Name: mission lentiplex pooled shrna library screening in mammalian cells
Uploaded: 2011-12-21T12:00:00
Duration: 9 min 12 s
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मिशन सिग्मा Aldrich जैव प्रौद्योगिकी एल.पी. के एक पंजीकृत ट्रेडमार्क है LentiPlex सिग्मा Aldrich जैव प्रौद्योगिकी एल.पी. का एक टे्रडमार्क है

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मैथ्यू जे Coussens, कोर्टनी Corman, एशले एल फिशर, जैक साबूदाना, और जॉन Swarthout सिग्मा Aldrich, जो इस लेख में इस्तेमाल किया उपकरणों और अभिकर्मकों बनाता द्वारा नियोजित कर रहे हैं.

इस अध्ययन में, हम एक जीनोम चौड़ा स्क्रीन / Paclitaxel के TRAIL उपचार के बाद A549 कोशिकाओं के cytotoxicity में शामिल जीन की पहचान उपस्थित थे. एक जीनोम चौड़ा स्क्रीन में जमा दृष्टिकोण का उपयोग समय, लागत, और उपकरण निवेश आम तौर पर पारंपरिक arrayed स्क्रीन के साथ जुड़े कम कर देता है. स्क्रीन की सफलता के लिए महत्वपूर्ण पहले से प्रदर्शन अनुकूलन प्रयोगों हैं. Transduction शर्तों और MOI empirically निर्धारित किया जाना चाहिए. चयन विधि वांछित phenotype (जैसे, अस्तित्व, सतह प्रोटीन अभिव्यक्ति, आदि) प्रदर्शित कोशिकाओं की मजबूत चयन के लिए अनुमति चाहिए. इन मानकों के अनुकूलन झूठी सकारात्मक का पता लगाया संख्या कम हो जाएगा. यहाँ, gDNA चयनित कक्षों के थोक आबादी से काटा गया था और तब Topo व्यक्तिगत shRNA आवेषण पहचान क्लोन. इस प्रयोग के लिए संभव सुधार रहते FACS का उपयोग करने के लिए सुनिश्चित कोशिकाओं के लिए चयन किया गया हैकि केवल जीवित कोशिकाओं को एकत्र कर रहे हैं. लक्ष्यों की पहचान एक स्क्रीनिंग परख में लक्ष्य विशिष्ट shRNAs के साथ पारगमन से मान्य होगा. यह सच है हिट कुओं के बहुमत में phenotype प्रदर्शित करेगा. LentiPlex जमा लाइब्रेरी अपने आवेदन में लचीला है. यह बहाव के अनुप्रयोगों की एक विस्तृत सरणी के साथ संगत है और या तो सकारात्मक या नकारात्मक चयन रणनीतियों के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है. स्क्रीनिंग की स्थिति पर निर्भर करता है, shRNA आवेषण के deconvolution पीसीआर / क्लोनिंग, माइक्रोएरे, या अगली पीढ़ी 9 अनुक्रमण, 10 के माध्यम से पूरा किया है जबकि शक्ति और इन तकनीकों की गति आरएनएआई स्क्रीन deconvolute अच्छी तरह से स्थापित है, माइक्रोएरे के साथ एक चिंता का विषय है और. अगली पीढ़ी के अनुक्रमण तरीकों जैव सूचना विज्ञान संसाधनों और ज्ञान को सही ढंग से विश्लेषण और प्रायोगिक परिणामों की व्याख्या की जरूरत है की उपलब्धता है. इन तकनीकों के साथ जुड़े लागत अक्सर बार जीनोम चौड़ा स्क्रीन के उपक्रम के लिए एक बाधा हो सकते हैं. एपी/ सीआर क्लोनिंग आधारित दृष्टिकोण है, जबकि प्रोटीन और अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के रूप में के रूप में शक्तिशाली नहीं है एक प्रभावी और कम लागत वैकल्पिक है. Agilent अब एक कस्टम टीआरसी shRNA LentiPlex स्क्रीन में आगे सहायता के लिए पुस्तकालय के आधार पर सरणी प्रदान करता है. इन विकल्पों के शोधकर्ताओं LentiPlex का उपयोग करने के लिए सेलुलर कार्यों की एक विविध रेंज का अध्ययन करने की अनुमति देते हैं.

<html><table border="1"><tbody><tr><td> अभिकर्मक के नाम </td><td> कंपनी </td><td> सूचि संख्या </td></tr><tr><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=SHPH01%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">LentiPlex जमा ऐरे</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html" target="_blank">सिग्मा Aldrich</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=SHPH01%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">SHPH01</a> </td></tr><tr><td> A549 कक्ष </td><td> ATCC </td><td> सीसीएल-185 </td></tr><tr><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=T5694%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">TRAIL</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html" target="_blank">सिग्मा Aldrich</a> </td><td><html> oductDetail.do lang = en N4 और = T5694% 7CSIGMA और N5 = SEARCH_CONCAT_PNO% 7CBRAND_KEY एंड एफ कल्पना = &quot;&gt; T5694 </td></tr><tr><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=T7402%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">Paclitaxel</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html" target="_blank">सिग्मा Aldrich</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=T7402%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">T7402</a> </td></tr><tr><td> Topo टीए क्लोनिंग किट </td><td> Invitrogen </td><td> K4575-01 </td></tr><tr><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=P2893%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">जम्पस्टार्ट Taq Readymix</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html" target="_blank">सिग्मा Aldrich</a> </td><td>ONCAT_PNO% 7CBRAND_KEY एंड एफ कल्पना = &quot;&gt; P2893 </td></tr><tr><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=PLN70%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">GenElute प्लाज्मिड Miniprep किट</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html" target="_blank">सिग्मा Aldrich</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=PLN70%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">PLN70</a> </td></tr><tr><td> EcoR1 </td><td> न्यू इंग्लैंड Biolabs </td><td> R0101 </td></tr><tr><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=H9268%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">hexadimethrine ब्रोमाइड</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html" target="_blank">सिग्मा Aldrich</a> </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=H9268%7CSIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&F=SPEC">H9268</a> &lt;/ P&gt; </tr></tbody></table>

mission lentiplex pooled shrna library screening in mammalian cells

शाही सेना हस्तक्षेप (आरएनएआई) जीन अभिव्यक्ति के नियमन के लिए एक आंतरिक सेलुलर तंत्र है. दोहन ​​इस प्रणाली के जन्मजात शक्ति जीन समारोह के अध्ययन के नुकसान में पछाड़ना जीन अभिव्यक्ति के स्तर के लिए हमें सक्षम बनाता है. आरएनएआई प्रदर्शन के लिए दो मुख्य तरीके हैं. पहले छोटे हस्तक्षेप (siRNAs) RNAs कि रासायनिक संश्लेषित कर रहे हैं का उपयोग है, और दूसरा इस्तेमाल कम बाल के लिये कांटा (shRNAs) RNAs 1 plasmids के भीतर इनकोडिंग. बाद कोशिकाओं में ट्रांसफ़ेक्ट किया जा सकता है है सीधे या प्रतिकृति अक्षम lentiviral कणों में पैक. lentiviral shRNAs का उपयोग करने का मुख्य लाभ सेल प्रकार, उनके stably दीर्घकालिक जीन मारकर गिरा दिया और चयन के लिए जीनोम में एकीकृत करने की क्षमता है, और उच्च throughput समारोह स्क्रीन के नुकसान के संचालन में उनकी प्रभावकारिता की एक विस्तृत विविधता में शुरूआत में आसानी है. इस सुविधा के लिए हम shRNA पुस्तकालय LentiPlex जमा बनाया है. एमआईएसएसआईओएन LentiPlex मानव shRNA जमा लाइब्रेरी एक जीनोम चौड़ा lentiviral उत्पादन पूल एक मालिकाना प्रक्रिया का उपयोग है. पुस्तकालय shRNA constructs ७५००० अधिक टीआरसी संग्रह से 15,000 लक्ष्यीकरण + मानव जीन 2 के होते हैं . प्रत्येक लायब्रेरी shRNA प्रतिनिधित्व के लिए उत्पाद रिलीज से पहले परीक्षण किया है मजबूत पुस्तकालय कवरेज सुनिश्चित करने के लिए. पुस्तकालय में कम से कम 5 x 10 8 p24 परख के माध्यम से टीयू / एमएल के titers में एक प्रारूप तैयार करने के लिए उपयोग lentiviral प्रदान की जाती है और पूर्व विभाजित लगभग 8000 shRNA के दस subpools में प्रत्येक constructs. प्रवर्धन और अनुक्रमण प्राइमरों भी बहाव के लक्ष्य की पहचान के लिए प्रदान की जाती हैं. पिछले अध्ययनों TRAIL की एक synergistic अर्बुदरोधी गतिविधि की स्थापना जब A549 कोशिकाओं, एक मानव फेफड़ों कार्सिनोमा सेल पंक्ति 3, 4 में Paclitaxel के साथ संयुक्त . इस अध्ययन में हम एक LentiPlex जमा shRNA पुस्तकालय के आवेदन तेजी से cytotoxicity ओ में शामिल जीनों के लिए एक सकारात्मक चयन स्क्रीन का संचालन करने के लिए दिखाना हैच A549 कोशिकाओं है जब TRAIL और Paclitaxel से अवगत कराया. एक उच्च throughput स्क्रीन के साथ अक्सर सामना करना पड़ा बाधा लागत और deconvolution में कठिनाई है, हम भी एक लागत प्रभावी पॉलीक्लोनल पारंपरिक अनुक्रमण उपयोग दृष्टिकोण विस्तार.

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MISSION LentiPlex Pooled shRNA Library Screening in Mammalian Cells

यहाँ हम एक मानव LentiPlex जमा पुस्तकालय और पारंपरिक तरीकों अनुक्रमण जीन सेल अस्तित्व को बढ़ावा देने के लक्ष्यों की पहचान का उपयोग करें. हम दिखाना है कैसे स्थापित करने और एक LentiPlex स्क्रीन deconvolute और परिणाम को मान्य.

मिशन LentiPlex स्तनधारी कोशिकाओं में जमा shRNA पुस्तकालय स्क्रीनिंग

RNA interference (RNAi) is an intrinsic cellular mechanism for the regulation of gene expression. Harnessing the innate power of this system enables us to ...

Research

JoVE Journal

Biology

Trypsinizing and Subculturing Mammalian Cells

Trypsinizing और स्तनधारी कोशिकाओं Subculturing

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in ...

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

आरएनएआई स्क्रीनिंग के लिए स्तनधारी कोशिकाओं में मिशन esiRNA

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Genome-wide Screen for miRNA Targets Using the MISSION Target ID Library

MiRNA मिशन लक्ष्य आईडी पुस्तकालय का उपयोग लक्ष्य के लिए जीनोम चौड़ा स्क्रीन

The Target ID Library is designed to assist in discovery and identification of microRNA (miRNA) targets. The Target ID Library is a plasmid-based, ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

सेल चक्र स्थिति के स्तनधारी कोशिकाओं में विश्लेषण

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

स्तनधारी कोशिकाओं में endoplasmic जालिका स्थानीयकृत mRNAs का विज़ुअलाइज़ेशन

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

संवर्धित स्तनधारी कोशिकाओं में जैविक रास्ते की Ubiquitin और ubiquitin की तरह सिस्टम नियामकों की पहचान siRNA स्क्रीनिंग

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

स्तनधारी कोशिकाओं में हीम संश्लेषण स्तर की माप

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

संवर्धित स्तनधारी कोशिकाओं में व्यापक समानांतर रिपोर्टर Assays

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

इमेजिंग स्थानीय सीए<sup&gt; 2 +</sup&gt; संवर्धित स्तनधारी कोशिकाओं में सिग्नल

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

निर्देशन में विकास विधि<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;: उत्परिवर्ती पुस्तकालय निर्माण और स्क्रीनिंग

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that ...