Name: imaging pheromone sensing in a mouse vomeronasal acute tissue slice preparation
Uploaded: 2011-12-06T12:00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Pheromone Sensing in a Mouse Vomeronasal Acute Tissue Slice Preparation at JoVE.com

Vi vill tacka särskilt Monique Nenniger Tosato för hennes utmärkta teknisk support samt Jean-Yves Chatton för hans vetenskapliga råd och avbildning CIF plattform UNIL för mikroskopet utrustning. Finansieringen kom från den schweiziska National Science Foundation.

1. Dissektion av musen VNO <ol><li> Använd vuxna möss. Som feromon avkänning är inblandad i multimodalities är noggrann skillnad mellan stammar och genotyper, kön och åldrar viktig och kommer att påverka dina resultat. Här väljer vi vuxna VG möss 30 som tidigare använts för att identifiera en feromon-receptor par (2-heptanone-V1rb2) 31 (Fig. 1A). </li><li> Innan du startar dissekering, bered nya kalla artificiella cerebrospinalvätska (ACSF, NaCl 118 mm, NaHCO 3 25 mm, D-glukos 10 mm, KCl 2 mm, MgCl 2 2 mM, näe 2 PO 4 1,2 mm, CaCl 2 2 mm, pH 7,4) mättad med oxycarbon (95% O 2: 5% CO 2). För att blanda allt ACSF komponenter utom CaCl 2. Mätta lösning genom direkt bubblande den med oxycarbon. I slutändan, tillsätt CaCl 2 och justera med DDH 2 0 till önskad volym. Håll ACSF lösningen på is tills uSE. </li><li> Eutanasi på musen bör företrädesvis ske genom halsdislokation eller CO 2 inandning strax före försöket. </li><li> Skär musen huvudet. Placera den under ett dissekera mikroskop i kallt ACSF kontinuerligt oxycarbonated. </li><li> Skär underkäken och placera huvudet för att visualisera gommen (bild 1B). </li><li> Gör ett snitt horisontellt i övre delen av gommen (bild 1B) med mikro sax och ta bort gommen membran med mikro dissekera pincett. Hydrat och rengör den exponerade kaviteten med ACSF (bild 1C). </li><li> Skär den övre och den nedre delen av näsans skiljevägg (bild 1C). Försiktigt extrahera nässkiljeväggen innehåller VNO och placera den direkt i ACSF på is (bild 1D). </li><li> Separata vertikalt de två delarna av VNO använda mikro dissekera pincett och fint ta bort brosk kapsel VNO (Fig. 1E). Se till att alla brosk bitar tas bort. </li></ol> 2. VNO vävnad skiva förberedelse VNO vävnaden skiva som beskrivs i detta avsnitt 2) är främst för utredningar kalcium avbildning. VNO skivor kan även användas för immunohistostainings på flytande skivor för att verifiera den strukturella integriteten av vävnad (se avsnitt 3) i protokollet). <ol><li> Förbered lågsmältande agar (3% i standard PBS) och din arbetsplats. Du behöver ACSF, en mikrotom och stöder, mikro dissekera pincett, bädda formar (22 x 22 x 20 mm), precision våtservetter, penslar, vävnadskulturer tallrikar, cyanacrylat lim, is och en termometer. </li><li> Fyll inbäddning formen med 3% lågsmältande agar. Se till att temperaturen inte är högre än 41 ° C innan de placeras lodrätt på kort torkas VNO (Fig. 2A) för att kunna få coronal skivor. </li><li> Placera inbäddning mögel på isför 1 min tills stelning och sedan skilja den från agar blocket. Skär agar block i en pyramidal form och placera den med lim på mikrotomen stöd (Fig. 2B). </li><li> Skär koronalt VNO skivor med mikrotomen, med en hastighet av 0,5 mm / s, en amplitud på 0,7 mm och en tjocklek på 100 mikrometer i kallt ACSF och samla vävnaden skivor med en borste innan du lägger dem i en vävnadsodling tallrik fylld med kallt ACSF. </li><li> Om dina skivor innehåller endogen fluorescens som GFP (i gen riktad neuroner) kan du välja dem under ett lysrör stereomikroskop (Fig. 2C). </li></ol> 3. Immunohistokemi på VNO flytande skivor Målet med detta förfarande är att kontrollera integriteten i VNO vävnaden skivor erhållits i avsnitt 2). Acetylerade-tubulin är en mikrotubuli / cytoskelettet markör uttrycks i dendriter och mikrovilli av VNO sensoriska nervceller. För experiment kalcium bildbehandling, gå riktningtly till avsnitt 4) i protokollet. Den immunohistostaining metod på flytande VNO skivor kan anpassas till utvärderingen av uttrycket av proteiner av intresse. För detta ändamål rekommenderar vi att du fixa VNO för 1h vid 4 ° C i ett fixativ lösning (paraformaldehyd 4% i PBS, pH 7,6) efter punkt 1.7) i protokollet och använda från denna punkt PBS vid pH 7,6 i stället för ACSF lösning. <ol><li> I vävnadsodling plattan, fixa skivor av intresse i ett fixativ lösning (paraformaldehyd 4% i PBS, pH 7,6) 1h vid 4 ° C. </li><li> Spärra ditt vävnad skivor över natten vid 4 ° C i en PBS lösning innehållande NGS (normal get serum) 10% och Triton X-100 på 0,5%. </li><li> Inkubera skivor med den primära antikroppen (anti-acetylerade-tubulin, mus, 1:2000) för 16 timmar vid rumstemperatur (RT) i en PBS lösning innehållande NGS 5% och Triton X-100 på 0,25%. </li><li> Tvätta tre gånger i 5 minuter med en PBS-lösning innehållande NGS 2%. </li><li> Inkubera i mörker med Secondary antikropp (Cy5-konjugerat get anti-mus, 1:200) i en PBS lösning innehållande NGS 2% för 1h vid RT. </li><li> Tvätta tre gånger i 5 minuter med PBS innehållande NGS 2%, NGS PBS 1% och PBS bara. </li><li> Montera din skivor i ett fluorescerande montering media (som innehåller eller inte DAPI) genom att placera dem i mitten av de hydrofoba avgränsade zoner (använd en hydrofob penna) och täck skivorna med täckglas. </li><li> Göra observationer och förvärv med konfokalmikroskopi och en programvara som möjliggör 3D-rekonstruktioner (Fig. 2D-F). </li></ol> 4. Kalcium avbildning på VNO skivor <ol><li> Följande förfaranden kommer att ske i mörker. Inkubera VNO skivor för 1 timme vid 37 ° C i en lastning lösning som består av kall ACSF med Fura-2:00 (7 mikroM, stamlösning av 1 mm i DMSO) och pluronic 0,1% (w / v; stamlösning på 20% i DDH 2 O). </li><li> Förvara den laddade skivor på is med oxycarbonation fram till användningen. Loaded skivor kan förvaras3-4h. </li><li> Placera den laddade skivor med en borste i ett perfusion kammare som innehåller ACSF och underhålla skivor med en vävnad slice ankare (Fig. 3A). </li><li> Placera perfusionen kammare på scenen av en kalcium imaging mikroskop (Fig. 3B) och kontinuerligt BEGJUTA med oxycarbonated ACSF vid RT. Temperaturen kan anpassas med hjälp av en bipolär temperaturregulator. </li><li> Observationer av den laddade VNO skivor (Fig. 3C-E) utförs med ett inverterat fluorescensmikroskop, med en 25x eller 63x objektiv och en cool SNAP-HQ kamera. Belysningen görs sekventiellt (340 / 380 nm) med en polychromator instrument och spelade in med en hastighet av 5Hz. Filtrerad utsläpp sker vid 510 nm. Intracellulär kalcium förhållandet förändringar (ΔF = 340 nm/380 nm) följs upp med lämplig mjukvara. </li><li> Chemostimulation bör väljas efter eget experimentellt syfte. Här perfusion av ACSF innehåller ett feromon mIX (isobutylamine, 2-heptanone, 4-heptanone, 2-heptanol, pentylacetate, dimethylpyrazine, α / β-farnesene, 10 -6 m), 2-heptanone (10 -6 M) eller nytagen manliga och kvinnliga (1: 1) mus urin (1:100) utförs 32. Perfusion av ATP (125 M) används som ett lönsamhetskrav i slutet av experimenten (Fig. 3F) och bör innehålla en andel på cirka 80% livskraftiga nervceller. Under dessa förhållanden kan skivor användas upp till 2 timmar. </li><li> GFP-märkta subpopulationer av sensoriska nervceller visualiseras med särskilda belysning (här V1rb2 uttrycka nervceller) och kan analyseras noggrant (bild 3G-I). </li></ol> 5. Representativa resultat: Att etablera en funktionell analys för att undersöka flera transduktion vägar äger rum i musen VNO, eller för att identifiera nya feromon-receptor par, tar vi nytta av VG musen linjen (Fig. 1A </strong&gt;). I denna linje, en av 240 V1Rs receptorer är V1Rb2 receptorn GFP-märkta så att de lätt visualisering av en viss subpopulation av vomeronasala sensoriska nervceller. Efter extraktion och dissekering av VNO (Fig. 1E), förbereder vi akut VNO skivor (Fig. 2C). Vi fixa en bråkdel av dem, för att kontrollera och validera tissular integritet av preparatet genom att utföra immunohistostainings mot acetylerade-tubulin protein (Fig. 2D-F). Den andra bråkdel av skivor används för experiment kalcium avbildning. För det är skivor laddade med Fura-2:00 (Fig. 3C-E) och den intracellulära kalcium för varje neuron övervakas som en ΔF ratio (Fig. 3F). Livskraft nervceller utvärderas av perfusion av ATP (125 M), varefter snabba och övergående ökning av ΔF förhållandet väntas (Fig. 3F). Urin är en viktig källa av feromoner, perfusion av färskaly samlas mus urin (1:100) används som en endogen kontroll. Det leder kalcium transienter i cirka 50% av den inspelade nervceller (cell 1 och 2, fig.. 3F). Enligt GFP belysning, är V1Rb2 positiva nervceller observerbara och perfusion av dess kända pheromonal ligand, 2-heptanone, initierar cellulär aktivering (cell 1, fig.. 3I). Intressant är neuronala aktiveringar också observeras i en bråkdel av nervceller som inte uttrycker V1Rb2 receptorn (GFP negativ neuroner) (cell 2, bild. 3I), vilket visar komplexiteten i feromon kodning i VNO. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/3311/3311fig1.jpg" /> Figur 1. Dissection på musen vomeronasala orgel. (A) En mus från VG linjen. (B) Efter avlivning av musen, är den fulla huvudet placeras under en kikare mikroskop och underkäken är borttagen för att visualisera gommen. Ett litet horisontellt snitt görs(Svart streckad linje). (C) efter avlägsnande av gommen är nässkiljeväggen fodrad med VNO skära i den övre och den nedre delen (vita streckade linjer) för att underlätta VNO utvinning. (D) VNO är placerat i ACSF lösning och separerade (infoga: högre effekt bild av två delar). (E) brosk kapsel av VNO är försiktigt bort och VNO utan dess brosk kapsel används för resten av experimenten. Skala barer är: BE, 1 mm. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/3311/3311fig2.jpg" /> Figur 2. Mouse vomeronasala akut skiva förberedelse och tissular integritet. (A) Musen VNO är vertikalt inbäddad i en agar 3% lösning. Temperaturen på agar måste vara lägre än 41 ° C. (B) agar blocket skärs i en pyramidal form och 100 ìm VNO sektioner (svart streckad linje) genereras i ACSF. (C) VNO skivor kan väljas under en fluorescerande stereomikroskop för att visualisera en specifikbefolkning taggade sensoriska nervceller. (DF) Tissular integritet kan utvärderas av immunohistostainings mot acetylerade-tubulin protein, en högre makt bild av V1rb2 gen riktad neuroner visa den perfekta bevarandet av preparatet. Nervceller med sina långa dendriter når ytan av lumen (E) samt ett uttryck för den strukturella protein i dendritiska rattar och mikrovilli kan observeras (F). Skala barer är: B, 5 mm, C, 60 ìm, D, 40 ìm, EF, 20 ìm. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/3311/3311fig3.jpg" /> Figur 3. Kalcium bildbehandling och feromon upptäckt i vomeronasala akut vävnad skivor. (A) Efter en Fura-2:00 laddningsfasen är VNO skivor placeras i en perfusion kammare och upprätthålls med ett anpassat ankare (högeffekt vy). (B) Experiment utförs i mörker och VNO skivor kontinuerligt perfusion med ACSF vid RT med ett vakuumsystem. Temperaturen kan chossv använda ett system temperaturregulator består av en bipolär Pelletier element och en termisk sond. Här experimentet utfördes vid RT. (CE) VNO skivor är observerbara i Hoffman faskontrast (C, HV) eller Fura 380 nm belysning före (D) och under nervsystemets aktivering (E, här med ATP). (F) Neuronal livskraft utvärderas med perfusion av ATP (125 M). Här är chemostimulation görs med urin (urin, 1:100) eller med en blandning av mus feromoner (blandning ph., 10 -6 m) vid ett konstant flöde av 165 ml / h. Intracellulära kalciumnivåer (ΔF) kan spelas in individuellt för varje cell (cell 1 till 3). (G) En V1Rb2 neuron visualiseras i GFP belysning (1). (H) lastning av denna neuron (1) samt en icke-V1rb2 uttrycka neuron (2) visas. (I) V1rb2 neuron kan svara på 2-heptanone med en intracellulär kalcium ökar. Detta särskilt icke-V1rb2 uttrycka neuron också ett svar på 2-heptanone (cell 2). Skala barer är: CE, 20 m, GH,15 ìm, ΔF = 340 nm / 380 nm. (F och I) Varaktighet av stimulans ansökan anges med staplar under varje spår. Den godtyckliga Färgskalan representerar fluorescensintensiteten.

<ol>
	<li>Karlson, P., L&#252;scher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Pheromones"+a+new+term+for+a+class+of+biologically+active+substances.">"Pheromones" a new term for a class of biologically active substances.</a> Nature. 183, 55-56 (1959).</li><li>Cavaggioni, A., Mucignat-Caretta, C., Redaelli, M., Zagotto, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+scent+of+urine+spots+of+male+mice,+Mus+musculus:+Changes+in+chemical+composition+over+time.">The scent of urine spots of male mice, Mus musculus: Changes in chemical composition over time.</a> Rapid Commun. Mass Spectrom. 20, 3741-3746 (2006).</li><li>Novotny, M., Harvey, S., Jemiolo, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry+of+male+dominance+in+the+house+mouse,+Mus+domesticus.">Chemistry of male dominance in the house mouse, Mus domesticus.</a> Experientia. 46, 109-113 (1990).</li><li>Leinders-Zufall, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+pheromone+detection+by+mammalian+vomeronasal+neurons.">Ultrasensitive pheromone detection by mammalian vomeronasal neurons.</a> Nature. 405, 792-796 (2000).</li><li>Leinders-Zufall, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MHC+class+I+peptides+as+chemosensory+signals+in+the+vomeronasal+organ.">MHC class I peptides as chemosensory signals in the vomeronasal organ.</a> Science. 306, 1033-1037 (2004).</li><li>Leinders-Zufall, T., Ishii, T., Mombaerts, P., Zufall, F., Boehm, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+requirements+for+the+activation+of+vomeronasal+sensory+neurons+by+MHC+peptides.">Structural requirements for the activation of vomeronasal sensory neurons by MHC peptides.</a> Nat. Neurosci. 12, 1551-1558 (2009).</li><li>Jemiolo, B., Xie, T. M., Novotny, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Socio-sexual+olfactory+preference+in+female+mice:+attractiveness+of+synthetic+chemosignals.">Socio-sexual olfactory preference in female mice: attractiveness of synthetic chemosignals.</a> Physiol. Behav. 50, 1119-1122 (1991).</li><li>Achiraman, S., Archunan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+urinary+volatiles+in+Swiss+male+mice+(Mus+musculus):+bioassay+of+identified+compounds.">Characterization of urinary volatiles in Swiss male mice (Mus musculus): bioassay of identified compounds.</a> J. Biosci. 27, 679-686 (2002).</li><li>Dulac, C., Torello, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+detection+of+pheromone+signals+in+mammals:+from+genes+to+behaviour.">Molecular detection of pheromone signals in mammals: from genes to behaviour.</a> Nat. Rev. Neurosci. 4, 551-562 (2003).</li><li>Brennan, P. A., Zufall, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pheromonal+communication+in+vertebrates.">Pheromonal communication in vertebrates.</a> Nature. 444, 308-315 (2006).</li><li>Mondor, E. B., Roitberg, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inclusive+fitness+benefits+of+scent-marking+predators.">Inclusive fitness benefits of scent-marking predators.</a> Proc. Biol. Sci. 271, 341-343 (2004).</li><li>Holy, T. E., Dulac, C., Meister, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+of+vomeronasal+neurons+to+natural+stimuli.">Responses of vomeronasal neurons to natural stimuli.</a> Science. 289, 1569-1572 (2000).</li><li>Keverne, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Vomeronasal+Organ.">The Vomeronasal Organ.</a> Science. 286, 716-720 (1999).</li><li>Weiler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+development+of+the+rat+vomeronasal+organ.">Postnatal development of the rat vomeronasal organ.</a> Chem. Senses. 30, 127-128 (2005).</li><li>Zufall, F., Kelliher, K. R., Leinders-Zufall, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pheromone+detection+by+mammalian+vomeronasal+neurons.">Pheromone detection by mammalian vomeronasal neurons.</a> Microsc. Res. Tech. 58, 251-260 (2002).</li><li>Ciges, M., Labella, T., Gayoso, M., Sanchez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructure+of+the+organ+of+Jacobson+and+comparative+study+with+olfactory+mucosa.">Ultrastructure of the organ of Jacobson and comparative study with olfactory mucosa.</a> Acta. Otolaryngol. 83, 47-58 (1977).</li><li>Munger, S. D., Leinders-Zufall, T., Zufall, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subsystem+organization+of+the+mammalian+sense+of+smell.">Subsystem organization of the mammalian sense of smell.</a> Annu. Rev. Physiol. 71, 115-140 (2009).</li><li>Mombaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+and+ligands+for+odorant,+vomeronasal+and+taste+receptors.">Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors.</a> Nat. Rev. Neurosci. 5, 263-278 (2004).</li><li>Ryba, N. J. P., Tirindelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+multigene+family+of+putative+pheromone+receptors.">A new multigene family of putative pheromone receptors.</a> Cell. 19, 371-379 (1997).</li><li>Matsunami, H., Buck, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multigene+family+encoding+a+diverse+array+of+putative+pheromone+receptors+in+mammals.">A multigene family encoding a diverse array of putative pheromone receptors in mammals.</a> Cell. 90, 775-784 (1997).</li><li>Herrada, G., Dulac, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+family+of+putative+pheromone+receptors+in+mammals+with+a+topographycally+organized+and+sexually+dimorphic+distribution.">A novel family of putative pheromone receptors in mammals with a topographycally organized and sexually dimorphic distribution.</a> Cell. 90, 763-773 (1997).</li><li>Dulac, C., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+family+of+genes+encoding+putative+pheromone+receptors+in+mammals.">A novel family of genes encoding putative pheromone receptors in mammals.</a> Cell. 83, 195-206 (1995).</li><li>Young, J. M., Massa, H. F., Hsu, L., Trask, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extreme+variability+among+mammalian+V1R+gene+families.">Extreme variability among mammalian V1R gene families.</a> Genome. Res. 20, 10-18 (2009).</li><li>Yang, H., Shi, P., Zhang, Y. P., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composition+and+evolution+of+the+V2r+vomeronasal+receptor+gene+repertoire+in+mice+and+rats.">Composition and evolution of the V2r vomeronasal receptor gene repertoire in mice and rats.</a> Genomics. 86, 306-315 (2005).</li><li>Levai, O., Feistel, T., Breer, H., Strotmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+in+the+vomeronasal+organ+express+odorant+receptors+but+project+to+the+accessory+olfactory+bulb.">Cells in the vomeronasal organ express odorant receptors but project to the accessory olfactory bulb.</a> J. Comp. Neurol. 498, 476-490 (2006).</li><li>Riviere, S., Challet, L., Fluegge, D., Spehr, M., Rodriguez, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formyl+peptide+receptor-like+proteins+are+a+novel+family+of+vomeronasal+chemosensors.">Formyl peptide receptor-like proteins are a novel family of vomeronasal chemosensors.</a> Nature. 459, 574-577 (2009).</li><li>Liberles, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formyl+peptide+receptors+are+candidate+chemosensory+receptors+in+the+vomeronasal+organ.">Formyl peptide receptors are candidate chemosensory receptors in the vomeronasal organ.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 9842-9847 (2009).</li><li>Liman, E. R., Corey, D. P., Dulac, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRP2:+A+candidate+transduction+channel+for+mammalian+pheromone+sensory+signaling.">TRP2: A candidate transduction channel for mammalian pheromone sensory signaling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 5791-5796 (1999).</li><li>Kelliher, K. R., Spehr, M., Li, X. H., Zufall, F., Leinders-Zufall, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pheromonal+recognition+memory+induced+by+TRPC2-independent+vomeronasal+sensing.">Pheromonal recognition memory induced by TRPC2-independent vomeronasal sensing.</a> Eur. J. Neurosci. 23, 3385-3390 (2006).</li><li>Rodriguez, I., Feinstein, P., Mombaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variable+patterns+of+axonal+projections+of+sensory+neurons+in+the+mouse+vomeronasal+system.">Variable patterns of axonal projections of sensory neurons in the mouse vomeronasal system.</a> Cell. 97, 199-208 (1999).</li><li>Boschat, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pheromone+detection+mediated+by+a+V1r+vomeronasal+receptor.">Pheromone detection mediated by a V1r vomeronasal receptor.</a> Nature. Neuroscience. 5, 1261-1262 (2002).</li><li>Brechbühl, J., Klaey, M., Broillet, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grueneberg+ganglion+cells+mediate+alarm+pheromone+detection+in+mice.">Grueneberg ganglion cells mediate alarm pheromone detection in mice.</a> Science. 321, 1092-1095 (2008).</li></ol>

Inga intressekonflikter deklareras.

Även kalcium avbildande metod som presenteras här gör det möjligt att spela in, i en akut skiva förberedelserna, pheromonal svaren från mus VNO nervceller. Med detta synsätt är dissektion från djur till vomeronasala nervceller, med lite övning, lätt genomförbara och ger en lång levande vävnad förberedelse. Det låter tidskrävande experiment liknande farmakologiska undersökningar eller studier av pheromonal kodning. Med denna fysiologiska teknik kan stora populationer samt exakt neuronala subpopulationer analyseras specifikt. Dessutom kan denna metod enkelt anpassas till immunhistokemiska metoder eller experiment baserade på andra kalcium färgämnen. Användningen av dessa kombinerade metoder kommer säkert att kunna identifiera nya pheromonal ligander för de många föräldralösa chemoreceptors uttrycks i musen vomeronasala orgel.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagensets namn </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> Adenosin 5&#39;-trifosfat dinatriumsalt lösning (ATP) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A6559-25UMO </td><td></td></tr><tr><td> Agar </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A7002-100G </td><td> Företrädesvis för immunohistokemi </td></tr><tr><td> Agar (lågsmältande) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A0701-25G </td><td> Företrädesvis för kalcium avbildning </td></tr><tr><td> CL-100 Bipolär temperaturregulator </td><td> Warner Instrument </td><td> W64-0352 </td><td></td></tr><tr><td> Konfokalmikroskop </td><td> Leica Microsystems </td><td> SP5 AOBS </td><td></td></tr><tr><td> Cy5-AffiniPure get anti-mus IgG </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> 115-175-071 </td><td> Skyddas från ljus </td></tr><tr><td> DMSO (dimetylsulfoxid) </td><td> Merck </td><td> 317.275-100ml </td><td></td></tr><tr><td> Bädda formar, Peel-A-Way </td><td> Polysciences </td><td> 18646A-1 </td><td> 22 x 22 x 20 mm </td></tr><tr><td> Fluorescerande montering media (Vectashield med DAPI, 10 ml) </td><td> Rectolab </td><td> H-1200 </td><td></td></tr><tr><td> Fura-2:00 </td><td> Teflabs </td><td> 0103 </td><td> Skyddas från ljus </td></tr><tr><td> Glisseal N (vakuum fett, 60 g) </td><td> Borr Chemie </td><td> Glisseal N </td><td></td></tr><tr><td> Stort badkar inspelning kammare (RC-26G) </td><td> Warner Instrument </td><td> 64-0235 </td><td></td></tr><tr><td> MetaFluor (programvara för kalcium bildbehandling; v.7.6.5.0) </td><td> Visitron Systems </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Monoklonala anti-tubulin, acetylated mus antikropp </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T6793-.2ML </td><td></td></tr><tr><td> Normal get serum (NGS, 10 ml) </td><td> Interchim </td><td> UP379030 </td><td></td></tr><tr><td> Plattform för kammare (P-1) </td><td> Warner Instrument </td><td> 64-0277 </td><td></td></tr><tr><td> Pluronic F-127, 2 g </td><td> Invitrogen </td><td> P-6867 </td><td></td></tr><tr><td> Roti Coll (dosering flaska, 10 g) </td><td> Carl Roth </td><td> 0.258,1 </td><td></td></tr><tr><td> SC-20 Dual In-line lösning värmare / kylare </td><td> Warner Instrument </td><td> W64-0353 </td><td></td></tr><tr><td> Slice ankare (SHD-26GKIT) </td><td> Warner Instrument </td><td> 64-0266 </td><td></td></tr><tr><td> Stereofluorescence mikroskop </td><td> Leica Microsystems </td><td> MZ16FA </td><td></td></tr><tr><td> Super PAP PEN (hydrofobapenna) </td><td> Pelco International </td><td> 22.309 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Fluka </td><td> 93.420-250ml </td><td></td></tr><tr><td> Vibrerande blad mikrotom VT 1200 </td><td> Leica Microsystems </td><td> 14048142066 </td><td></td></tr><tr><td> VisiChrome hög hastighet polychromator systemet </td><td> Visitron Systems </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 3D Data Visualization (Imaris; v.6.3.1) </td><td> Bitplane Scientific Software </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

imaging pheromone sensing in a mouse vomeronasal acute tissue slice preparation

Peter Karlson och Martin Lüscher använde termen feromon för första gången år 1959 en för att beskriva kemikalier som används för inom arten kommunikation. Feromoner är flyktiga eller icke-flyktiga kortlivade molekyler 2 utsöndras och / eller i biologiska vätskor 3,4, till exempel urin, en vätska känd för att vara en viktig källa till feromoner 3. Pheromonal kommunikation är inblandad i en rad viktiga djur modaliteter som anhörig interaktioner 5,6, hierarkiska organisationer 3 och sexuella interaktioner 7,8 och är därmed direkt korrelerade med överlevnaden för en viss art 9,10,11. Hos möss är förmågan att detektera feromoner medieras huvudsakligen av vomeronasala orgel (VNO) 10,12, en kopplad struktur ligger vid foten av näshålan och inneslutna i ett brosk kapsel. Varje VNO har en tubulär form med en lumen 13,14 gör att kontakten med externakemiska världen. Den sensoriska neuroepithelium är främst består av vomeronasala bipolär sensoriska neuron (VSNs) 15. Varje VSN sträcker sig en enda Dendrite till lumen som slutar i en stor dendritiska ratten med upp till 100 mikrovilli inblandade i kemiska upptäckt 16. Många subpopulationer av VSNs är närvarande. De är differentierade genom chemoreceptor de uttrycker och därmed eventuellt av ligand (s) de känner igen 17,18. Två huvudsakliga vomeronasala receptorn familjer V1Rs och V2Rs 19,20,21,22, består av respektive 240 23 och 120 24 medlemmar och uttrycks i separata lager av neuroepithelium. Luktreceptorer (ORS) 25 och formyl receptorer peptid (FPRs) är 26,27 uttrycks också i VSNs. Huruvida dessa neuronala delpopulationer använder samma nedströms signalväg för avkänning feromoner är okänd. Trots en viktig roll som spelas av ett kalcium-permeabla kanal (TRPC2) finns i mikrovilli av mogna nervceller 28 TRPC2 oberoende transduktion kanaler har föreslagits 6,29. På grund av det stora antalet neuronala delpopulationer och den säregna morfologi orgeln, farmakologiska och fysiologiska undersökningar av signalering element som finns i VNO är komplexa. Här presenterar vi ett akut förberedelse vävnad bit av musen VNO som gör utredningar kalcium avbildning. Denna fysiologiska tillvägagångssätt gör iakttagelser i naturen av en levande vävnad, allmänna eller enskilda delpopulationer av VSNs tidigare laddade med Fura-2:00, en kalcium färgämne. Denna metod är också bra för att studera eventuella GFP-märkta feromon receptorn och är anpassningsbar för användning av andra fluorescerande kalcium sonder. Som ett exempel använder vi här ett VG mus linje 30, som översättningen av feromon V1rb2 receptorn är kopplad till ett uttryck av GFP genom en polycistronic strategi. </p&gt;

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Pheromone Sensing in a Mouse Vomeronasal Acute Tissue Slice Preparation at JoVE.com

Imaging Pheromone Sensing in a Mouse Vomeronasal Acute Tissue Slice Preparation

Hos möss är förmågan att detektera feromoner medieras huvudsakligen av vomeronasala orgel (VNO). Här är en akut vävnad bit förbereda VNO för att utföra kalcium avbildning beskrivs. Denna fysiologiska tillvägagångssätt gör det möjligt observationer av delpopulationer och / eller enskilda nervceller i en levande vävnad och är bekvämt för receptor-ligand identifiering.

Imaging Pheromone Sensing i en mus vomeronasala Akut Tissue Slice Förberedelser

Peter Karlson and Martin L&uuml;scher used the term pheromone for the first time in 19591 to describe chemicals used for intra-species communication. ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Multielectrode Array Recordings of the Vomeronasal Epithelium

Multielectrode Array inspelningar av vomeronasala Epitel

Understanding neural circuits requires methods to record from many neurons simultaneously. For in vitro studies, one currently available technology is ...

Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Kronisk Imaging av Mouse syncentrum Använda en uttunnade skallen Förberedelser

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The ...

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Patch Clamp Inspelningar från mus näthinnan nervceller i en anpassad Dark-Slice Förberedelser

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Slice Preparation, Organotypic Tissue Culturing and Luciferase Recording of Clock Gene Activity in the Suprachiasmatic Nucleus

Skiva Förberedelse, Organotypic Tissue odling och luciferas Inspelningen av Clock geners aktivitet i suprachiasmatiska Nucleus

A central circadian (~24 hr) clock coordinating daily rhythms in physiology and behavior resides in the suprachiasmatic nucleus (SCN) located in the ...

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

Flera-mus neuroanatomiska Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Imaging Neuronal Responses in Slice Preparations of Vomeronasal Organ Expressing a Genetically Encoded Calcium Sensor

Imaging Neuronal svar i Slice Beredningar av vomeronasala Orgel uttrycker en genetiskt kodade Kalcium Sensor

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within ...

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

Tissue Upprättande och immunfärgning av Mouse känselnervtrådar Innervating Hud och Limb Bones

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in ...

Preparation of Acute Subventricular Zone Slices for Calcium Imaging

Beredning av akut subventrikulära zonen Skivor för kalcium Imaging

The subventricular zone (SVZ) is one of the two neurogenic zones in the postnatal brain. The SVZ contains densely packed cells, including neural ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

Ex vivo Beredningar av den Intakt vomeronasala orgel och tillbehör luktbulben

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Slice It Hot: Acute Adult Brain Slicing in Physiological Temperature

Slice It Hot: Akut vuxna hjärnan Skivning i fysiologisk temperatur

Here we present a protocol for preparation of acute brain slices. This procedure is a critical element for electrophysiological patch-clamp experiments ...