Name: imaging pheromone sensing in a mouse vomeronasal acute tissue slice preparation
Uploaded: 2011-12-06T12:00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Pheromone Sensing in a Mouse Vomeronasal Acute Tissue Slice Preparation at JoVE.com

Vi vil gerne takke især Monique Nenniger Tosato for hendes fremragende tekniske support samt Jean-Yves Chatton for hans videnskabelige råd og de billeddannende CIF platform UNIL for mikroskopet udstyr. Finansieringen blev leveret af den schweiziske National Science Foundation.

1. Dissektion af musen VNO <ol><li> Brug voksne mus. Som feromon sensing er impliceret i multimodalities, omhyggelig skelnen mellem stammer, genotyper, køn og aldre er vigtigt og vil påvirke dine resultater. Her vælger vi voksne VG mus 30 tidligere blev brugt til identifikation af et feromon-receptor par (2-heptanon-V1rb2) 31 (Fig. 1A). </li><li> Før du starter dissektion, lav en frisk kold kunstige cerebrospinalvæsken (ACSF; NaCl 118 mm, NaHCO 3 25 mm, D-glucose 10 mM, KCl 2 mm, MgCl 2 2 mM, NaH 2 PO 4 1.2 mM, CaCl 2 2 mM, pH 7,4) mættet med oxycarbon (95% O 2: 5% CO 2). For at blande alle de ACSF komponenter undtagen CaCl 2. Gennemvæd den løsning ved direkte at blaese det med oxycarbon. I sidste ende, tilsæt CaCl 2 og juster med Hedeselskabet 2 0 til den ønskede lydstyrke. Hold ACSF løsning på is indtil uSE. </li><li> Eutanasi af musen skal fortrinsvis ske ved dislokation af halsen eller ved CO 2 indånding lige før eksperimentet. </li><li> Skær musen hovedet. Placer det under en dissektionsmikroskop i koldt ACSF kontinuerligt oxycarbonated. </li><li> Skær underkæben og position hovedet for at visualisere ganen (Fig. 1B). </li><li> Lav et snit vandret i den øverste del af ganen (Fig. 1B) med mikro saks og fjerne ganen membran med micro dissekere pincet. Fugte og rense udsatte hulrum med ACSF (Fig. 1C). </li><li> Skær den øverste og den nederste del af næseskillevæggen (Fig. 1C). Fint ekstrakt af næseskillevæggen indeholder VNO og læg den direkte i ACSF på is (Fig. 1D). </li><li> Separate lodret de to dele af VNO ved hjælp af mikro dissekere pincet og fint fjerne bruskspidserne kapsel af VNO (Fig. 1E). Sørg for, at alle bruskspidserne stykker er fjernet. </li></ol> 2. VNO væv skive forberedelse Den VNO væv skive der er beskrevet i dette afsnit 2) er primært for calcium billeddannelse undersøgelser. VNO skiver kan også bruges til immunohistostainings på flydende skiver for at verificere den strukturelle integritet af vævet (se afsnit 3), i protokollen). <ol><li> Forbered lavtsmeltende agar (3% i standard PBS) og din arbejdsplads. Du skal bruge ACSF, en microtome og understøtter, mikro dissekere pincet, indlejring af skimmelsvampe (22 x 22 x 20 mm), præcision klude, pensler, vævskultur plader, cyanacrylat lim, is og et termometer. </li><li> Fyld integrering formen med 3% lavtsmeltende agar. Sørg for, at temperaturen ikke er højere end 41 ° C, før du placerer lodret for kort tid tørres VNO (Fig. 2A) for at kunne opnå koronale skiver. </li><li> Placer indlejring mug på isi 1 min indtil størkning og derefter adskille den fra agar blok. Skær agar blok i en pyramideformet form og læg den med lim på microtome støtte (Fig. 2B). </li><li> Skær koronale VNO skiver med microtome, med en hastighed på 0,5 mm / s, en amplitude på 0,7 mm og en tykkelse på 100 ìm i koldt ACSF og indsamle vævet skiver med en pensel, før du placerer dem i en vævskultur tallerken fyldt med kold ACSF. </li><li> Hvis dine skiver indeholder endogene fluorescens som GFP (i gen-målrettet neuroner) kan du vælge dem under en fluorescerende stereomikroskop (Fig. 2C). </li></ol> 3. Immunhistokemi på VNO flydende skiver Målet med denne procedure er at verificere integriteten af ​​VNO væv skiver opnået i afsnit 2). Acetyleret-tubulin er en mikrotubuli / cytoskeleton markør udtrykt i dendritter og microvilli af VNO sensoriske neuroner. For calcium imaging eksperimenter, gå retningtly til afsnit 4) af protokollen. Den immunohistostaining metode på flydende VNO skiver kan tilpasses til evalueringen af ​​ekspressionen af ​​ethvert protein af interesse. Til dette formål anbefaler vi, at du rette VNO til 1 time ved 4 ° C i en fikseringsopløsning (paraformaldehyd 4% i PBS, pH 7,6) efter punkt 1.7), i protokollen og bruge fra dette punkt PBS ved pH 7,6 i stedet for ACSF løsning. <ol><li> I vævskultur plade, lave jeres skiver af interesse for en fikseringsopløsning (paraformaldehyd 4% i PBS, pH 7,6) 1 time ved 4 ° C. </li><li> Bloker din væv skiver natten over ved 4 ° C i en PBS opløsning, der indeholder NGS (normal ged serum) 10% og Triton X-100 på 0,5%. </li><li> Inkubér skiver med det primære antistof (anti-acetyleret-tubulin, mus, 1:2000) til 16h ved stuetemperatur (RT) i en PBS-løsning indeholdende NGS 5% og Triton X-100 på 0,25%. </li><li> Vask 3 gange i 5 minutter med en PBS-opløsning indeholdende NGS 2%. </li><li> Inkuber i mørke med secondary antistof (Cy5-konjugeret gede anti-mus, 1:200) i en PBS-opløsning med NGS 2% til 1 time ved RT. </li><li> Vask 3 gange i 5 minutter med PBS indeholdende NGS 2%, PBS NGS 1% og PBS alene. </li><li> Montere din skiver på en fluorescerende montering medier (der indeholder eller ikke DAPI) ved at placere dem i centrum af den hydrofobe afgrænsede zoner (brug en hydrofobisk pen), og dækker skiver med dækglas. </li><li> Fremsætte bemærkninger og opkøb med konfokal mikroskopi og en software der giver den 3D rekonstruktioner (Fig. 2D-F). </li></ol> 4. Calcium imaging på VNO skiver <ol><li> Følgende procedurer vil finde sted i mørket. Inkuber VNO skiver til 1 time ved 37 ° C i en læsning opløsning bestående af kolde ACSF med Fura-2:00 (7 μM; stamopløsning af 1 mM i DMSO) og pluronic 0,1% (w / v; stamopløsningen på 20% i Hedeselskabet 2 O). </li><li> Hold læsset skiver på is med oxycarbonation indtil brug. Loaded skiver kan opbevares i3-4h. </li><li> Placer læsset skiver med en pensel i en perfusion kammer indeholder ACSF og vedligeholde skiver med en serviet slice anker (Fig. 3A). </li><li> Placer perfusionen kammeret på scenen af et calcium imaging mikroskop (Fig. 3B) og løbende perfuse med oxycarbonated ACSF på RT. Temperaturen kan tilpasses med brug af en bipolar temperatur controller. </li><li> Observationer af de indlæste VNO skiver (Fig. 3C-E) er udført med en omvendt fluorescens mikroskop, med en 25x eller 63x objektiv og en cool SNAP-HQ kamera. Belysning sker sekventielt (340 / 380 nm) med en polychromator instrument og indspillet med en hastighed på 5Hz. Filtreret emission sker ved 510 nm. Intracellulær calcium forholdet ændringer (ΔF = 340 nm/380 nm) er overvåget med en passende software. </li><li> Chemostimulation skal vælges i henhold til dine egne eksperimentelle formål. Her perfusions af ACSF indeholder et feromon mIX (isobutylamin, 2-heptanon, 4-heptanon, 2-heptanol, pentylacetate, dimethylpyrazine, α / β-farnesene, 10 -6 M), 2-heptanon (10 -6 M) eller friskt indsamlet mandlige og kvindelige (1: 1) mus urin (1:100) udføres 32. Perfusion af ATP (125 μM) anvendes som en levedygtig test i slutningen af forsøgene (fig. 3F) og skal angive en andel på ca 80% levedygtige neuroner. Under disse betingelser, kan skiverne bruges op til 2 timer. </li><li> GFP-taggede delpopulationer af sensoriske neuroner er visualiseret ved særlige belysning (her V1rb2 udtrykke neuroner) og kan analyseres præcist (Fig. 3G-I). </li></ol> 5. Repræsentative resultater: At etablere en funktionel analyse til at undersøge den multi transduktion veje finder sted i mus VNO, eller til at identificere nye feromon-receptor par, vi drage fordel af de VG musen linje (Fig. 1A </strong&gt;). I denne linje, én ud af 240 V1Rs receptorer de V1Rb2 receptoren er GFP-tagget der gør det nemt visualisering af en særlig delpopulation af vomeronasal sensoriske neuroner. Efter ekstraktion og dissektion af VNO (Fig. 1E), udarbejder vi akut VNO skiver (Fig. 2C). Vi fastsætter en brøkdel af dem, med henblik på at kontrollere og validere tissular integritet præparatet ved at udføre immunohistostainings mod acetyleret-tubulin protein (Fig. 2D-F). Den anden fraktion af skiver bruges til calcium billeddannelse eksperimenter. Til det er skiver fyldt med Fura-02:00 (Fig. 3C-E) og det intracellulære calcium niveauet for hver neuron er overvåget som en ΔF ratio (Fig. 3F). Levedygtighed neuroner vurderes ved perfusion af ATP (125 μM), hvorefter hurtige og forbigående stigning i ΔF ventes (Fig. 3F). Urin er en vigtig kilde til feromoner, perfusion af friskly indsamlet musen urin (1:100) anvendes som endogen kontrol. Det udløser calcium transienter i ca 50% af de registrerede neuroner (celle 1 og 2, fig. 3F). Under GFP belysning, er V1Rb2 positive neuroner observerbare, og perfusion af dets kendte pheromonal ligand, 2-heptanon, indleder cellulære aktivering (celle 1, Fig. 3I). Interessant nok er neuronal aktiveringer også kan konstateres på en brøkdel af neuroner, der ikke udtrykker V1Rb2 receptoren (GFP negativ neuroner) (celle 2, fig. 3I), hvilket viser kompleksiteten af feromon kodning i VNO. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/3311/3311fig1.jpg" /> Figur 1. Dissektion af musen vomeronasal orgel. (A) En mus fra VG linje. (B) Efter aflivning af musen, er den fulde hovedet henføres under en kikkert mikroskop og underkæben er fjernet med henblik på at visualisere ganen. En lille vandret snit sker(Sort stiplet linje). (C) Efter fjernelse af ganen er næseskillevæggen foret med VNO skåret i den øvre og den nedre del (hvide stiplede linjer) for at lette VNO udvinding. (D) VNO er ​​placeret i ACSF løsning og adskilt (indsæt: højere magt betragtning af de to dele). (E) bruskspidserne kapsel VNO er ​​fint fjernes, og VNO uden bruskspidserne kapsel er anvendt til resten af ​​forsøgene. Skala barer er: BE, 1 mm. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/3311/3311fig2.jpg" /> Figur 2. Mouse vomeronasal akut slice forberedelse og tissular integritet. (A) Musen VNO er ​​vertikalt integreret i en agar 3% opløsning. Temperaturen på agar skal være lavere end 41 ° C. (B) Agar-blok er skåret i en pyramideformet form og 100 mM VNO sektioner (sort stiplet linie) er genereret i ACSF. (C) VNO skiver kan vælges under en fluorescerende stereomikroskop for at visualisere en bestemtpopulation af tagged sensoriske neuroner. (DF) Tissular integritet kan evalueres ved immunohistostainings mod acetyleret-tubulin protein, en højere magt udsigt over V1rb2 genet målrettet neuroner demonstrere den perfekte bevarelse af præparatet. Neuroner med deres lange dendritter nå overfladen af ​​lumen (E) samt et udtryk for den strukturelle protein i dendritiske drejeknapper og microvilli kan observeres (F). Skala barer er: B, 5 mm, C, 60 my, D, 40 μm, EF, 20 μm. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/3311/3311fig3.jpg" /> Figur 3. Calcium billedbehandling og feromon detektion i vomeronasal akutte væv skiver. (A) Efter en Fura-02:00 loading fase, er VNO skiver placeret i et perfusion kammer og fastholdes med en tilpasset anker (højeffekt view). (B) Forsøgene udføres i mørke og VNO skiver løbende perfunderet med ACSF på RT med et vakuumsystem. Temperaturen kan chosDA ved hjælp af en temperatur controller system bestående af en bipolar Pelletier element og en termisk sonde. Denne særlige Forsøget blev udført på RT. (CE) VNO skiver er observerbare under Hoffman fasekontrast (C, HV) eller Fura 380 nm belysning før (D) og i løbet af neuronal aktivering (E, her med ATP). (F) Neuronal levedygtighed vurderes med perfusion af ATP (125 m). Her er chemostimulation færdig med urin (urin, 1:100) eller med en blanding af mus feromoner (mix ph., 10 -6 M) ved en konstant gennemstrømningshastighed på 165 ml / t. Intracellulær calcium niveauer (ΔF) kan optages individuelt for hver enkelt celle (celle 1 til 3). (G) En V1Rb2 neuron er visualiseret under GFP belysning (1). (H) indlæsning af denne neuron (1) samt en ikke-V1rb2 udtrykke neuron (2) er vist. (I) V1rb2 neuron er i stand til at reagere på 2-heptanon med en intracellulær calcium stige. Denne særlige ikke-V1rb2 udtrykke neuron imødekommer også 2-heptanon (celle 2). Skala barer er: CE, 20 μm, GH,15 μm; ΔF = 340 nm / 380 nm. (F og I) Varighed af stimulus ansøgningen er angivet med barer under hvert spor. Den vilkårlige farveskala repræsenterer fluorescensintensitet.

<ol>
	<li>Karlson, P., L&#252;scher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Pheromones"+a+new+term+for+a+class+of+biologically+active+substances.">"Pheromones" a new term for a class of biologically active substances.</a> Nature. 183, 55-56 (1959).</li><li>Cavaggioni, A., Mucignat-Caretta, C., Redaelli, M., Zagotto, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+scent+of+urine+spots+of+male+mice,+Mus+musculus:+Changes+in+chemical+composition+over+time.">The scent of urine spots of male mice, Mus musculus: Changes in chemical composition over time.</a> Rapid Commun. Mass Spectrom. 20, 3741-3746 (2006).</li><li>Novotny, M., Harvey, S., Jemiolo, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry+of+male+dominance+in+the+house+mouse,+Mus+domesticus.">Chemistry of male dominance in the house mouse, Mus domesticus.</a> Experientia. 46, 109-113 (1990).</li><li>Leinders-Zufall, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+pheromone+detection+by+mammalian+vomeronasal+neurons.">Ultrasensitive pheromone detection by mammalian vomeronasal neurons.</a> Nature. 405, 792-796 (2000).</li><li>Leinders-Zufall, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MHC+class+I+peptides+as+chemosensory+signals+in+the+vomeronasal+organ.">MHC class I peptides as chemosensory signals in the vomeronasal organ.</a> Science. 306, 1033-1037 (2004).</li><li>Leinders-Zufall, T., Ishii, T., Mombaerts, P., Zufall, F., Boehm, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+requirements+for+the+activation+of+vomeronasal+sensory+neurons+by+MHC+peptides.">Structural requirements for the activation of vomeronasal sensory neurons by MHC peptides.</a> Nat. Neurosci. 12, 1551-1558 (2009).</li><li>Jemiolo, B., Xie, T. M., Novotny, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Socio-sexual+olfactory+preference+in+female+mice:+attractiveness+of+synthetic+chemosignals.">Socio-sexual olfactory preference in female mice: attractiveness of synthetic chemosignals.</a> Physiol. Behav. 50, 1119-1122 (1991).</li><li>Achiraman, S., Archunan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+urinary+volatiles+in+Swiss+male+mice+(Mus+musculus):+bioassay+of+identified+compounds.">Characterization of urinary volatiles in Swiss male mice (Mus musculus): bioassay of identified compounds.</a> J. Biosci. 27, 679-686 (2002).</li><li>Dulac, C., Torello, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+detection+of+pheromone+signals+in+mammals:+from+genes+to+behaviour.">Molecular detection of pheromone signals in mammals: from genes to behaviour.</a> Nat. Rev. Neurosci. 4, 551-562 (2003).</li><li>Brennan, P. A., Zufall, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pheromonal+communication+in+vertebrates.">Pheromonal communication in vertebrates.</a> Nature. 444, 308-315 (2006).</li><li>Mondor, E. B., Roitberg, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inclusive+fitness+benefits+of+scent-marking+predators.">Inclusive fitness benefits of scent-marking predators.</a> Proc. Biol. Sci. 271, 341-343 (2004).</li><li>Holy, T. E., Dulac, C., Meister, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+of+vomeronasal+neurons+to+natural+stimuli.">Responses of vomeronasal neurons to natural stimuli.</a> Science. 289, 1569-1572 (2000).</li><li>Keverne, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Vomeronasal+Organ.">The Vomeronasal Organ.</a> Science. 286, 716-720 (1999).</li><li>Weiler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+development+of+the+rat+vomeronasal+organ.">Postnatal development of the rat vomeronasal organ.</a> Chem. Senses. 30, 127-128 (2005).</li><li>Zufall, F., Kelliher, K. R., Leinders-Zufall, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pheromone+detection+by+mammalian+vomeronasal+neurons.">Pheromone detection by mammalian vomeronasal neurons.</a> Microsc. Res. Tech. 58, 251-260 (2002).</li><li>Ciges, M., Labella, T., Gayoso, M., Sanchez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructure+of+the+organ+of+Jacobson+and+comparative+study+with+olfactory+mucosa.">Ultrastructure of the organ of Jacobson and comparative study with olfactory mucosa.</a> Acta. Otolaryngol. 83, 47-58 (1977).</li><li>Munger, S. D., Leinders-Zufall, T., Zufall, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subsystem+organization+of+the+mammalian+sense+of+smell.">Subsystem organization of the mammalian sense of smell.</a> Annu. Rev. Physiol. 71, 115-140 (2009).</li><li>Mombaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+and+ligands+for+odorant,+vomeronasal+and+taste+receptors.">Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors.</a> Nat. Rev. Neurosci. 5, 263-278 (2004).</li><li>Ryba, N. J. P., Tirindelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+multigene+family+of+putative+pheromone+receptors.">A new multigene family of putative pheromone receptors.</a> Cell. 19, 371-379 (1997).</li><li>Matsunami, H., Buck, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multigene+family+encoding+a+diverse+array+of+putative+pheromone+receptors+in+mammals.">A multigene family encoding a diverse array of putative pheromone receptors in mammals.</a> Cell. 90, 775-784 (1997).</li><li>Herrada, G., Dulac, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+family+of+putative+pheromone+receptors+in+mammals+with+a+topographycally+organized+and+sexually+dimorphic+distribution.">A novel family of putative pheromone receptors in mammals with a topographycally organized and sexually dimorphic distribution.</a> Cell. 90, 763-773 (1997).</li><li>Dulac, C., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+family+of+genes+encoding+putative+pheromone+receptors+in+mammals.">A novel family of genes encoding putative pheromone receptors in mammals.</a> Cell. 83, 195-206 (1995).</li><li>Young, J. M., Massa, H. F., Hsu, L., Trask, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extreme+variability+among+mammalian+V1R+gene+families.">Extreme variability among mammalian V1R gene families.</a> Genome. Res. 20, 10-18 (2009).</li><li>Yang, H., Shi, P., Zhang, Y. P., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composition+and+evolution+of+the+V2r+vomeronasal+receptor+gene+repertoire+in+mice+and+rats.">Composition and evolution of the V2r vomeronasal receptor gene repertoire in mice and rats.</a> Genomics. 86, 306-315 (2005).</li><li>Levai, O., Feistel, T., Breer, H., Strotmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+in+the+vomeronasal+organ+express+odorant+receptors+but+project+to+the+accessory+olfactory+bulb.">Cells in the vomeronasal organ express odorant receptors but project to the accessory olfactory bulb.</a> J. Comp. Neurol. 498, 476-490 (2006).</li><li>Riviere, S., Challet, L., Fluegge, D., Spehr, M., Rodriguez, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formyl+peptide+receptor-like+proteins+are+a+novel+family+of+vomeronasal+chemosensors.">Formyl peptide receptor-like proteins are a novel family of vomeronasal chemosensors.</a> Nature. 459, 574-577 (2009).</li><li>Liberles, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formyl+peptide+receptors+are+candidate+chemosensory+receptors+in+the+vomeronasal+organ.">Formyl peptide receptors are candidate chemosensory receptors in the vomeronasal organ.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 9842-9847 (2009).</li><li>Liman, E. R., Corey, D. P., Dulac, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRP2:+A+candidate+transduction+channel+for+mammalian+pheromone+sensory+signaling.">TRP2: A candidate transduction channel for mammalian pheromone sensory signaling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 5791-5796 (1999).</li><li>Kelliher, K. R., Spehr, M., Li, X. H., Zufall, F., Leinders-Zufall, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pheromonal+recognition+memory+induced+by+TRPC2-independent+vomeronasal+sensing.">Pheromonal recognition memory induced by TRPC2-independent vomeronasal sensing.</a> Eur. J. Neurosci. 23, 3385-3390 (2006).</li><li>Rodriguez, I., Feinstein, P., Mombaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variable+patterns+of+axonal+projections+of+sensory+neurons+in+the+mouse+vomeronasal+system.">Variable patterns of axonal projections of sensory neurons in the mouse vomeronasal system.</a> Cell. 97, 199-208 (1999).</li><li>Boschat, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pheromone+detection+mediated+by+a+V1r+vomeronasal+receptor.">Pheromone detection mediated by a V1r vomeronasal receptor.</a> Nature. Neuroscience. 5, 1261-1262 (2002).</li><li>Brechbühl, J., Klaey, M., Broillet, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grueneberg+ganglion+cells+mediate+alarm+pheromone+detection+in+mice.">Grueneberg ganglion cells mediate alarm pheromone detection in mice.</a> Science. 321, 1092-1095 (2008).</li></ol>

Ingen interessekonflikter erklæret.

Den calcium imaging metode præsenteret her giver mulighed for at registrere, i en akut skive forberedelse, pheromonal svarene fra musen VNO neuroner. Med denne fremgangsmåde, er dissektion fra dyr til vomeronasal neuroner, med lidt øvelse, let opnåelige og giver en lang-levende væv forberedelse. Det giver mulighed for tidskrævende eksperimenter lignende farmakologiske undersøgelser og studiet af pheromonal kodning. Med denne fysiologiske teknik, kan store befolkninger samt præcise neuronal delpopulationer blive analyseret specifikt. Desuden kan metoden nemt tilpasses til immunohistokemiske tilgange eller eksperimenter baseret på andre calcium farvestoffer. Brugen af ​​disse kombinerede metoder vil helt sikkert føre til identifikation af nye pheromonal ligander for de mange forældreløse chemoreceptors udtrykt i mus vomeronasal orgel.

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagenset </td><td> Firma </td><td> Katalog nummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> Adenosin 5&#39;-trifosfat dinatriumsalt løsning (ATP) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A6559-25UMO </td><td></td></tr><tr><td> Agar </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A7002-100G </td><td> Fortrinsvis for immunhistokemi </td></tr><tr><td> Agar (lavtsmeltende) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A0701-25G </td><td> Fortrinsvis for calcium imaging </td></tr><tr><td> CL-100 Bipolar Temperatur Controller </td><td> Warner Instrumenter </td><td> W64-0352 </td><td></td></tr><tr><td> Konfokal mikroskop </td><td> Leica Microsystems </td><td> SP5 AOBS </td><td></td></tr><tr><td> Cy5-AffiniPure gede anti-mus IgG </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> 115-175-071 </td><td> Beskyt mod lys </td></tr><tr><td> DMSO (dimethylsulfoxid) </td><td> Merck </td><td> 317275-100ML </td><td></td></tr><tr><td> Embedding forme, Peel-A-Way </td><td> Polysciences </td><td> 18646A-1 </td><td> 22 x 22 x 20 mm </td></tr><tr><td> Fluorescerende montering medier (Vectashield med DAPI, 10 ml) </td><td> Rectolab </td><td> H-1200 </td><td></td></tr><tr><td> Fura-02:00 </td><td> Teflabs </td><td> 0103 </td><td> Beskyt mod lys </td></tr><tr><td> Glisseal N (vakuum fedt, 60 g) </td><td> Soegeren Chemie </td><td> Glisseal N </td><td></td></tr><tr><td> Stort bad optagelse kammer (RC-26G) </td><td> Warner Instrumenter </td><td> 64-0235 </td><td></td></tr><tr><td> MetaFluor (software til calcium billeddannelse; v.7.6.5.0) </td><td> Visitron Systems </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Monoklonalt anti-tubulin, acetylated mus antistof </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T6793-.2ML </td><td></td></tr><tr><td> Normal ged serum (NGS, 10 ml) </td><td> Interchim </td><td> UP379030 </td><td></td></tr><tr><td> Platform for kamre (P-1) </td><td> Warner Instrumenter </td><td> 64-0277 </td><td></td></tr><tr><td> Pluronic F-127, 2 g </td><td> Invitrogen </td><td> P-6867 </td><td></td></tr><tr><td> Roti Coll (dosering flaske, 10 g) </td><td> Carl Roth </td><td> 0.258,1 </td><td></td></tr><tr><td> SC-20 Dual In-line Solution varmer / køler </td><td> Warner Instrumenter </td><td> W64-0353 </td><td></td></tr><tr><td> Skær anker (SHD-26GKIT) </td><td> Warner Instrumenter </td><td> 64-0266 </td><td></td></tr><tr><td> Stereofluorescence mikroskop </td><td> Leica Microsystems </td><td> MZ16FA </td><td></td></tr><tr><td> Super PAP PEN (hydrofobepen) </td><td> Pelco International </td><td> 22309 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Fluka </td><td> 93420-250ML </td><td></td></tr><tr><td> Vibrerende klinge mikrotom VT 1200S </td><td> Leica Microsystems </td><td> 14048142066 </td><td></td></tr><tr><td> VisiChrome høj hastighed polychromator systemet </td><td> Visitron Systems </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 3D-visualisering af data (Imaris; v.6.3.1) </td><td> Bitplane Scientific Software </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

imaging pheromone sensing in a mouse vomeronasal acute tissue slice preparation

Peter Karlson og Martin Lüscher brugt udtrykket feromon for første gang i 1959 1 for at beskrive kemikalier, der anvendes til inden for samme art kommunikation. Feromoner er flygtige eller ikke-flygtige kortlivede molekyler 2 udskilles og / eller er indeholdt i biologiske væsker 3,4, såsom urin, en væske er kendt for at være en væsentlig kilde til feromoner 3. Pheromonal kommunikation er impliceret i en lang række vigtige dyr modaliteter såsom pårørende interaktioner 5,6, hierarkiske organisationer, 3 og seksuel interaktion 7,8 og er dermed direkte korreleret med overlevelse af en bestemt art 9,10,11. Hos mus, er evnen til at detektere feromoner hovedsageligt medieres af vomeronasal organ (VNO) 10,12, en parret struktur placeret i bunden af næsehulen, og indkapslet i en bruskspidserne kapsel. Hver VNO har en rørformet form med en lumen 13,14 tillader kontakt med eksternekemiske verden. Den sensoriske neuroepithelium er hovedsagelig sammensat af vomeronasal bipolar sensoriske neuroner (VSNs) 15. Hver VSN udvider en enkelt dendritceller til lumen ender i en stor dendritiske knop med op til 100 microvilli indblandet i kemisk sporingsudstyr 16. Talrige delpopulationer af VSNs er til stede. De er differentieret ved den kemoreceptorernes de giver udtryk for, og dermed muligvis den ligand (r) de genkender 17,18. To vigtige vomeronasal receptor familier, V1Rs og V2Rs 19,20,21,22, er sammensat af henholdsvis 240 23 og 120 24 medlemmer og er udtrykt i separate lag af neuroepithelium. Olfaktoriske receptorer (OR) 25 og formyl peptid receptorer (FPRs) 26,27 er også udtrykt i VSNs. Hvorvidt disse neuronale delpopulationer bruge den samme downstream signalvejen for sensing feromoner er ukendt. På trods af en væsentlig rolle, som en calcium-gennemtrængelig kanal (TRPC2) til stede i microvilli af modne neuroner 28 TRPC2 uafhængige transduktion kanaler er blevet foreslået 6,29. På grund af det store antal neuronale delpopulationer, og den ejendommelige morfologi af orglet, farmakologiske og fysiologiske undersøgelser af signalsystemet elementer til stede i VNO er ​​komplekse. Her præsenterer vi en akut væv skive udarbejdelsen af ​​musen VNO til udførelse af calcium billeddannelse undersøgelser. Denne fysiologiske tilgang giver bemærkninger, det naturlige miljø i en levende væv, af generelle eller individuelle delpopulationer af VSNs tidligere læsset med Fura-2:00, et calcium farvestof. Denne metode er også praktisk, til at undersøge GFP-tagget feromon receptoren og kan tilpasses til brug af andre fluorescerende calcium sonder. Som et eksempel bruger vi her en VG mus linje 30, hvor oversættelsen af feromon V1rb2 receptoren er knyttet til udtryk for GFP ved en polycistronic strategi. </p&gt;

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Pheromone Sensing in a Mouse Vomeronasal Acute Tissue Slice Preparation at JoVE.com

Imaging Pheromone Sensing in a Mouse Vomeronasal Acute Tissue Slice Preparation

Hos mus, er evnen til at detektere feromoner hovedsageligt medieres af vomeronasal organ (VNO). Her er en akut væv skive forberedelse af VNO for udførelsen af ​​calcium imaging beskrevet. Denne fysiologiske tilgang giver mulighed for observationer af delpopulationer og / eller individuelle neuroner i et levende væv og er praktisk for receptor-ligand identifikation.

Imaging Pheromone Sensing i en mus Vomeronasal Akut Tissue Slice Forberedelse

Peter Karlson and Martin L&uuml;scher used the term pheromone for the first time in 19591 to describe chemicals used for intra-species communication. ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Multielectrode Array Recordings of the Vomeronasal Epithelium

Understanding neural circuits requires methods to record from many neurons simultaneously. For in vitro studies, one currently available technology is ...

Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The ...

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Slice Preparation, Organotypic Tissue Culturing and Luciferase Recording of Clock Gene Activity in the Suprachiasmatic Nucleus

A central circadian (~24 hr) clock coordinating daily rhythms in physiology and behavior resides in the suprachiasmatic nucleus (SCN) located in the ...

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Imaging Neuronal Responses in Slice Preparations of Vomeronasal Organ Expressing a Genetically Encoded Calcium Sensor

Imaging Neuronal Svar på Slice Varer af Vomeronasal Organ udtryk for en genetisk kodet Calcium Sensor

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within ...

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

Tissue Forberedelse og immunfarvning af Mouse sensoriske nervefibre innerverer hud og lemmer Bones

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in ...

Preparation of Acute Subventricular Zone Slices for Calcium Imaging

Fremstilling af akutte Subventricular Zone Slices for Calcium Imaging

The subventricular zone (SVZ) is one of the two neurogenic zones in the postnatal brain. The SVZ contains densely packed cells, including neural ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

Ex vivo Tilberedninger af den intakte Vomeronasal orgel og tilbehør lugtekolben

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Slice It Hot: Acute Adult Brain Slicing in Physiological Temperature

Slice It Hot: Akut voksne hjerne Slicing i fysiologisk temperatur

Here we present a protocol for preparation of acute brain slices. This procedure is a critical element for electrophysiological patch-clamp experiments ...