Name: imaging pheromone sensing in a mouse vomeronasal acute tissue slice preparation
Uploaded: 2011-12-06T12:00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Pheromone Sensing in a Mouse Vomeronasal Acute Tissue Slice Preparation at JoVE.com

אנו רוצים להודות במיוחד מוניק Nenniger Tosato לקבלת תמיכה טכנית מעולה שלה, כמו גם ז&#39;אן איב Chatton עבור עצות המדעי שלו ואת פלטפורמת CIF הדמיה של UNIL עבור הציוד מיקרוסקופ. המימון ניתן על ידי השוויצרי הקרן הלאומית למדע.

1. Dissection של העכבר VNO <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש עכברים בוגרים. כמו פרומון חישה הוא מעורב multimodalities, הבחנה זהירה בין זנים, גנוטיפים, המינים והגילאים חשובה ישפיעו התוצאות. כאן, אנו בוחרים מבוגר בעכברים VG 30 השתמשו בעבר לצורך זיהוי של זוג פרומון קולטן (2-heptanone-V1rb2) 31 (איור 1A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני תחילת הניתוח, להכין טרי קר נוזל מלאכותי cerebro-השדרה (ACSF; NaCl 118 מ&quot;מ, 25 מ&quot;מ NaHCO 3, D-גלוקוז 10 מ&quot;מ, 2 מ&quot;מ KCl, MgCl 2 2 מ&quot;מ, לאא 2 PO 4 1.2 מ&quot;מ, CaCl 2 2 מ&quot;מ; pH 7.4) רווי oxycarbon (95% O 2: 5% CO 2). לשם כך, לערבב את כל המרכיבים למעט ACSF CaCl 2. להרוות את הפתרון ישירות על ידי מבעבע עם oxycarbon. בסופו של דבר, להוסיף את 2 CaCl ולהתאים עם DDH 2 0 לנפח הרצוי. שמור את הפתרון ACSF על הקרח עד use. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המתת חסד של העכבר צריך להיעשות מעדיפים בדיוק לפני הניסוי על ידי נקע בצוואר הרחם או משאיפת CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את הראש העכבר. מקום בו תחת מיקרוסקופ הביתור ACSF קר oxycarbonated ברציפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את הלסת התחתונה ואת המיקום הראש כדי להמחיש את החיך (איור 1B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע חתך אופקי בחלק העליון של החיך (איור 1B) במספריים מיקרו להסיר את הקרום החיך עם מלקחיים לנתח מיקרו. מימה ולנקות את חלל חשוף עם ACSF (איור 1C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גזור העליון והחלק התחתון של מחיצת האף (איור 1C). בעדינות לחלץ את מחיצת האף המכיל את VNO ולמקם אותו ישירות ACSF על הקרח (1D איור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד אנכית את שני החלקים של VNO באמצעות מלקחיים לנתח מיקרו בעדינות להסיר את הקפסולה סחוסי של VNO (איור. 1E). ודא כי כל החלקים סחוסי יוסרו. </li></ol> 2. פרוסה VNO רקמות הכנה פרוסת רקמה VNO הכנה המתואר בסעיף זה 2) הוא בעיקר לחקירות הדמיה סידן. פרוסות VNO יכול לשמש גם עבור immunohistostainings על פרוסות צף לאמת את השלמות המבנית של הרקמה (ראה סעיף 3) לפרוטוקול). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן נמוכה ההיתוך אגר (3% ברמת PBS) וכן מקום העבודה שלך. יהיה עליך ACSF, microtome ותומך, מלקחיים לנתח מיקרו, הטמעת תבניות (22 x 22 x 20 מ&quot;מ), מגבונים דיוק, מברשות, תרבות צלחות רקמות, cyanacrylat דבק, קרח, מדחום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלאים את התבנית עם הטבעה אגר התכה נמוכה של 3%. ודא כי הטמפרטורה אינה עולה על 41 מעלות צלזיוס לפני הצבת אנכית VNO מחה זמן קצר (איור 2 א) כדי להיות מסוגל לקבל פרוסות העטרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את התבנית הטבעה על הקרחדקות 1 עד התמצקות ואז נפרד ממנה לחסום את אגר. חותכים את גוש אגר בצורת פירמידה ולמקם אותו עם דבק על התמיכה microtome (איור 2 ב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים פרוסות העטרה VNO עם microtome, עם מהירות של 0.5 מ&quot;מ / s, משרעת של 0.7 מ&quot;מ עובי ו 100 מיקרומטר ACSF קר לאסוף את פרוסות רקמה עם מברשת לפני הכנסתם צלחת רקמה תרבות מלאים קר ACSF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם פרוסות שלך מכילים הקרינה אנדוגני כמו GFP (בגן במיקוד נוירונים) אתה יכול לבחור אותם תחת stereomicroscope ניאון (איור 2C). </li></ol> 3. אימונוהיסטוכימיה על פרוסות VNO צף מטרת הליך זה היא לוודא את תקינות של פרוסות רקמה VNO שהושג בסעיף 2). טובולין Acetylated, הוא סמן microtubule / cytoskeleton לידי ביטוי דנדריטים של נוירונים microvilli VNO חושית. עבור ניסויים הדמיה סידן, ללכת directly סעיף 4) של הפרוטוקול. השיטה immunohistostaining צף על פרוסות VNO ניתן להתאים הערכה של הביטוי של חלבון כלשהו של עניין. למטרה זו, אנו ממליצים לתקן את VNO עבור 1h ב 4 ° C בתמיסה מקבע (paraformaldehyde 4% ב-PBS, pH 7.6) לאחר הנקודה 1.7) של פרוטוקול ולהשתמש מזה PBS נקודה ב-pH 7.6 מאשר ACSF פתרון. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצלחת בתרבית רקמה, לתקן את פרוסות העניין שלך בפתרון מקבע (paraformaldehyde 4% ב-PBS, pH 7.6) 1h ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלוק פרוסות הרקמה לילה בשעה 4 שלך ° C בתמיסה המכילה PBS NGS (עז נורמלי סרום) 10% טריטון X-100 ב -0.5%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה פרוסות עם הנוגדן הראשוני (אנטי acetylated-טובולין, עכבר, 1:2000) עבור 16h בטמפרטורת החדר (RT) בתמיסה המכילה PBS NGS 5% טריטון X-100 ב% 0.25. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 3 פעמים במשך 5 דקות בתמיסת PBS NGS המכיל 2%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה בחושך עם הערוץנוגדן ndary (Cy5-מצומדות עיזים אנטי מאוס, 1:200) בתמיסה המכילה PBS NGS 2% עבור 1h ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 3 פעמים במשך 5 דקות עם PBS NGS המכיל 2%, PBS NGS 1% ו-PBS בלבד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר פרוסות שלך תקשורתי גובר ניאון (המכיל DAPI או לא) על ידי הצבתם במרכז אזורי מופרד הידרופובי (להשתמש בעט הידרופובי) ולכסות את פרוסות עם coverslips. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע תצפיות ורכישות עם מיקרוסקופיה confocal ואת תוכנה המאפשרת 3D שחזורים (איור 2D-F). </li></ol> 4. סידן הדמיה על פרוסות VNO <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההליכים הבאים יתקיימו בחושך. דגירה VNO פרוסות עבור 1h ב 37 ° C בתמיסה טעינת מורכב ACSF קר עם Fura, 02:00 (7 מיקרומטר; פתרון מלאי של 1 מ&quot;מ ב DMSO) ו pluronic 0.1% (w / v; פתרון המניה ב -20% ב DDH 2 O). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמרו את הפרוסות טעון על הקרח עם oxycarbonation עד לשימוש. פרוסות טעון יכולים להישמר עבור3-4H. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את פרוסות טעון עם מברשת בתא המכיל זלוף ACSF ולשמור את הפרוסות עם עוגן רקמות פרוסה (איור 3A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את תא זלוף על הבמה של מיקרוסקופ סידן הדמיה (איור 3B) ומתמשך perfuse עם ACSF oxycarbonated ב RT. טמפרטורה ניתן להתאים את השימוש של בקר טמפרטורה דו קוטבית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תצפיות של פרוסות טעון VNO (איור 3C-E) מבוצעים עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוכה, במטרה 25x או 63x ומצלמה מגניב SNAP-HQ. תאורה נעשית ברצף (340/380 ננומטר) עם מכשיר polychromator והקליט בשיעור של 5Hz. פליטת מסוננים נעשית על 510 ננומטר. יחס סידן שינויים תאיים (= ΔF nm/380 340 ננומטר) מנוטרים עם תוכנה מתאימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Chemostimulation יש לבחור בהתאם לצורך הניסוי שלך. כאן, perfusions של ACSF המכיל מ פרומוןix (isobutylamine, 2-heptanone, 4-heptanone, 2-heptanol, pentylacetate, dimethylpyrazine, α / β-farnesene, 10 -6 M), 2-heptanone (10 -6 M) או שנאספו טרי זכר ונקבה (1: 1) שתן העכבר (1:100) מבוצעות 32. זלוף של ה-ATP (125 מיקרומטר) משמש מבחן הכדאיות בסוף הניסויים (איור 3F) וצריך להצביע על שיעור של כ 80% נוירונים קיימא. בתנאים אלה, פרוסות יכול לשמש עד 2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Subpopulations GFP-tagged של נוירונים חושיים הם דמיינו ידי תאורה ספציפית (כאן הנוירונים להביע V1rb2) וכן ניתן לנתח במדויק (איור 3G-I). </li></ol> 5. נציג תוצאות: כדי להקים assay פונקציונלי לחקור את התמרה רב המסלולים מתרחש VNO העכבר, או לזהות חדש פרומון קולטן זוגות, אנחנו מנצלים את העכבר VG קו (איור 1A </strong&gt;). בתחום הזה, אחד מתוך 240 רצפטורים V1Rs, הקולטן V1Rb2-GFP הוא מתויג המאפשר הדמיה קל של subpopulation מסוים של נוירונים חושיים vomeronasal. לאחר מיצוי דיסקציה של VNO (איור 1E), אנו מכינים חריפה פרוסות VNO (איור 2C). אנו לתקן חלק מהם, כדי לבדוק ולאמת את תקינות tissular של התכשיר על ידי ביצוע immunohistostainings נגד החלבון טובולין acetylated-(איור 2D-F). שבריר השנייה של פרוסות משמש ניסויים הדמיה סידן. לשם כך, פרוסות נטענים עם Fura, 02:00 (איור 3C-E) ורמת סידן תוך תאי של כל נוירון מנוטר כיחס ΔF (איור 3F). הכדאיות של נוירונים הוא מוערך על ידי טפטוף של ה-ATP (125 מיקרומטר), לאחר עלייה מהירה וחולפת יחס ΔF צפוי (איור 3F). שתן להיות המקור העיקרי של פרומונים, זלוף של טריאסף ly עכבר שתן (1:100) משמש לשלוט אנדוגני. זה מעורר הארעיים סידן כ -50% של נוירונים מוקלט (תא 1 ו -2, איור. 3F). תחת ה-GFP תאורה, V1Rb2 נוירונים החיוביים הם נצפים, ו זלוף של ליגנד המושכת הידוע שלה, 2-heptanone, יוזם הפעלה סלולרית (תא 1, איור. 3I). מעניין, הפעלות נוירונים הם הנצפה גם בשבריר של נוירונים אינם מבטאים את הקולטן V1Rb2 (נוירונים GFP שלילי) (2 תאים, איור. 3I), הוכחת את המורכבות של פרומון קידוד VNO. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3311/3311fig1.jpg" /> באיור 1. Dissection האיבר עכבר vomeronasal. (א) עכבר מקו VG. (ב) לאחר המתת חסד של העכבר, ראש מלא ממוקם תחת מיקרוסקופ המשקפת את הלסת התחתונה מוסרת כדי להמחיש את החיך. חתך אופקי קטן נעשה(קו מקווקו שחור). (ג) לאחר סילוקו של החיך, מחיצת האף מצופה VNO הוא חתך בחלק העליון והחלק התחתון (קווים מקווקווים לבן) כדי להקל על החילוץ VNO. (ד) VNO ממוקמת בפתרון ACSF ומופרד (הכנס: תצוגת כוח עליון של שני החלקים). (ה) הכמוסה סחוסי של VNO מוסר בעדינות, ואת VNO ללא סחוס הקפסולה שלה משמש להמשך הניסויים. ברים סולם הם: BE, 1 מ&quot;מ. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3311/3311fig2.jpg" /> 2. איור עכבר vomeronasal הכנה חריפה פרוסה ויושרה tissular. (א) VNO העכבר מוטבע אנכית פתרון אגר 3%. הטמפרטורה של אגר חייב להיות נמוך מ 41 ° C. (ב) לחסום אגר הוא חתך בצורת פירמידה ו 100 מיקרומטר סעיפים VNO (קו מקווקו שחור) נוצרות ACSF. (ג) פרוסות VNO ניתן לבחור תחת stereomicroscope ניאון כדי להמחיש מסויםאוכלוסיה של נוירונים חושיים מתויג. (DF) יושרה Tissular ניתן להעריך על ידי immunohistostainings נגד החלבון טובולין acetylated-, תצוגה של כוח עליון V1rb2 גן במיקוד נוירונים להדגים את שימור מושלם של התכשיר. נוירונים עם דנדריטים הארוכה שלהם להגיע לפני השטח של לומן (E), כמו גם את הביטוי של החלבון המבני הבליטות microvilli הדנדריטים ניתן לצפות (F). ברים סולם הם: B, 5 מ&quot;מ; C, 60 מיקרומטר; ד &#39;, 40 מיקרומטר; EF, 20 מיקרומטר. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3311/3311fig3.jpg" /> 3. איור סידן הדמיה זיהוי פרומון ב vomeronasal פרוסות הרקמה חריפה. (א) לאחר שלב Fura 02:00-loading, פרוסות VNO ממוקמים בתא זלוף ומתוחזקים עם עוגן מותאם (תצוגת מתח גבוה). (ב) ניסויים מבוצעים את פרוסות כהה VNO הם perfused ברציפות ב RT עם ACSF עם מערכת ואקום. הטמפרטורה יכולה להיות chosen באמצעות בקר טמפרטורה המערכת מורכבת על ידי אלמנט דו קוטבית פלטייה ו בדיקה תרמית. ניסוי זה בפרט בוצע ב RT. (CE) פרוסות VNO הם הנצפה תחת בניגוד שלב הופמן (C, HV) או Fura 380 ננומטר תאורה לפני (ד &#39;) במהלך ההפעלה העצבית (E, כאן עם ה-ATP). (F) הכדאיות העצבית מוערך עם טפטוף של ה-ATP (125 מיקרומטר). כאן, chemostimulation נעשה עם שתן (שתן, 1:100) או בתערובת של פרומונים העכבר (ph לערבב., 10 -6 M) בשיעור זרם בלתי פוסק של 165 מ&quot;ל / h. רמות הסידן תאיים (ΔF) ניתן להקליט בנפרד עבור כל תא (Cell 1-3). (G) נוירון V1Rb2 הוא מדמיין תחת GFP תאורה (1). (H) העמסה של זה נוירון (1), כמו גם אי - נוירון V1rb2 להביע (2) מוצג. (אני) נוירון V1rb2 הוא מסוגל להגיב 2-heptanone עם עלייה סידן תוך תאי. זה נוירון מסוים שאינו V1rb2 להביע גם מגיב 2-heptanone (תא 2). ברים סולם הם: CE, 20 מיקרומטר; GH,15 מיקרומטר; ΔF = 340 ננומטר / 380 ננומטר. (F ו-I) משך היישום גירוי מסומן על ידי סורגים תחת כל עקבות. היקף צבע שרירותי מייצג את עוצמת הקרינה.

<ol>
	<li>Karlson, P., L&#252;scher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Pheromones"+a+new+term+for+a+class+of+biologically+active+substances.">"Pheromones" a new term for a class of biologically active substances.</a> Nature. 183, 55-56 (1959).</li><li>Cavaggioni, A., Mucignat-Caretta, C., Redaelli, M., Zagotto, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+scent+of+urine+spots+of+male+mice,+Mus+musculus:+Changes+in+chemical+composition+over+time.">The scent of urine spots of male mice, Mus musculus: Changes in chemical composition over time.</a> Rapid Commun. Mass Spectrom. 20, 3741-3746 (2006).</li><li>Novotny, M., Harvey, S., Jemiolo, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry+of+male+dominance+in+the+house+mouse,+Mus+domesticus.">Chemistry of male dominance in the house mouse, Mus domesticus.</a> Experientia. 46, 109-113 (1990).</li><li>Leinders-Zufall, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+pheromone+detection+by+mammalian+vomeronasal+neurons.">Ultrasensitive pheromone detection by mammalian vomeronasal neurons.</a> Nature. 405, 792-796 (2000).</li><li>Leinders-Zufall, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MHC+class+I+peptides+as+chemosensory+signals+in+the+vomeronasal+organ.">MHC class I peptides as chemosensory signals in the vomeronasal organ.</a> Science. 306, 1033-1037 (2004).</li><li>Leinders-Zufall, T., Ishii, T., Mombaerts, P., Zufall, F., Boehm, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+requirements+for+the+activation+of+vomeronasal+sensory+neurons+by+MHC+peptides.">Structural requirements for the activation of vomeronasal sensory neurons by MHC peptides.</a> Nat. Neurosci. 12, 1551-1558 (2009).</li><li>Jemiolo, B., Xie, T. M., Novotny, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Socio-sexual+olfactory+preference+in+female+mice:+attractiveness+of+synthetic+chemosignals.">Socio-sexual olfactory preference in female mice: attractiveness of synthetic chemosignals.</a> Physiol. Behav. 50, 1119-1122 (1991).</li><li>Achiraman, S., Archunan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+urinary+volatiles+in+Swiss+male+mice+(Mus+musculus):+bioassay+of+identified+compounds.">Characterization of urinary volatiles in Swiss male mice (Mus musculus): bioassay of identified compounds.</a> J. Biosci. 27, 679-686 (2002).</li><li>Dulac, C., Torello, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+detection+of+pheromone+signals+in+mammals:+from+genes+to+behaviour.">Molecular detection of pheromone signals in mammals: from genes to behaviour.</a> Nat. Rev. Neurosci. 4, 551-562 (2003).</li><li>Brennan, P. A., Zufall, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pheromonal+communication+in+vertebrates.">Pheromonal communication in vertebrates.</a> Nature. 444, 308-315 (2006).</li><li>Mondor, E. B., Roitberg, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inclusive+fitness+benefits+of+scent-marking+predators.">Inclusive fitness benefits of scent-marking predators.</a> Proc. Biol. Sci. 271, 341-343 (2004).</li><li>Holy, T. E., Dulac, C., Meister, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+of+vomeronasal+neurons+to+natural+stimuli.">Responses of vomeronasal neurons to natural stimuli.</a> Science. 289, 1569-1572 (2000).</li><li>Keverne, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Vomeronasal+Organ.">The Vomeronasal Organ.</a> Science. 286, 716-720 (1999).</li><li>Weiler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+development+of+the+rat+vomeronasal+organ.">Postnatal development of the rat vomeronasal organ.</a> Chem. Senses. 30, 127-128 (2005).</li><li>Zufall, F., Kelliher, K. R., Leinders-Zufall, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pheromone+detection+by+mammalian+vomeronasal+neurons.">Pheromone detection by mammalian vomeronasal neurons.</a> Microsc. Res. Tech. 58, 251-260 (2002).</li><li>Ciges, M., Labella, T., Gayoso, M., Sanchez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructure+of+the+organ+of+Jacobson+and+comparative+study+with+olfactory+mucosa.">Ultrastructure of the organ of Jacobson and comparative study with olfactory mucosa.</a> Acta. Otolaryngol. 83, 47-58 (1977).</li><li>Munger, S. D., Leinders-Zufall, T., Zufall, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subsystem+organization+of+the+mammalian+sense+of+smell.">Subsystem organization of the mammalian sense of smell.</a> Annu. Rev. Physiol. 71, 115-140 (2009).</li><li>Mombaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+and+ligands+for+odorant,+vomeronasal+and+taste+receptors.">Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors.</a> Nat. Rev. Neurosci. 5, 263-278 (2004).</li><li>Ryba, N. J. P., Tirindelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+multigene+family+of+putative+pheromone+receptors.">A new multigene family of putative pheromone receptors.</a> Cell. 19, 371-379 (1997).</li><li>Matsunami, H., Buck, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multigene+family+encoding+a+diverse+array+of+putative+pheromone+receptors+in+mammals.">A multigene family encoding a diverse array of putative pheromone receptors in mammals.</a> Cell. 90, 775-784 (1997).</li><li>Herrada, G., Dulac, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+family+of+putative+pheromone+receptors+in+mammals+with+a+topographycally+organized+and+sexually+dimorphic+distribution.">A novel family of putative pheromone receptors in mammals with a topographycally organized and sexually dimorphic distribution.</a> Cell. 90, 763-773 (1997).</li><li>Dulac, C., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+family+of+genes+encoding+putative+pheromone+receptors+in+mammals.">A novel family of genes encoding putative pheromone receptors in mammals.</a> Cell. 83, 195-206 (1995).</li><li>Young, J. M., Massa, H. F., Hsu, L., Trask, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extreme+variability+among+mammalian+V1R+gene+families.">Extreme variability among mammalian V1R gene families.</a> Genome. Res. 20, 10-18 (2009).</li><li>Yang, H., Shi, P., Zhang, Y. P., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composition+and+evolution+of+the+V2r+vomeronasal+receptor+gene+repertoire+in+mice+and+rats.">Composition and evolution of the V2r vomeronasal receptor gene repertoire in mice and rats.</a> Genomics. 86, 306-315 (2005).</li><li>Levai, O., Feistel, T., Breer, H., Strotmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+in+the+vomeronasal+organ+express+odorant+receptors+but+project+to+the+accessory+olfactory+bulb.">Cells in the vomeronasal organ express odorant receptors but project to the accessory olfactory bulb.</a> J. Comp. Neurol. 498, 476-490 (2006).</li><li>Riviere, S., Challet, L., Fluegge, D., Spehr, M., Rodriguez, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formyl+peptide+receptor-like+proteins+are+a+novel+family+of+vomeronasal+chemosensors.">Formyl peptide receptor-like proteins are a novel family of vomeronasal chemosensors.</a> Nature. 459, 574-577 (2009).</li><li>Liberles, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formyl+peptide+receptors+are+candidate+chemosensory+receptors+in+the+vomeronasal+organ.">Formyl peptide receptors are candidate chemosensory receptors in the vomeronasal organ.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 9842-9847 (2009).</li><li>Liman, E. R., Corey, D. P., Dulac, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRP2:+A+candidate+transduction+channel+for+mammalian+pheromone+sensory+signaling.">TRP2: A candidate transduction channel for mammalian pheromone sensory signaling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 5791-5796 (1999).</li><li>Kelliher, K. R., Spehr, M., Li, X. H., Zufall, F., Leinders-Zufall, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pheromonal+recognition+memory+induced+by+TRPC2-independent+vomeronasal+sensing.">Pheromonal recognition memory induced by TRPC2-independent vomeronasal sensing.</a> Eur. J. Neurosci. 23, 3385-3390 (2006).</li><li>Rodriguez, I., Feinstein, P., Mombaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variable+patterns+of+axonal+projections+of+sensory+neurons+in+the+mouse+vomeronasal+system.">Variable patterns of axonal projections of sensory neurons in the mouse vomeronasal system.</a> Cell. 97, 199-208 (1999).</li><li>Boschat, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pheromone+detection+mediated+by+a+V1r+vomeronasal+receptor.">Pheromone detection mediated by a V1r vomeronasal receptor.</a> Nature. Neuroscience. 5, 1261-1262 (2002).</li><li>Brechbühl, J., Klaey, M., Broillet, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grueneberg+ganglion+cells+mediate+alarm+pheromone+detection+in+mice.">Grueneberg ganglion cells mediate alarm pheromone detection in mice.</a> Science. 321, 1092-1095 (2008).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

הדמיה סידן השיטה המוצגת כאן מאפשרת להקליט, כהכנה פרוסה חריפה, המושכת את התגובות של נוירונים עכבר VNO. עם גישה זו, דיסקציה מן החיה אל הנוירונים vomeronasal היא, עם קצת תרגול, השגה בקלות ומספק הכנה ארוך רקמה חיה. זה מאפשר זמן רב ניסויים כמו חקירות תרופתי או לימוד של קידוד המושכת. בעזרת טכניקה זו פיזיולוגיים, אוכלוסיות גדולות, כמו גם subpopulations העצבית מדויק ניתן לנתח באופן ספציפי. בנוסף, בשיטה זו ניתן להתאים בקלות לגישות או ניסויים immunohistochemical המבוססת על צבעים סידן אחרים. השימוש בשיטות אלה בשילוב בוודאי לאפשר זיהוי של ligands המושכת חדש עבור chemoreceptors יתום רבים הביעו באיבר העכבר vomeronasal.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> אדנוזין 5&#39;-טריפוספט disodium מלח פתרון (ATP) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A6559-25UMO </td><td></td></tr><tr><td> אגר </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A7002-100 גרם </td><td> מועדף עבור אימונוהיסטוכימיה </td></tr><tr><td> אגר (התכה נמוכה) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A0701-25 גרם </td><td> מעדיפים הדמיה סידן </td></tr><tr><td> CL-100 דו קוטבית בקר טמפרטורה </td><td> וורנר מכשירים </td><td> W64-0352 </td><td></td></tr><tr><td> Confocal מיקרוסקופ </td><td> Leica Microsystems </td><td> SP5 AOBS </td><td></td></tr><tr><td> Cy5 AffiniPure-Anti-IgG עכבר עיזים </td><td> ג&#39;קסון ImmunoResearch </td><td> 115-175-071 </td><td> הגנה מן האור </td></tr><tr><td> DMSO (Sulfoxide דימתיל) </td><td> מרק </td><td> 317,275, 100 מ&quot;ל </td><td></td></tr><tr><td> הטבעת תבניות, פיל-A-Way </td><td> Polysciences </td><td> 18646A-1 </td><td> 22 x 22 x 20 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> פלורסנט הרכבה מדיה (Vectashield עם DAPI, 10 מ&quot;ל) </td><td> Rectolab </td><td> H-1200 </td><td></td></tr><tr><td> FURA, 02:00 </td><td> Teflabs </td><td> 0103 </td><td> הגנה מן האור </td></tr><tr><td> Glisseal N (גריז ואקום, 60 גר &#39;) </td><td> בורר Chemie </td><td> Glisseal N </td><td></td></tr><tr><td> אמבטיה גדולה הקלטה קאמרית (RC-26G) </td><td> וורנר מכשירים </td><td> 64-0235 </td><td></td></tr><tr><td> MetaFluor (תוכנת הדמיה סידן; v.7.6.5.0) </td><td> Visitron מערכות </td><td></td><td></td></tr><tr><td> חד שבטיים אנטי טובולין, acetylateד נוגדן עכבר </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T6793-.2ML </td><td></td></tr><tr><td> עז בסרום רגיל (NGS, 10 מ&quot;ל) </td><td> Interchim </td><td> UP379030 </td><td></td></tr><tr><td> פלטפורמה לתאי (P-1) </td><td> וורנר מכשירים </td><td> 64-0277 </td><td></td></tr><tr><td> Pluronic F-127, 2 גרם </td><td> Invitrogen </td><td> P-6867 </td><td></td></tr><tr><td> רוטי קול (בקבוק מינון, 10 גר &#39;) </td><td> קרל רוט </td><td> 0,258.1 </td><td></td></tr><tr><td> SC-20 תנור Dual In-line הפתרון / Cooler </td><td> וורנר מכשירים </td><td> W64-0353 </td><td></td></tr><tr><td> פורסים עוגן (SHD-26GKIT) </td><td> וורנר מכשירים </td><td> 64-0266 </td><td></td></tr><tr><td> Stereofluorescence מיקרוסקופ </td><td> Leica Microsystems </td><td> MZ16FA </td><td></td></tr><tr><td> סופר PEN PAP (הידרופוביעט) </td><td> Pelco הבינלאומי </td><td> 22309 </td><td></td></tr><tr><td> טריטון X-100 </td><td> Fluka </td><td> 93420-250 מ&quot;ל </td><td></td></tr><tr><td> רטט להב microtome VT 1200S </td><td> Leica Microsystems </td><td> 14048142066 </td><td></td></tr><tr><td> VisiChrome מהירות גבוהה polychromator מערכת </td><td> Visitron מערכות </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 3D ויזואליזציה נתונים (Imaris; v.6.3.1) </td><td> Bitplane מדעי תוכנה </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

imaging pheromone sensing in a mouse vomeronasal acute tissue slice preparation

פיטר Karlson ומרטין Lüscher השתמשו פרומון המונח לראשונה בשנת 1959 1 לתאר כימיקלים המשמשים לתקשורת תוך מינים. פרומונים הם נדיפים או בלתי נדיף קצרת מולקולות 2 מופרשים ו / או הכלול 3,4 נוזלים ביולוגיים, דוגמת שתן, נוזל ידוע להיות המקור העיקרי של פרומונים 3. תקשורת המושכת הוא מעורב במגוון רחב של שיטות חיה מפתח כגון אינטראקציות 5,6 קרובי משפחה, ארגוני היררכי 3 ואת האינטראקציות המיניות 7,8 ו - וכתוצאה מכך הם בקורלציה ישירה עם להישרדות המין נתון 9,10,11. בעכברים, היכולת לזהות פרומונים מתווכת בעיקר על ידי האיבר vomeronasal (VNO) 10,12, מבנה לזווג הממוקמת בבסיס של חלל האף, וגם מוקף כמוסת סחוסי. VNO לכל צורה צינורי עם לומן 13,14 המאפשר קשר עם חיצוניעולם כימי. Neuroepithelium חושית מורכבת בעיקר של נוירונים חושיים vomeronasal דו קוטבית (VSNs) 15. VSN כל משתרע דנדריט יחיד לומן שהסתיימו ידית הדנדריטים גדול נושאת עד 100 microvilli מעורב זיהוי כימי 16. Subpopulations רבים של VSNs נוכחים. הם מובחנים על ידי chemoreceptor שהם מבטאים, ובכך ככל הנראה על ידי ליגנד (ים) הם מכירים 17,18. שתי משפחות עיקריות קולטן vomeronasal, V1Rs ו V2Rs 19,20,21,22, מורכבים בהתאמה על ידי 240 23 120 24 חברים באים לידי ביטוי שכבות נפרדות של neuroepithelium. קולטני הריח (מחדרי) 25 ו קולטנים פפטיד formyl (FPRs) 26,27 באים לידי ביטוי גם VSNs. בין אם אלה subpopulations העצבית להשתמש באותו מסלול איתות במורד הזרם עבור פרומונים חישה אינו ידוע. למרות התפקיד המרכזי של ערוץ הסידן חדיר-(TRPC2) נוכח microvilli של נוירונים בוגרים 28 TRPC2 ערוצי התמרה עצמאי הוצעו 6,29. בשל המספר הגבוה של תת עצב את המורפולוגיה המיוחדת של האיבר, חקירות פרמקולוגיות ופיזיולוגיות של אלמנטים איתות נוכח VNO מורכבים. כאן, אנו מציגים רקמות חריפה פרוסה הכנה של VNO העכבר לביצוע הדמיה חקירות סידן. גישה זו מאפשרת פיזיולוגיים תצפיות בסביבה הטבעית של רקמה חיה, של subpopulations כללית או בודדים של VSNs נטען בעבר עם Fura, 02:00, צבע סידן. שיטה זו היא גם נוח לומד כל קולטן ה-GFP-tagged פרומון ו ניתנת להתאמה לשימוש אחר בדיקות סידן ניאון. כדוגמה, אנו משתמשים כאן עכבר VG קו 30, שבו תרגום של הקולטן פרומון V1rb2 קשורה הביטוי של ה-GFP על ידי אסטרטגיה polycistronic. </p&gt;

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Pheromone Sensing in a Mouse Vomeronasal Acute Tissue Slice Preparation at JoVE.com

Imaging Pheromone Sensing in a Mouse Vomeronasal Acute Tissue Slice Preparation

בעכברים, היכולת לזהות פרומונים מתווכת בעיקר על ידי האיבר vomeronasal (VNO). כאן, רקמה חריפה פרוסה הכנת VNO לביצוע הדמיה סידן מתואר. גישה זו מאפשרת פיזיולוגיים תצפיות subpopulations ו / או נוירונים בודדים ברקמה חיה נוח זיהוי קולטן ליגנד.

הדמיה פרומון חישה ב תכשיר Vomeronasal עכבר רקמות חריפה Slice

Peter Karlson and Martin L&uuml;scher used the term pheromone for the first time in 19591 to describe chemicals used for intra-species communication. ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Multielectrode Array Recordings of the Vomeronasal Epithelium

מערך Multielectrode הקלטות של האפיתל Vomeronasal

Understanding neural circuits requires methods to record from many neurons simultaneously. For in vitro studies, one currently available technology is ...

Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

הדמיה כרונית של עכבר-Visual Cortex שימוש ההכנה סחוט הגולגולת

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The ...

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

הצמד תיקון הקלטות מתא עצב עכבר רשתית בהכנת Dark המותאמות פרוסה

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Slice Preparation, Organotypic Tissue Culturing and Luciferase Recording of Clock Gene Activity in the Suprachiasmatic Nucleus

אופן ההכנה פורסים, רקמות culturing Organotypic ו הקלטה בלוציפראז של פעילות הגן שעון בגרעין suprachiasmatic

A central circadian (~24 hr) clock coordinating daily rhythms in physiology and behavior resides in the suprachiasmatic nucleus (SCN) located in the ...

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

מרובה עכבר Neuroanatomical תהודה מגנטית

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Imaging Neuronal Responses in Slice Preparations of Vomeronasal Organ Expressing a Genetically Encoded Calcium Sensor

התגובות הדמיה העצבית ההכנות Slice של איברים Vomeronasal הבעת חיישן סידן מקודד גנטית

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within ...

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

רקמות הכנה Immunostaining של סיבי עצב תחושתי עכבר Innervating עצמות סקין לימב

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in ...

Preparation of Acute Subventricular Zone Slices for Calcium Imaging

הכנת Slices האזור Subventricular החריף להדמית סיד

The subventricular zone (SVZ) is one of the two neurogenic zones in the postnatal brain. The SVZ contains densely packed cells, including neural ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

Ex Vivo הכנות של הנורה Vomeronasal האיברים ואבזר חוש הריח הפגועה

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Slice It Hot: Acute Adult Brain Slicing in Physiological Temperature

פורסים אותו חם: אקוטי למבוגרים מוח חיתוך בטמפרטורה פיזיולוגית

Here we present a protocol for preparation of acute brain slices. This procedure is a critical element for electrophysiological patch-clamp experiments ...