Name: imaging pheromone sensing in a mouse vomeronasal acute tissue slice preparation
Uploaded: 2011-12-06T12:00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Pheromone Sensing in a Mouse Vomeronasal Acute Tissue Slice Preparation at JoVE.com

Vi ønsker å takke spesielt Monique Nenniger Tosato for henne utmerket teknisk støtte samt Jean-Yves Chatton for sin vitenskapelige råd og imaging CIF plattform UNIL for mikroskopet utstyret. Finansieringen ble gitt av den sveitsiske National Science Foundation.

1. Disseksjon av musen VNO <ol><li> Bruk voksen mus. Som feromon sensing er innblandet i multimodalities, er forsiktig skille mellom stammer, genotyper, kjønn og alder viktig og vil påvirke resultatene. Her velger vi voksen VG mus 30 tidligere brukt for identifisering av et feromon-reseptor par (2-Heptanone-V1rb2) 31 (Fig. 1A). </li><li> Før du starter disseksjon, forberede friskt kaldt kunstig cerebrospinalvæsken (ACSF; NaCl 118 mm, NaHCO 3 25 mm, D-glukose 10 mm, 2 KCl mM, MgCl 2 2 mM, NaH 2 PO 4 1.2 mm, 2 CaCl 2 mm, pH 7,4) mettet med oxycarbon (95% O 2: 5% CO 2). For at Bland alle ACSF komponenter unntatt CaCl 2. Mett løsningen ved direkte boblende den med oxycarbon. Til slutt legger du CaCl 2 og juster med DDH 2 0 til ønsket volum. Hold ACSF løsningen på is inntil uSE. </li><li> Avlivning av musen bør fortrinnsvis gjøres av livmorhalsen forvridning eller ved CO 2 innånding like før forsøket. </li><li> Kutt musa hodet. Plasser den under et dissekere mikroskop i kaldt ACSF kontinuerlig oxycarbonated. </li><li> Skjær underkjeven og posisjon hodet for å visualisere gane (fig 1B). </li><li> Lag et snitt vannrett i den øvre delen av ganen (Fig. 1B) med micro saks og fjern gane membran med micro dissekere tang. Hydrat og rengjør utsatte hulrom med ACSF (Fig. 1C). </li><li> Skjær den øvre og den nedre delen av nasal septum (Fig. 1C). Delikat ekstrakt nasal septum inneholder VNO og legg den direkte i ACSF på is (fig 1D). </li><li> Separate vertikalt de to delene av VNO bruke mikro dissecting pinsett og delicately fjerne brusk kapsel av VNO (Fig. 1E). Sørg for at alle cartilaginous bitene er fjernet. </li></ol> 2. VNO vev slice forberedelse Den VNO vevet skive forberedelsene beskrevet i denne seksjon 2) er hovedsakelig for kalsium avbildning undersøkelser. VNO skiver kan også brukes for immunohistostainings på flytende skiver å verifisere den strukturelle integriteten til vev (se pkt. 3) i protokollen). <ol><li> Forbered lavt smeltepunkt agar (3% i standard PBS) og din arbeidsplass. Du trenger ACSF, en mikrotom og støtter, mikro dissekere tang, embedding mugg (22 x 22 x 20 mm), presisjon kluter, pensler, vev kultur plater, cyanacrylat lim, is og et termometer. </li><li> Fyll innebygging formen med 3% lav-smelting agar. Pass på at temperaturen ikke er høyere enn 41 ° C før du legger vertikalt kort tørkes VNO (Fig. 2A) for å kunne få coronal skiver. </li><li> Plasser innebygging mugg på isfor 1 min før størkning og deretter skille den fra agar blokken. Kutt agar blokk i en pyramideformet form og legg den med lim på mikrotomen støtte (Fig. 2B). </li><li> Skjær koronale VNO skiver med mikrotom, med en hastighet på 0,5 mm / s, en amplitude på 0,7 mm og en tykkelse på 100 mikrometer i kaldt ACSF og samle vev skiver med en pensel før du plasserer dem i en vev kultur plate fylt med kaldt ACSF. </li><li> Hvis skivene inneholder endogene fluorescens som GFP (i gen-målrettede nevroner) kan du velge dem under en fluorescerende stereomikroskop (Fig. 2C). </li></ol> 3. Immunhistokjemi på VNO flytende skiver Målet med denne prosedyren er å verifisere integriteten til VNO vev skiver fås i seksjon 2). Acetylert-tubulin er en microtubuli / cytoskjelettet markør uttrykt i dendritter og microvilli av VNO sensoriske nevroner. For kalsium bildebehandling eksperimenter, gå retningtly til § 4) av protokollen. Den immunohistostaining metoden på flytende VNO skiver kan tilpasses til evalueringen av uttrykket av protein av interesse. For dette formålet, anbefaler vi at du fikse VNO for 1h ved 4 ° C i et fiksativ løsning (Paraformaldehyde 4% i PBS, 7,6 pH) etter punkt 1.7) av protokollen og bruk fra dette punktet PBS ved pH 7,6 enn ACSF løsning. <ol><li> I vev kultur plate, fikse skiver av interesse i en fiksativ løsning (Paraformaldehyde 4% i PBS, 7,6 pH) 1t ved 4 ° C. </li><li> Block din vevet skiver over natten ved 4 ° C i en PBS løsning som inneholder NGS (normal geit serum) 10% og Triton X-100 på 0,5%. </li><li> Inkuber skiver med den primære antistoff (anti-acetylert-tubulin, mus, 1:2000) for 16h ved romtemperatur (RT) i en PBS løsning som inneholder NGS 5% og Triton X-100 på 0,25%. </li><li> Vask 3 ganger i 5 minutter med en PBS løsning som inneholder NGS 2%. </li><li> Inkuber i mørke med Secondary antistoff (Cy5-konjugert geit anti-mus, 1:200) i en PBS løsning som inneholder NGS 2% for 1t ved RT. </li><li> Vask 3 ganger i 5 minutter med PBS som inneholder NGS 2%, NGS PBS 1% og PBS bare. </li><li> Montere skiver i en fluorescerende montering media (som inneholder eller ikke DAPI) ved å plassere dem i midten av hydrofobe avgrensede soner (bruk en hydrofob penn) og dekke skiver med Dekkglass. </li><li> Gjøre observasjoner og oppkjøp med konfokalmikroskopi og en programvare for 3D-rekonstruksjoner (fig 2D-F). </li></ol> Fire. Kalsium bildebehandling på VNO skiver <ol><li> Følgende prosedyrer vil foregå i mørket. Inkuber VNO skiver for 1t ved 37 ° C i en lasting løsning bestående av kalde ACSF med Fura-2am (7 mM; stamløsningen av 1 mm i DMSO) og pluronic 0,1% (w / v; stamløsning på 20% i DDH 2 O). </li><li> Hold lastet skiver på isen med oxycarbonation før bruk. Loaded skiver kan holdes for3-4timer. </li><li> Plasser lastet skiver med en pensel i et perfusjon kammer inneholder ACSF og opprettholde skiver med en vev slice anker (Fig. 3A). </li><li> Plasser perfusjon kammer på scenen av en kalsium bildediagnostikk mikroskop (Fig. 3B) og kontinuerlig perfuse med oxycarbonated ACSF på RT. Temperaturen kan tilpasses med bruk av en bipolar temperaturregulator. </li><li> Observasjoner av det belastede VNO skiver (Fig. 3C-E) er utført med en invertert fluorescens mikroskop med 25x eller 63x objektiv og en kul SNAP-HQ kamera. Illumination gjøres sekvensielt (340 / 380 nm) med polychromator instrument og spilte med en hastighet på 5 Hz. Filtrert utslipp er gjort på 510 nm. Intracellulære kalsium ratio endringer (ΔF = 340 nm/380 nm) er overvåket med en passende programvare. </li><li> Chemostimulation bør velges i henhold til din egen eksperimentelle formål. Her perfusions av ACSF inneholder et feromon mix (isobutylamine, 2-Heptanone, 4-Heptanone, 2-heptanol, pentylacetate, dimethylpyrazine, α / β-Farnesene, 10 -6 M), 2-Heptanone (10 -6 M) eller fersk samlet mannlige og kvinnelige (1: 1) mus urin (1:100) utføres 32. Perfusjon av ATP (125 mm) er brukt som en levedyktighet test på slutten av forsøkene (Fig. 3F) og bør indikere en andel på ca 80% levedyktig nerveceller. Under disse betingelsene, kan skiver brukes opp til 2 timer. </li><li> GFP-merket subpopulasjoner av sensoriske nevroner er visualisert ved spesiell belysning (her V1rb2 uttrykke nevroner) og kan analyseres presist (Fig. 3G-I). </li></ol> 5. Representant Resultater: Å etablere en funksjonell analyse for å undersøke multi transduksjon banene foregår i mus VNO, eller å identifisere nye feromon-reseptor par, tar vi nytte av VG musen linjen (Fig. 1A </strong&gt;). I denne linjen, én av 240 V1Rs reseptorer, er V1Rb2 reseptor GFP-merket slik at de lett visualisering av en bestemt undergruppe vomeronasal sensoriske nevroner. Etter ekstraksjon og disseksjon av VNO (Fig. 1E), forbereder vi akutt VNO skiver (Fig. 2C). Vi fikse en brøkdel av dem, for å sjekke og validere tissular integritet utarbeidelse ved å utføre immunohistostainings mot acetylert-tubulin protein (fig. 2D-F). Den andre fraksjonen av skivene brukes for kalsium bildebehandling eksperimenter. For det er skiver lastet med Fura-2am (Fig. 3C-E) og den intracellulære kalsium nivået av hvert neuron er overvåket som en ΔF ratio (Fig. 3F). Levedyktighet av nerveceller blir evaluert av perfusjon av ATP (125 mm), etter som rask og forbigående økning av ΔF forholdet er forventet (Fig. 3F). Urin være en stor kilde til feromoner, perfusjon av ferskly samlet mus urin (1:100) brukes som en endogen kontroll. Det utløser kalsium transienter i ca 50% av de registrerte nevroner (celle 1 og 2, fig. 3F). Under GFP belysning, er V1Rb2 positive nevroner observerbare, og perfusjon av sine kjente pheromonal ligand, 2-Heptanone, initierer cellulær aktivering (celle 1, fig. 3I). Interessant nok er neuronal aktiveringer også observerbar i en brøkdel av nevroner som ikke uttrykker V1Rb2 reseptor (GFP negative nevroner) (celle 2, fig. 3I), som viser kompleksiteten i pheromone koding i VNO. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/3311/3311fig1.jpg" /> Figur 1. Disseksjon av musen vomeronasal organ. (A) En mus fra VG linjen. (B) Etter barmhjertighetsdrap av musen, er det fulle hodet plassert under en kikkert mikroskop og underkjeven er fjernet for å visualisere ganen. En liten horisontal innsnitt er gjort(Svart stiplet linje). (C) Etter fjerning av ganen, er nasal septum foret med VNO kutt i øvre og nedre del (hvite stiplede linjer) for å forenkle VNO utvinning. (D) VNO er ​​plassert i ACSF løsning og skilt (sett: høyere makt visning av to deler). (E) Den cartilaginous kapsel av VNO er ​​delicately fjernet, og VNO uten sin cartilaginous kapsel er brukt for resten av forsøkene. Scale barer er: BE, 1 mm. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/3311/3311fig2.jpg" /> Figur 2. Mouse vomeronasal akutt slice forberedelse og tissular integritet. (A) Musen VNO er ​​vertikalt integrert i en agar 3% løsning. Temperaturen på agar må være lavere enn 41 ° C. (B) agar blokk er kuttet i en pyramideformet form og 100 mikrometer VNO seksjoner (svart stiplet linje) er generert i ACSF. (C) VNO skiver kan velges under en fluorescerende stereomikroskop for å visualisere en spesifikkpopulasjon av merket sensoriske nevroner. (DF) Tissular integritet kan evalueres ved immunohistostainings mot acetylert-tubulin protein, en høyere makt visning av V1rb2 genet målrettede nevroner demonstrere perfekt bevaring av preparatet. Nevroner med sine lange dendritter nådde overflaten av lumen (E) samt uttrykk for strukturelle protein i dendrittiske knotter og microvilli kan observeres (F). Scale barer er: B, 5 mm, C, 60 mikrometer, D, 40 mikrometer, EF, 20 mikrometer. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/3311/3311fig3.jpg" /> Figur 3. Kalsium bildebehandling og feromon deteksjon i vomeronasal akutte vev skiver. (A) Etter en Fura-2am lasting fase, er VNO skiver plassert i en perfusjon kammer og blir vedlikeholdt med en tilpasset anker (high power visning). (B) eksperimenter utføres i mørket og VNO skiver kontinuerlig perfused med ACSF på RT med et vakuum system. Temperaturen kan chosno hjelp av en temperaturregulator system består av en bipolar Pelletier element og et termisk sonde. Dette bestemte forsøket ble utført på RT. (CE) VNO skiver er observerbare i henhold Hoffman fasekontrast (C, HV) eller Fura 380 nm belysning før (D) og under neuronal aktivering (E, her med ATP). (F) neuronal levedyktighet er evaluert med perfusjon av ATP (125 mm). Her er chemostimulation gjort med urin (Urin, 1:100) eller med en blanding av mus feromoner (mix ph., 10 -6 M) med en konstant vannmengde på 165 ml / t. Intracellulære kalsium nivåer (ΔF) kan tas opp individuelt for hver celle (celle 1 til 3). (G) En V1Rb2 nevron er visualisert i henhold GFP belysning (1). (H) Den lasting av denne nervecellen (1) samt en non-V1rb2 uttrykker neuron (2) vises. (I) Den V1rb2 nevron er i stand til å svare på 2-Heptanone med en intracellulær kalsium øker. Dette bestemte non-V1rb2 uttrykke nervecelle reagerer også til 2-Heptanone (celle 2). Scale barer er: CE, 20 mikrometer, GH,15 mikrometer; ΔF = 340 nm / 380 nm. (F og jeg) Varighet av stimulus søknaden er indikert av barer under hvert spor. Den vilkårlige fargeskala representerer fluorescens intensitet.

<ol>
	<li>Karlson, P., L&#252;scher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Pheromones"+a+new+term+for+a+class+of+biologically+active+substances.">"Pheromones" a new term for a class of biologically active substances.</a> Nature. 183, 55-56 (1959).</li><li>Cavaggioni, A., Mucignat-Caretta, C., Redaelli, M., Zagotto, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+scent+of+urine+spots+of+male+mice,+Mus+musculus:+Changes+in+chemical+composition+over+time.">The scent of urine spots of male mice, Mus musculus: Changes in chemical composition over time.</a> Rapid Commun. Mass Spectrom. 20, 3741-3746 (2006).</li><li>Novotny, M., Harvey, S., Jemiolo, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry+of+male+dominance+in+the+house+mouse,+Mus+domesticus.">Chemistry of male dominance in the house mouse, Mus domesticus.</a> Experientia. 46, 109-113 (1990).</li><li>Leinders-Zufall, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+pheromone+detection+by+mammalian+vomeronasal+neurons.">Ultrasensitive pheromone detection by mammalian vomeronasal neurons.</a> Nature. 405, 792-796 (2000).</li><li>Leinders-Zufall, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MHC+class+I+peptides+as+chemosensory+signals+in+the+vomeronasal+organ.">MHC class I peptides as chemosensory signals in the vomeronasal organ.</a> Science. 306, 1033-1037 (2004).</li><li>Leinders-Zufall, T., Ishii, T., Mombaerts, P., Zufall, F., Boehm, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+requirements+for+the+activation+of+vomeronasal+sensory+neurons+by+MHC+peptides.">Structural requirements for the activation of vomeronasal sensory neurons by MHC peptides.</a> Nat. Neurosci. 12, 1551-1558 (2009).</li><li>Jemiolo, B., Xie, T. M., Novotny, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Socio-sexual+olfactory+preference+in+female+mice:+attractiveness+of+synthetic+chemosignals.">Socio-sexual olfactory preference in female mice: attractiveness of synthetic chemosignals.</a> Physiol. Behav. 50, 1119-1122 (1991).</li><li>Achiraman, S., Archunan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+urinary+volatiles+in+Swiss+male+mice+(Mus+musculus):+bioassay+of+identified+compounds.">Characterization of urinary volatiles in Swiss male mice (Mus musculus): bioassay of identified compounds.</a> J. Biosci. 27, 679-686 (2002).</li><li>Dulac, C., Torello, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+detection+of+pheromone+signals+in+mammals:+from+genes+to+behaviour.">Molecular detection of pheromone signals in mammals: from genes to behaviour.</a> Nat. Rev. Neurosci. 4, 551-562 (2003).</li><li>Brennan, P. A., Zufall, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pheromonal+communication+in+vertebrates.">Pheromonal communication in vertebrates.</a> Nature. 444, 308-315 (2006).</li><li>Mondor, E. B., Roitberg, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inclusive+fitness+benefits+of+scent-marking+predators.">Inclusive fitness benefits of scent-marking predators.</a> Proc. Biol. Sci. 271, 341-343 (2004).</li><li>Holy, T. E., Dulac, C., Meister, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+of+vomeronasal+neurons+to+natural+stimuli.">Responses of vomeronasal neurons to natural stimuli.</a> Science. 289, 1569-1572 (2000).</li><li>Keverne, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Vomeronasal+Organ.">The Vomeronasal Organ.</a> Science. 286, 716-720 (1999).</li><li>Weiler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+development+of+the+rat+vomeronasal+organ.">Postnatal development of the rat vomeronasal organ.</a> Chem. Senses. 30, 127-128 (2005).</li><li>Zufall, F., Kelliher, K. R., Leinders-Zufall, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pheromone+detection+by+mammalian+vomeronasal+neurons.">Pheromone detection by mammalian vomeronasal neurons.</a> Microsc. Res. Tech. 58, 251-260 (2002).</li><li>Ciges, M., Labella, T., Gayoso, M., Sanchez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructure+of+the+organ+of+Jacobson+and+comparative+study+with+olfactory+mucosa.">Ultrastructure of the organ of Jacobson and comparative study with olfactory mucosa.</a> Acta. Otolaryngol. 83, 47-58 (1977).</li><li>Munger, S. D., Leinders-Zufall, T., Zufall, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subsystem+organization+of+the+mammalian+sense+of+smell.">Subsystem organization of the mammalian sense of smell.</a> Annu. Rev. Physiol. 71, 115-140 (2009).</li><li>Mombaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+and+ligands+for+odorant,+vomeronasal+and+taste+receptors.">Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors.</a> Nat. Rev. Neurosci. 5, 263-278 (2004).</li><li>Ryba, N. J. P., Tirindelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+multigene+family+of+putative+pheromone+receptors.">A new multigene family of putative pheromone receptors.</a> Cell. 19, 371-379 (1997).</li><li>Matsunami, H., Buck, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multigene+family+encoding+a+diverse+array+of+putative+pheromone+receptors+in+mammals.">A multigene family encoding a diverse array of putative pheromone receptors in mammals.</a> Cell. 90, 775-784 (1997).</li><li>Herrada, G., Dulac, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+family+of+putative+pheromone+receptors+in+mammals+with+a+topographycally+organized+and+sexually+dimorphic+distribution.">A novel family of putative pheromone receptors in mammals with a topographycally organized and sexually dimorphic distribution.</a> Cell. 90, 763-773 (1997).</li><li>Dulac, C., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+family+of+genes+encoding+putative+pheromone+receptors+in+mammals.">A novel family of genes encoding putative pheromone receptors in mammals.</a> Cell. 83, 195-206 (1995).</li><li>Young, J. M., Massa, H. F., Hsu, L., Trask, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extreme+variability+among+mammalian+V1R+gene+families.">Extreme variability among mammalian V1R gene families.</a> Genome. Res. 20, 10-18 (2009).</li><li>Yang, H., Shi, P., Zhang, Y. P., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composition+and+evolution+of+the+V2r+vomeronasal+receptor+gene+repertoire+in+mice+and+rats.">Composition and evolution of the V2r vomeronasal receptor gene repertoire in mice and rats.</a> Genomics. 86, 306-315 (2005).</li><li>Levai, O., Feistel, T., Breer, H., Strotmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+in+the+vomeronasal+organ+express+odorant+receptors+but+project+to+the+accessory+olfactory+bulb.">Cells in the vomeronasal organ express odorant receptors but project to the accessory olfactory bulb.</a> J. Comp. Neurol. 498, 476-490 (2006).</li><li>Riviere, S., Challet, L., Fluegge, D., Spehr, M., Rodriguez, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formyl+peptide+receptor-like+proteins+are+a+novel+family+of+vomeronasal+chemosensors.">Formyl peptide receptor-like proteins are a novel family of vomeronasal chemosensors.</a> Nature. 459, 574-577 (2009).</li><li>Liberles, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formyl+peptide+receptors+are+candidate+chemosensory+receptors+in+the+vomeronasal+organ.">Formyl peptide receptors are candidate chemosensory receptors in the vomeronasal organ.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 9842-9847 (2009).</li><li>Liman, E. R., Corey, D. P., Dulac, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRP2:+A+candidate+transduction+channel+for+mammalian+pheromone+sensory+signaling.">TRP2: A candidate transduction channel for mammalian pheromone sensory signaling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 5791-5796 (1999).</li><li>Kelliher, K. R., Spehr, M., Li, X. H., Zufall, F., Leinders-Zufall, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pheromonal+recognition+memory+induced+by+TRPC2-independent+vomeronasal+sensing.">Pheromonal recognition memory induced by TRPC2-independent vomeronasal sensing.</a> Eur. J. Neurosci. 23, 3385-3390 (2006).</li><li>Rodriguez, I., Feinstein, P., Mombaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variable+patterns+of+axonal+projections+of+sensory+neurons+in+the+mouse+vomeronasal+system.">Variable patterns of axonal projections of sensory neurons in the mouse vomeronasal system.</a> Cell. 97, 199-208 (1999).</li><li>Boschat, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pheromone+detection+mediated+by+a+V1r+vomeronasal+receptor.">Pheromone detection mediated by a V1r vomeronasal receptor.</a> Nature. Neuroscience. 5, 1261-1262 (2002).</li><li>Brechbühl, J., Klaey, M., Broillet, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grueneberg+ganglion+cells+mediate+alarm+pheromone+detection+in+mice.">Grueneberg ganglion cells mediate alarm pheromone detection in mice.</a> Science. 321, 1092-1095 (2008).</li></ol>

Ingen interessekonflikter erklært.

Den kalsium bildebehandling Metoden som presenteres her gjør det mulig å ta opp, i en akutt slice forberedelse, pheromonal svarene av mus VNO nerveceller. Med denne tilnærmingen, er disseksjon fra dyret til vomeronasal nevroner, med litt øvelse, lett oppnåelig og gir en lang levende vev forberedelse. Den tillater tidkrevende eksperimenter som farmakologiske undersøkelser eller studiet av pheromonal koding. Med denne fysiologiske teknikken kan store bestander samt presis neuronal subpopulasjoner bli analysert spesielt. I tillegg kan denne metoden kan enkelt tilpasses immunhistokjemisk tilnærminger eller eksperimenter basert på andre kalsium fargestoffer. Bruken av disse kombinerte metoder vil sikkert tillate identifisering av nye pheromonal ligander for de mange foreldreløse chemoreceptors uttrykt i musen vomeronasal organ.

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagens </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> Adenosin 5&#39;-trifosfat disodium salt-løsning (ATP) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A6559-25UMO </td><td></td></tr><tr><td> Agar </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A7002-100G </td><td> Fortrinnsvis for immunhistokjemi </td></tr><tr><td> Agar (lav-smelting) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A0701-25G </td><td> Fortrinnsvis for kalsium avbildning </td></tr><tr><td> CL-100 Bipolar Temperature Controller </td><td> Warner Instrumenter </td><td> W64-0352 </td><td></td></tr><tr><td> Confocal mikroskop </td><td> Leica Microsystems </td><td> SP5 AOBS </td><td></td></tr><tr><td> Cy5-AffiniPure geit anti-mus IgG </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> 115-175-071 </td><td> Beskytt mot lys </td></tr><tr><td> DMSO (Dimethyl sulfoxide) </td><td> Merck </td><td> 317275-100ML </td><td></td></tr><tr><td> Inkludering molds, Peel-A-Way </td><td> Polysciences </td><td> 18646A-1 </td><td> 22 x 22 x 20 mm </td></tr><tr><td> Fluorescent montering media (Vectashield med DAPI, 10 ml) </td><td> Rectolab </td><td> H-1200 </td><td></td></tr><tr><td> Fura-2am </td><td> Teflabs </td><td> 0103 </td><td> Beskytt mot lys </td></tr><tr><td> Glisseal N (vakuum fett, 60 g) </td><td> Pinnen Chemie </td><td> Glisseal N </td><td></td></tr><tr><td> Stort bad innspilling kammeret (RC-26G) </td><td> Warner Instrumenter </td><td> 64-0235 </td><td></td></tr><tr><td> MetaFluor (programvare for kalsium avbildning; v.7.6.5.0) </td><td> Visitron Systems </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Monoklonale Anti-tubulin, acetylated Mouse antistoff </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T6793-.2ML </td><td></td></tr><tr><td> Normal geit serum (NGS, 10 ml) </td><td> Interchim </td><td> UP379030 </td><td></td></tr><tr><td> Plattform for kammere (P-1) </td><td> Warner Instrumenter </td><td> 64-0277 </td><td></td></tr><tr><td> Pluronic F-127, 2 g </td><td> Invitrogen </td><td> P-6867 </td><td></td></tr><tr><td> Roti Coll (Dosering flaske, 10 g) </td><td> Carl Roth </td><td> 0258.1 </td><td></td></tr><tr><td> SC-20 Dual In-line Solution varmeapparat / Cooler </td><td> Warner Instrumenter </td><td> W64-0353 </td><td></td></tr><tr><td> Slice anker (SHD-26GKIT) </td><td> Warner Instrumenter </td><td> 64-0266 </td><td></td></tr><tr><td> Stereofluorescence mikroskop </td><td> Leica Microsystems </td><td> MZ16FA </td><td></td></tr><tr><td> Super PAP PEN (hydrofobepenn) </td><td> Pelco International </td><td> 22309 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Fluka </td><td> 93420-250ML </td><td></td></tr><tr><td> Vibrerende blad mikrotom VT 1200-tallet </td><td> Leica Microsystems </td><td> 14048142066 </td><td></td></tr><tr><td> VisiChrome høy hastighet polychromator system </td><td> Visitron Systems </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 3D datavisualisering (Imaris; v.6.3.1) </td><td> Bitplane Scientific Software </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

imaging pheromone sensing in a mouse vomeronasal acute tissue slice preparation

Peter Karlson og Martin Lüscher brukte begrepet feromon for første gang i 1959 1 å beskrive kjemikalier som brukes for intra-arter kommunikasjon. Feromoner er flyktige eller ikke-flyktige kortvarig molekyler to skilles og / eller inntatt i biologiske væsker 3,4, som urin, en væske kjent for å være en hovedkilde av feromoner 3. Pheromonal kommunikasjon er innblandet i en rekke viktige dyr modaliteter som pårørende interaksjoner 5,6, hierarkiske organisasjoner 3 og seksuell samhandling 7,8 og er dermed direkte korrelert med overlevelsen av en gitt art 9,10,11. Hos mus, er evnen til å oppdage feromoner medieres hovedsaklig via vomeronasal organ (VNO) 10,12, en sammenkoblet struktur plassert på bunnen av nesehulen, og omsluttet av en cartilaginous kapsel. Hver VNO har et rørformet form med et lumen 13,14 slik at kontakten med eksternekjemisk verden. Den sensoriske neuroepithelium er hovedsakelig sammensatt av vomeronasal bipolar sensoriske nevroner (VSNs) 15. Hver VSN strekker et enkelt dendrite til lumen ender i en stor dendrittiske knotten bærer opptil 100 microvilli innblandet i kjemiske deteksjon 16. Tallrike subpopulasjoner av VSNs er til stede. De er differensiert ved chemoreceptor de uttrykker og dermed muligens av ligand (e) de anerkjenner 17,18. To viktigste vomeronasal receptor familier, V1Rs og V2Rs 19,20,21,22, er komponert henholdsvis 240 23 og 120 24 medlemmer og er uttrykt i separate lag av neuroepithelium. Olfactory reseptorer (ORS) 25 og formyl peptid reseptorer (FPRs) 26,27 er også uttrykt i VSNs. Hvorvidt disse neuronal subpopulasjoner bruke samme nedstrøms signalveien for sensing feromoner er ukjent. Til tross for en stor rolle spilt av en kalsium-gjennomtrengelig kanal (TRPC2) tilstede i microvilli av modne nevroner 28 TRPC2 uavhengige transduksjon kanaler har blitt foreslått 6,29. På grunn av det høye antallet neuronal subpopulasjoner og særegne morfologi av orgelet, farmakologiske og fysiologiske undersøkelser av signalering elementer til stede i VNO er ​​komplekse. Her presenterer vi en akutt vev slice utarbeidelsen av musen VNO for utføring av kalsium avbildning undersøkelser. Denne fysiologiske tilnærmingen gjør observasjoner i det naturlige miljøet til en levende vev, generelle eller individuelle subpopulasjoner av VSNs tidligere lastet med Fura-2am, en kalsium fargestoff. Denne metoden er også praktisk for å studere eventuelle GFP-merket feromon reseptoren og kan tilpasses for bruk av andre fluorescerende kalsium sonder. Som et eksempel, bruker vi her en VG mus 30 linje, der oversettelsen av feromon V1rb2 reseptoren er knyttet til uttrykket av GFP av en polycistronic strategi. </p&gt;

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Pheromone Sensing in a Mouse Vomeronasal Acute Tissue Slice Preparation at JoVE.com

Imaging Pheromone Sensing in a Mouse Vomeronasal Acute Tissue Slice Preparation

Hos mus, er evnen til å oppdage feromoner medieres hovedsaklig via vomeronasal organ (VNO). Her er en akutt vev skive utarbeidelse av VNO for å utføre kalsium avbildning beskrevet. Denne fysiologiske tilnærmingen gjør observasjoner av subpopulasjoner og / eller enkelte nevroner i en levende vev og er praktisk for reseptor-ligand identifikasjon.

Imaging Pheromone Sensing i en mus vomeronasal Akutt Tissue Slice Forberedelse

Peter Karlson and Martin L&uuml;scher used the term pheromone for the first time in 19591 to describe chemicals used for intra-species communication. ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Multielectrode Array Recordings of the Vomeronasal Epithelium

Understanding neural circuits requires methods to record from many neurons simultaneously. For in vitro studies, one currently available technology is ...

Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The ...

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Slice Preparation, Organotypic Tissue Culturing and Luciferase Recording of Clock Gene Activity in the Suprachiasmatic Nucleus

A central circadian (~24 hr) clock coordinating daily rhythms in physiology and behavior resides in the suprachiasmatic nucleus (SCN) located in the ...

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Imaging Neuronal Responses in Slice Preparations of Vomeronasal Organ Expressing a Genetically Encoded Calcium Sensor

Imaging neuronal Responses i Slice Produkter av vomeronasal Organ uttrykker en Genetisk Encoded Kalsium Sensor

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within ...

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

Tissue Preparering og farging av Mouse Sensoriske nervefibre Innervating Hud og Limb Bones

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in ...

Preparation of Acute Subventricular Zone Slices for Calcium Imaging

Utarbeidelse av Akutt subventricular sone Slices for kalsium Imaging

The subventricular zone (SVZ) is one of the two neurogenic zones in the postnatal brain. The SVZ contains densely packed cells, including neural ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

Ex vivo tilbe Intakt Vomeronasal orgel og tilbehør luktelappen

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Slice It Hot: Acute Adult Brain Slicing in Physiological Temperature

Slice It Hot: Akutt Adult Brain Slicing i Fysiologisk Temperatur

Here we present a protocol for preparation of acute brain slices. This procedure is a critical element for electrophysiological patch-clamp experiments ...