler och tarmkäx kvar guldmyntfoten för tillämpning av tekniken 1,5. Den konventionella brightfield intravital mikroskopi har många unika tekniska egenskaper och rekrytering mekanismer som avslöjas i dessa vävnader ä...

Tabell: Material, specifika reagenser och utrustning <table border="1"><tr><td> Namn på reagens / utrustning </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> Polyeten rör, PE10 </td><td> Becton Dickinson </td><td> 427.401 </td><td> ID 0.28mm × OD 0.61mm </td></tr><tr><td> Tusch </td><td> Speedball konst </td><td> Super Black </td><td> 100% kimrök pigment-Inga färgämnen </td></tr><tr><td> BRÄNNJÄRN </td><td> Aaron Medicinska </td><td> AA03 </td><td></td></tr><tr><td> Xylazine </td><td> Bayer HealthCare, Bayer AB </td><td> DIN 02169592 </td><td></td></tr><tr><td> Ketamin hydroklorid </td><td> Bioniche Animal Health Canada, Inc. </td><td> DIN 01989529 </td><td></td></tr><tr><td> Murina rekombinant MIP-2 </td><td> FoU-system </td><td> 452-M2 </td><td></td></tr><tr><td> WKYMVm </td><td> Phoenix Pharmaceuticals, Inc. </td><td> 072-12 </td><td></td></tr><tr><td> Agarosen </td><td> Invitrogen </td><td> 15510-027 </td><td> Ultrarent </td></tr><tr><td> Heparin </td><td> Sigma </td><td> H-3393 </td><td></td></tr><tr><td> Upprätt mikroskop </td><td> Olympus </td><td> BX61WI </td><td></td></tr><tr><td> 3CCD färg videokamera </td><td> SONY </td><td> DXC-990 </td><td></td></tr><tr><td> HD-DVD videoinspelare </td><td> LG Electronics Inc. </td><td> RH398H-M </td><td></td></tr><tr><td> TV-monitor </td><td> LG Electronics Inc. </td><td> 22LG30 </td><td></td></tr><tr><td> Vatten cirkulationspump </td><td> Thermo Scientific </td><td> Haake DC10 </td><td></td></tr><tr><td> Peristaltiska pumpen </td><td> Gilson, Pharmacia </td><td> Gilson MINIPULS 3, Pharmacia P-3 </td><td></td></tr><tr><td> Cremaster muskel ombord </td><td> University of Saskatchewan </td><td></td><td> Hemlagade </td></tr></table>

tracking neutrophil intraluminal crawling, transendothelial migration and chemotaxis in tissue by intravital video microscopy

Rekryteringen av cirkulerande leukocyter från blodbanan till inflammerad vävnad är en viktig och komplicerad process av inflammation 1,2. I postcapillary venoler av inflammerad vävnad, leukocyter början tjuder och rulla på luminala yta venular vägg. Rullande leukocyter gripande på endotelet och genomgå starka adhesion som svar på kemokinreceptorantagonist eller andra chemoattractants på venular ytan. Många anhängare leukocyter flytta från den ursprungliga platsen för vidhäftning till Junktional extravaseringsstället i endotel, kallas en process intraluminal krypande 3. Efter krypande, leukocyter flyttar över endotelet (själavandring) och vandrar i extravaskulära vävnaden mot källan chemoattractant (chemotaxis) 4. Intravital mikroskopi är ett kraftfullt verktyg för att visualisera leukocyt mot endotel interaktioner in vivo och avslöjande cellulära och molekylära mekanismer av leukocyt rekrytering 2,5. I denna rapport ger vi en övergripande beskrivning av att använda brightfield intravital mikroskopi för att visualisera, och fastställa närmare processer neutrofila rekrytering i mus cremaster muskler som svar på gradient av en neutrofil chemoattractant. Att inducera neutrofila rekrytering, en liten bit av agarosgel (~ 1-mm 3 storlek) innehåller neutrofila chemoattractant MIP-2 (CXCL2, en CXC chemokine) eller WKYMVm (TRP-Lys-Tyr-Val-D-Met, en syntetisk analog av bakteriell peptid) är placerad på muskelvävnaden i anslutning till den observerade postcapillary venule. Med tiden förföll video fotografi och datorprogram ImageJ, neutrofila intraluminal kryper på endotel, neutrofila transendothelial migration och migration och kemotaxi i vävnad visualiseras och spåras. Detta protokoll möjliggör tillförlitlig och kvantitativ analys av många neutrofila rekrytering parametrar som intraluminal krypa hastighet, själavandring tid, avskildhet tid, vandringshastigheten, chemotaxis hastighet och kemotaxi index i vävnad. Vi visar att användningen av detta protokoll, kan dessa neutrofila rekrytering parametrar stabilt bestämmas och det enda cell rörelseorganen enkelt spåras in vivo.

Watch this Scientific Journal Video about Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy at JoVE.com

Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy

Vi beskriver ett protokoll för brightfield intravital mikroskopi för att mäta dynamiska neutrofil mot endotel interaktioner under neutrofila rekrytering som svar på källan till en neutrofila chemoattractant in vivo. Neutrofila intraluminal krypande, transendothelial migration och kemotaxi i mus cremaster muskelvävnad visualiseras med tiden förföll video fotografering och spåras med ImageJ.

Spårning neutrofila intraluminal Krypande, Transendothelial migration och kemotaxi i vävnad genom Intravital Video Mikroskopi

The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

Neutrofila Extracellulär Fällor: Hur att generera och visualisera dem

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

Intravital mikroskopi av inguinal Lymph Node

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune ...

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

Intravital Mikroskopi av mjälte: Kvantitativ analys av Parasit Rörlighet och blodflöde

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

In vitro Kokulturanalys för att bedöma patogeninducerad neutrofil transeptelmigration

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

Quantitative Assessment of Human Neutrophil Migration Across a Cultured Bladder Epithelium

Kvantitativ bedömning av Human neutrofilmigrationen över en Odlade blåsans epitel

The recruitment of immune cells from the periphery to the site of inflammation is an essential step in the innate immune response at any mucosal surface. ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Mycket Lösta Intravital Randig-belysning Mikroskopi germinalcenter

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Imaging Neutrofiler och Monocyter i Mesenteric Veins av Intravital Mikroskopi på sövda möss i realtid

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Intravital Imaging of Neutrophil Priming Using IL-1&#946; Promoter-driven DsRed Reporter Mice

Intravital avbildning av neutrofila Priming Använda IL-1 Promoter drivna dsRed Reporter Möss

Neutrophils are the most abundant leukocytes in human blood circulation and are quickly recruited to inflammatory sites. Priming is a critical event that ...

An All-on-chip Method for Rapid Neutrophil Chemotaxis Analysis Directly from a Drop of Blood

En allt-på-chip-metod för snabb neutrofilkemotaxisanalys direkt från en bloddroppe

Neutrophil migration and chemotaxis are critical for our body's immune system. Microfluidic devices are increasingly used for investigating neutrophil ...

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In Vitro Hundarnas neutrofila extracellulära fälla bildandet: Dynamiska och kvantitativ analys av fluorescensmikroskopi

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...