Name: imaging pheromone sensing in a mouse vomeronasal acute tissue slice preparation
Uploaded: 2011-12-06T12:00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Pheromone Sensing in a Mouse Vomeronasal Acute Tissue Slice Preparation at JoVE.com

Biz özellikle Monique Nenniger onun mükemmel teknik destek için Tosato yanı sıra Jean-Yves Chatton yaptığı bilimsel tavsiye ve mikroskop ekipman için UNIL görüntüleme CIF platformu için teşekkür etmek istiyorum. Finansman, İsviçre Ulusal Bilim Vakfı tarafından sağlanmıştır.

1. Fare VNO diseksiyonu <ol><li> Erişkin farelerde kullanın. Feromon algılama multimodalities karışmış olduğundan, dikkatli suşlar genotipleri, cinsiyet ve yaş arasındaki ayrım önemlidir ve sonuçları etkileyecek. Burada, daha önce bir feromon-reseptör çift (2-heptanon-V1rb2) 31 (Şekil 1A) belirlenmesi için kullanılan yetişkin VG fareler 30 seçin. </li><li> NaCl 118 mM, NaHCO 3 25 mM, 10 mM D-Glikoz, KCl 2 mM, MgCl 2 2 mM, NaH 2 PO 4 1.2 mM CaCl 2, 2; diseksiyonu başlamadan önce, (ACSF taze soğuk yapay beyin-omurilik sıvısı hazırlamak mM; oxycarbon (% 95 O 2 ile doymuş pH 7.4):% 5 CO 2). Bunun için, CaCl 2 hariç tüm ACSF bileşenleri karıştırın. Doymuş ile doğrudan oxycarbon köpürme tarafından çözüm. Sonunda, CaCl 2 2 0 GKD ile istenilen hacim ayarlayabilirsiniz. U kadar buz üzerinde ACSF çözümü tutunse. </li><li> Fare Ötenazi tercihen deney hemen önce servikal dislokasyon veya CO 2 inhalasyon yoluyla yapılmalıdır. </li><li> Farenin kafasını kesin. Sürekli oxycarbonated soğuk ACSF bir diseksiyon mikroskobu altında yerleştirin. </li><li> Kesme alt çene ve damak (Şekil 1B) görselleştirmek için baş pozisyonu. </li><li> Mikro makas ile damağın üst kısmına (Şekil 1B) yatay bir kesi yapın ve mikro diseksiyon forseps ile damak membran kaldırmak. Hidrat ve ACSF (Şekil 1C) maruz boşluğuna temiz. </li><li> Üst Kes ve alt kısmında nazal septum (Şekil 1C). İncelikli VNO içeren burun septum özü ve buz (Şekil 1D) ACSF doğrudan yerleştirin. </li><li> Dikey mikro diseksiyon forseps kullanarak VNO iki parça ayırın ve ince VNO kıkırdak kapsül (kaldırmakŞekil 1E). Tüm kıkırdak parçalarını temizlendiğinden emin olun. </li></ol> 2. VNO doku dilim hazırlık Bu bölümde 2) açıklanan VNO doku dilim hazırlık ağırlıklı olarak kalsiyum görüntüleme araştırmalar için. VNO dilimleri de doku yapısal bütünlüğünü doğrulamak için protokol (Bölüm 3 e bakınız)) kayan dilimleri immunohistostainings için kullanılabilir. <ol><li> Düşük erime agar (standart PBS içinde% 3) ve çalışma ortamı hazırlayın. Kalıpları gömme ACSF, mikrotom ve destekler, mikro diseksiyon forseps gerekecektir (22 x 22 x 20 mm), hassas mendil, fırça, doku kültürü tabak, cyanacrylat tutkal, buz ve bir termometre. </li><li> % 3 düşük erime agar ile gömme kalıp doldurun. Sıcaklık 41 daha yüksek olduğunu emin olun ° C dikey koronal dilim elde edebilmek için kısa bir süre sildi VNO (Şekil 2A) yerleştirmeden önce. </li><li> Buz üzerinde gömme kalıp yerleştirin.katılaşma kadar sonra 1 dakika için agar blok ayrı. Agar bloğu bir piramit şeklinde kesin ve mikrotom destek (Şekil 2B) yapıştırıcı ile yerleştirin. </li><li> 0,5 mm / s, 0,7 mm genlik ve soğuk ACSF 100 mikron kalınlığında bir hız ile, mikrotom ile koronal VNO dilim kesin ve soğuk ile dolu bir doku kültürü plaka yerleştirmeden önce bir fırça ile doku dilimleri toplamak ACSF. </li><li> Eğer dilim GFP gibi endojen floresan (gen-hedefli nöron) içeren bir floresan stereomikroskopta (Şekil 2C) altında seçebilirsiniz. </li></ol> 3. VNO kayan dilimleri üzerinde İmmünohistokimya Bu prosedürün amacı, bölüm 2 elde VNO doku dilim) bütünlüğünü doğrulamak için. Asetillendirilmiş-tubulin VNO duyusal nöronların dendrit ve mikrovilluslar ifade mikrotübül / hücre iskeletinin işaretleyici. Kalsiyum görüntüleme deneyleri için, Direc gitmektly için protokol bölüm 4). Kayan VNO dilimleri immunohistostaining yöntem ilgi herhangi bir protein ifade değerlendirme adapte edilebilir. Bu amaçla, biz 4 1s VNO düzeltmek olduğunu ° C (PBS, pH 7.6 paraformaldehid,% 4), sabitleştirici bir çözüm noktası sonra 1.7) protokol ve kullanımı bu noktada PBS pH 7.6 &#39;daki yerine tavsiye ACSF çözüm. <ol><li> Doku kültürü plakası, sabitleştirici bir çözüm ilgi dilimleri (PBS, pH 7.6 paraformaldehid,% 4) 4 1s ° C düzeltmek </li><li> % 0,5 NGS (serum normal keçi)% 10 ve triton X-100 içeren bir PBS solüsyonunda 4 geceleme doku dilimleri ° C Blok. </li><li> 16h için oda sıcaklığında (RT)% 0.25 NGS% 5 ve Triton X-100 içeren bir PBS çözüm dilim primer antikor ile inkübe (anti-asetillenmiş-tubulin, Fare, 1:2000). </li><li> NGS% 2 içeren PBS çözeltisi ile 5 dakika boyunca 3 kere yıkayın. </li><li> Seco ile karanlıkta inkübeRT 1s için NGS% 2 içeren PBS çözüm ndary antikor (Cy5-konjuge keçi anti-Fare, 1:200). </li><li> NGS içeren PBS% 2 ile 5 dakika boyunca 3 kez yıkayın, PBS,% 1 ve sadece PBS NGS. </li><li> Floresan montaj medya (DAPI içeren ya da değil), hidrofobik ayrılmış bölgeleri (hidrofobik bir kalem kullanın) merkezine yerleştirerek dilim Dağı ve lamelleri ile dilimlerini kapsayacak. </li><li> Konfokal mikroskopi ve 3D rekonstrüksiyonlar (Şekil 2D-F) sağlayan bir yazılım ile gözlem ve satın almalar olun. </li></ol> 4. VNO dilimleri Kalsiyum görüntüleme <ol><li> Aşağıdaki prosedürler karanlıkta yer alacaktır. 37 1s inkübe VNO dilim ° C ve soğuk ACSF Fura-02:00 (7 mcM DMSO 1 mM stok solüsyonu) ile oluşan bir yükleme çözümü pluronic% 0.1 (w / v% 20 oranında GKD 2 stok solüsyonu Ç). </li><li> Kullanana kadar oxycarbonation buz üzerinde yüklü dilim tutun. Yüklü dilimler için tutulabilir3-4h. </li><li> ACSF içeren bir perfüzyon odasında bir fırça ile yüklenen dilimleri yerleştirin ve bir doku dilim çapa (Şekil 3A) ile dilimleri korumak. </li><li> Bir kalsiyum görüntüleme mikroskobu (Şekil 3B) sahnede perfüzyon odasına yerleştirin ve sürekli RT oxycarbonated ACSF serpmek. Sıcaklık, iki kutuplu bir sıcaklık kontrolörü ile adapte edilebilir. </li><li> 25x veya 63x objektif ve CooL SNAP-HD kamera ile yüklü VNO dilimleri (Şekil 3C-E) Gözlemler, ters bir floresan mikroskop ile yapılır. Işık (340/380 nm) bir Polikromatör alet ile sırayla yapılır ve 5Hz bir oranda kaydedildi. Filtreli emisyonu 510 nm dalga boyunda yapılır. Hücre içi kalsiyum oranı değişiklikleri (mesafe kadar taşınmış = 340 nm/380 nm) uygun bir yazılım ile izlenmektedir. </li><li> Chemostimulation kendi deney amacına göre seçilmelidir. Burada, ACSF bir perfüzyonları içeren bir feromon mix (isobutylamine, 2 heptanon, 4 heptanon, 2 heptanol, pentylacetate, dimethylpyrazine, α / β-farnesen, 10 -6 M), 2-heptanon (10 -6 M) ya da taze (erkek ve dişi 1 toplanır : 1) fare idrar (1:100) 32 yapılmaktadır. ATP (125 mcM) Perfüzyon deneyler sonunda canlılığı testi olarak kullanılır (Şekil 3F) ve yaklaşık% 80 canlı nöronların oranı belirtmelidir. Bu koşullar altında, dilim 2 saat kadar kullanılmış olabilir. </li><li> Duyu nöronlarının GFP etiketli alt popülasyonlar özel aydınlatma (burada V1rb2 ifade nöronlar) ile görünür (Şekil 3G) tam olarak analiz edilebilir. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar: Çok transdüksiyon fare VNO yer alarak, ya da yeni feromon-reseptör çiftleri tespit etmek yolaklar araştırmak için fonksiyonel bir tahlil kurmak için, biz VG fare hattı (Şekil 1A yararlanmak </strong&gt;). Bu doğrultuda, 240 V1Rs reseptörlerin biri, V1Rb2 reseptör vomeronasal duyusal nöronlar belirli bir ICSI&#39;nin kolay görsellik sağlayan GFP etiketlenir. VNO (Şekil 1E) çıkarılması ve diseksiyon sonra, akut VNO dilimleri (Şekil 2C) hazırlar. Biz asetillenmiş tubulin protein (Şekil 2D-F) karşı immunohistostainings gerçekleştirerek hazırlık dokusal bütünlüğünü kontrol etmek ve doğrulamak için, bunların bir kısmını düzeltin. Dilim diğer fraksiyon, kalsiyum görüntüleme deneyleri için kullanılır. Bunun için, dilimler Fura-02:00 (Şekil 3C-E) ile yüklenir ve her bir nöronun hücre içi kalsiyum düzeyi bir mesafe kadar taşınmış oranı (Şekil 3F) olarak izlenir. Nöronların Canlılık mesafe kadar taşınmış oranının hızlı ve geçici bir artış beklenmektedir (Şekil 3F) sonra ATP (125 mcM), perfüzyon tarafından değerlendirilir . Feromonlar önemli bir kaynak olan idrar, taze perfüzyonly toplanan fare idrar (1:100) endojen bir kontrol olarak kullanılır. Bu kaydedilen nöron (hücre 1 ve 2, Şekil 3F) yaklaşık% 50 kalsiyum transientler tetikler. GFP aydınlatma altında, V1Rb2 pozitif nöron gözlemlenebilir ve bilinen pheromonal ligand, 2-heptanon, perfüzyon hücresel aktivasyonu (hücre 1, Şekil. 3I) başlatır. İlginçtir, nöronal aktivasyonlar VNO kodlama feromon karmaşıklığını gösteren V1Rb2 reseptör (GFP negatif nöronlar) (hücre 2, Şekil. 3I) ifade yoktur nöronların bir kısmı da gözlemlenebilir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3311/3311fig1.jpg" /> Şekil 1 fare vomeronasal organ Diseksiyon. (A), VG çizgi fare. (B), fare ötanazi sonra, damak görselleştirmek için tam bir baş binoküler mikroskop altında yerleştirilir ve alt çene kaldırılır. Küçük yatay bir kesi yapılır(Siyah kesikli çizgi). (C) çıkarıldıktan sonra damak, nazal septum VNO ile kaplı üst kesilir ve alt kısmı (beyaz kesik çizgiler) VNO ekstraksiyonu kolaylaştırmak için. (D) VNO ACSF çözüm konumlandırılmış ve (ekleyin: iki parça daha yüksek güç görünümü) ayrılmış. (E) VNO kıkırdak kapsül incelikle kaldırılır ve kıkırdak kapsül olmadan VNO deneyler geri kalanı için kullanılır. Ölçek barlar: BE, 1 mm. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3311/3311fig2.jpg" /> Şekil 2: Fare vomeronasal akut dilim hazırlanması ve dokusal bütünlüğü. (A) fare VNO dikey bir agar% 3 çözüm yerleştirilmiştir. Agar sıcaklığı 41 ° C&#39;den daha düşük olmalı (B) agar bloğu bir piramit şeklinde kesilir ve 100 mikron VNO bölümler (siyah kesikli çizgi) ACSF oluşturulur. (C) VNO dilimleri belirli bir görselleştirmek için bir floresan stereomikroskopta altında seçilebilirEtiketli duyusal nöronlar nüfus. (DF) Dokusal bütünlüğünü asetillenmiş-tubulin protein, hazırlık mükemmel bir koruma gösteren V1rb2 gen hedefli nöronlar yüksek bir güç görünümü karşı immunohistostainings değerlendirilebilir. Uzun dendritler lümen (E) yanı sıra, dendritik topuzlar ve mikrovilluslar yapısal protein ifadesi yüzeyine ulaşan Nöronlar (F) görülebilir. Ölçek barlar şunlardır: B, 5 mm, C, 60 mm D 40 mm, EF, 20 mikron. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3311/3311fig3.jpg" /> Şekil 3. Kalsiyum görüntüleme ve vomeronasal akut doku dilimleri feromon algılama. (A) Fura-02:00 yükleme aşamasından sonra, perfüzyon odasında VNO dilimleri yerleştirilir ve uyarlanmış bir çapa (yüksek güç görünümü) ile korunur. (B) deneyler karanlık ve VNO dilim yapılmaktadır ACSF sürekli bir vakum sistemi ile RT ile perfüze. Sıcaklık chos olabiliriki kutuplu bir Pelletier elemanı ve bir termal prob ile oluşan bir sıcaklık kontrol sistemi kullanarak tr. Bu özel deney RT yapıldı. (CE) (D) ve nöronal aktivasyon (E, burada ATP) sırasında VNO dilimleri önce Hoffman, faz kontrast (C, Hv) veya Fura 380 nm aydınlatma altında gözlemlenebilir. (F) nöronal canlılığı ATP (125 mcM) perfüzyon ile değerlendirilir. Burada chemostimulation idrar (idrar, 1:100) veya 165 ml / saat sabit bir akış hızında bir fare feromonlar karışımı (mix ph, 10 -6 M) ile yapılır Hücre içi kalsiyum düzeyleri (mesafe kadar taşınmış) (Hücre 1 - 3) her hücre için ayrı ayrı kaydedilebilir. (G) A V1Rb2 nöron GFP aydınlatma (1) altında görüntülenmiştir. (H) bu nöron (1) yanı sıra dışı bir V1rb2 ifade nöron (2) yükleme gösterilmiştir. (I) V1rb2 nöron, bir hücre içi kalsiyum artışı ile 2-heptanon cevap verebilmek. Bu özel olmayan V1rb2 ifade nöron da 2-heptanon (hücre 2) cevap verir. Ölçek barlar: CE, 20 mikron, GH,15 mm mesafe kadar taşınmış = 340 nm / 380 nm. (F ve I) uyaran uygulama süresi her iz küçük çubuklarla gösterilir. Rasgele bir renk skalası floresans şiddeti temsil eder.

<ol>
	<li>Karlson, P., L&#252;scher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Pheromones"+a+new+term+for+a+class+of+biologically+active+substances.">"Pheromones" a new term for a class of biologically active substances.</a> Nature. 183, 55-56 (1959).</li><li>Cavaggioni, A., Mucignat-Caretta, C., Redaelli, M., Zagotto, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+scent+of+urine+spots+of+male+mice,+Mus+musculus:+Changes+in+chemical+composition+over+time.">The scent of urine spots of male mice, Mus musculus: Changes in chemical composition over time.</a> Rapid Commun. Mass Spectrom. 20, 3741-3746 (2006).</li><li>Novotny, M., Harvey, S., Jemiolo, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry+of+male+dominance+in+the+house+mouse,+Mus+domesticus.">Chemistry of male dominance in the house mouse, Mus domesticus.</a> Experientia. 46, 109-113 (1990).</li><li>Leinders-Zufall, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+pheromone+detection+by+mammalian+vomeronasal+neurons.">Ultrasensitive pheromone detection by mammalian vomeronasal neurons.</a> Nature. 405, 792-796 (2000).</li><li>Leinders-Zufall, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MHC+class+I+peptides+as+chemosensory+signals+in+the+vomeronasal+organ.">MHC class I peptides as chemosensory signals in the vomeronasal organ.</a> Science. 306, 1033-1037 (2004).</li><li>Leinders-Zufall, T., Ishii, T., Mombaerts, P., Zufall, F., Boehm, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+requirements+for+the+activation+of+vomeronasal+sensory+neurons+by+MHC+peptides.">Structural requirements for the activation of vomeronasal sensory neurons by MHC peptides.</a> Nat. Neurosci. 12, 1551-1558 (2009).</li><li>Jemiolo, B., Xie, T. M., Novotny, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Socio-sexual+olfactory+preference+in+female+mice:+attractiveness+of+synthetic+chemosignals.">Socio-sexual olfactory preference in female mice: attractiveness of synthetic chemosignals.</a> Physiol. Behav. 50, 1119-1122 (1991).</li><li>Achiraman, S., Archunan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+urinary+volatiles+in+Swiss+male+mice+(Mus+musculus):+bioassay+of+identified+compounds.">Characterization of urinary volatiles in Swiss male mice (Mus musculus): bioassay of identified compounds.</a> J. Biosci. 27, 679-686 (2002).</li><li>Dulac, C., Torello, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+detection+of+pheromone+signals+in+mammals:+from+genes+to+behaviour.">Molecular detection of pheromone signals in mammals: from genes to behaviour.</a> Nat. Rev. Neurosci. 4, 551-562 (2003).</li><li>Brennan, P. A., Zufall, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pheromonal+communication+in+vertebrates.">Pheromonal communication in vertebrates.</a> Nature. 444, 308-315 (2006).</li><li>Mondor, E. B., Roitberg, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inclusive+fitness+benefits+of+scent-marking+predators.">Inclusive fitness benefits of scent-marking predators.</a> Proc. Biol. Sci. 271, 341-343 (2004).</li><li>Holy, T. E., Dulac, C., Meister, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responses+of+vomeronasal+neurons+to+natural+stimuli.">Responses of vomeronasal neurons to natural stimuli.</a> Science. 289, 1569-1572 (2000).</li><li>Keverne, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Vomeronasal+Organ.">The Vomeronasal Organ.</a> Science. 286, 716-720 (1999).</li><li>Weiler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+development+of+the+rat+vomeronasal+organ.">Postnatal development of the rat vomeronasal organ.</a> Chem. Senses. 30, 127-128 (2005).</li><li>Zufall, F., Kelliher, K. R., Leinders-Zufall, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pheromone+detection+by+mammalian+vomeronasal+neurons.">Pheromone detection by mammalian vomeronasal neurons.</a> Microsc. Res. Tech. 58, 251-260 (2002).</li><li>Ciges, M., Labella, T., Gayoso, M., Sanchez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructure+of+the+organ+of+Jacobson+and+comparative+study+with+olfactory+mucosa.">Ultrastructure of the organ of Jacobson and comparative study with olfactory mucosa.</a> Acta. Otolaryngol. 83, 47-58 (1977).</li><li>Munger, S. D., Leinders-Zufall, T., Zufall, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subsystem+organization+of+the+mammalian+sense+of+smell.">Subsystem organization of the mammalian sense of smell.</a> Annu. Rev. Physiol. 71, 115-140 (2009).</li><li>Mombaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+and+ligands+for+odorant,+vomeronasal+and+taste+receptors.">Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors.</a> Nat. Rev. Neurosci. 5, 263-278 (2004).</li><li>Ryba, N. J. P., Tirindelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+multigene+family+of+putative+pheromone+receptors.">A new multigene family of putative pheromone receptors.</a> Cell. 19, 371-379 (1997).</li><li>Matsunami, H., Buck, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multigene+family+encoding+a+diverse+array+of+putative+pheromone+receptors+in+mammals.">A multigene family encoding a diverse array of putative pheromone receptors in mammals.</a> Cell. 90, 775-784 (1997).</li><li>Herrada, G., Dulac, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+family+of+putative+pheromone+receptors+in+mammals+with+a+topographycally+organized+and+sexually+dimorphic+distribution.">A novel family of putative pheromone receptors in mammals with a topographycally organized and sexually dimorphic distribution.</a> Cell. 90, 763-773 (1997).</li><li>Dulac, C., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+family+of+genes+encoding+putative+pheromone+receptors+in+mammals.">A novel family of genes encoding putative pheromone receptors in mammals.</a> Cell. 83, 195-206 (1995).</li><li>Young, J. M., Massa, H. F., Hsu, L., Trask, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extreme+variability+among+mammalian+V1R+gene+families.">Extreme variability among mammalian V1R gene families.</a> Genome. Res. 20, 10-18 (2009).</li><li>Yang, H., Shi, P., Zhang, Y. P., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composition+and+evolution+of+the+V2r+vomeronasal+receptor+gene+repertoire+in+mice+and+rats.">Composition and evolution of the V2r vomeronasal receptor gene repertoire in mice and rats.</a> Genomics. 86, 306-315 (2005).</li><li>Levai, O., Feistel, T., Breer, H., Strotmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+in+the+vomeronasal+organ+express+odorant+receptors+but+project+to+the+accessory+olfactory+bulb.">Cells in the vomeronasal organ express odorant receptors but project to the accessory olfactory bulb.</a> J. Comp. Neurol. 498, 476-490 (2006).</li><li>Riviere, S., Challet, L., Fluegge, D., Spehr, M., Rodriguez, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formyl+peptide+receptor-like+proteins+are+a+novel+family+of+vomeronasal+chemosensors.">Formyl peptide receptor-like proteins are a novel family of vomeronasal chemosensors.</a> Nature. 459, 574-577 (2009).</li><li>Liberles, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formyl+peptide+receptors+are+candidate+chemosensory+receptors+in+the+vomeronasal+organ.">Formyl peptide receptors are candidate chemosensory receptors in the vomeronasal organ.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 9842-9847 (2009).</li><li>Liman, E. R., Corey, D. P., Dulac, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRP2:+A+candidate+transduction+channel+for+mammalian+pheromone+sensory+signaling.">TRP2: A candidate transduction channel for mammalian pheromone sensory signaling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 5791-5796 (1999).</li><li>Kelliher, K. R., Spehr, M., Li, X. H., Zufall, F., Leinders-Zufall, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pheromonal+recognition+memory+induced+by+TRPC2-independent+vomeronasal+sensing.">Pheromonal recognition memory induced by TRPC2-independent vomeronasal sensing.</a> Eur. J. Neurosci. 23, 3385-3390 (2006).</li><li>Rodriguez, I., Feinstein, P., Mombaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variable+patterns+of+axonal+projections+of+sensory+neurons+in+the+mouse+vomeronasal+system.">Variable patterns of axonal projections of sensory neurons in the mouse vomeronasal system.</a> Cell. 97, 199-208 (1999).</li><li>Boschat, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pheromone+detection+mediated+by+a+V1r+vomeronasal+receptor.">Pheromone detection mediated by a V1r vomeronasal receptor.</a> Nature. Neuroscience. 5, 1261-1262 (2002).</li><li>Brechbühl, J., Klaey, M., Broillet, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grueneberg+ganglion+cells+mediate+alarm+pheromone+detection+in+mice.">Grueneberg ganglion cells mediate alarm pheromone detection in mice.</a> Science. 321, 1092-1095 (2008).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Burada sunulan kalsiyum görüntüleme yöntemi, akut bir dilim hazırlık, fare VNO nöronların pheromonal yanıtları kaydetmenize olanak tanır. Bu yaklaşımla, vomeronasal nöronlar hayvan diseksiyonu, bazı uygulama ile kolayca ulaşılabilir ve uzun yaşayan bir doku hazırlık sağlar. Farmakolojik pheromonal kodlama soruşturma ya da çalışma gibi zaman alıcı deneyler sağlar. Bu fizyolojik tekniği ile, büyük nüfusları kesin nöronal alt popülasyonlar yanı sıra özel olarak analiz edilebilir. Buna ek olarak, bu yöntem kolayca diğer kalsiyum boyalar dayalı immünohistokimyasal yaklaşımlar veya deneylere adapte olabilir. Bu kombine metodolojilerin kullanımı kesinlikle fare vomeronasal organ ifade edilen çok sayıda yetim kemoreseptörlerin için yeni pheromonal ligandların kimlik sağlayacaktır.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktifi Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Adenozin 5&#39;-trifosfat disodyum tuz solüsyonu (ATP) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A6559-25UMO </td><td></td></tr><tr><td> Agar </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A7002-100G </td><td> Tercihan immünohistokimya için </td></tr><tr><td> Agar (düşük erime) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A0701-25G </td><td> Tercihan kalsiyum görüntüleme için </td></tr><tr><td> CL-100 Bipolar Sıcaklık Kontrolör </td><td> Warner Aletleri </td><td> W64-0352 </td><td></td></tr><tr><td> Konfokal Mikroskop </td><td> Leica Microsystems </td><td> SP5 Kelime Size Neyi Çağrıştırıyor </td><td></td></tr><tr><td> Cy5-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> 115-175-071 </td><td> Işıktan koruyun </td></tr><tr><td> DMSO (dimetil sülfoksit) </td><td> Merck </td><td> 317.275-100ML </td><td></td></tr><tr><td> Kalıpları gömülmesi, Peel-A-Way </td><td> Polysciences </td><td> 18646A-1 </td><td> 22 x 22 x 20 mm </td></tr><tr><td> Floresan montaj medya (10 ml DAPI ile Vectashield) </td><td> Rectolab </td><td> H-1200 </td><td></td></tr><tr><td> Fura-02:00 </td><td> Teflabs </td><td> 0103 </td><td> Işıktan koruyun </td></tr><tr><td> Glisseal N (vakum gres yağı, 60 g) </td><td> Freze Chemie </td><td> Glisseal N </td><td></td></tr><tr><td> Büyük banyo kayıt odası (RC-26g) </td><td> Warner Aletleri </td><td> 64-0235 </td><td></td></tr><tr><td> MetaFluor (kalsiyum görüntüleme yazılımı; v.7.6.5.0) </td><td> Visitron Sistemleri </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Monoklonal Anti-tubulin, acetylated Fare antikor </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T6793-.2ML </td><td></td></tr><tr><td> Normal keçi serumu (NGS, 10 ml) </td><td> Interchim </td><td> UP379030 </td><td></td></tr><tr><td> Odaları için bir platform (P-1) </td><td> Warner Aletleri </td><td> 64-0277 </td><td></td></tr><tr><td> Pluronic F-127, 2 g </td><td> Invitrogen </td><td> P-6867 </td><td></td></tr><tr><td> Roti Coll (Dozaj şişe, 10 gr) </td><td> Carl Roth </td><td> 0258,1 </td><td></td></tr><tr><td> SC-20 Dual In-line Çözüm ısıtıcı / Soğutucu </td><td> Warner Aletleri </td><td> W64-0353 </td><td></td></tr><tr><td> Dilim çapa (SHD 26GKIT) </td><td> Warner Aletleri </td><td> 64-0266 </td><td></td></tr><tr><td> Stereofluorescence mikroskop </td><td> Leica Microsystems </td><td> MZ16FA </td><td></td></tr><tr><td> Süper PAP PEN (hidrofobikkalem) </td><td> Pelco Uluslararası </td><td> 22309 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Fluka </td><td> 93.420-250ML </td><td></td></tr><tr><td> Titreşimli bıçak mikrotom VT 1200S </td><td> Leica Microsystems </td><td> 14048142066 </td><td></td></tr><tr><td> VisiChrome yüksek hız Polikromatör sistemi </td><td> Visitron Sistemleri </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 3D Veri Görselleştirilmesi (Imaris; v.6.3.1) </td><td> Bitplane Bilimsel Yazılımı </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

imaging pheromone sensing in a mouse vomeronasal acute tissue slice preparation

Peter Karlson ve Martin Lüscher tür içi iletişim için kullanılan kimyasallar tanımlamak için ilk kez 1959 1 terimi feromon kullandı. Feromonlar, uçucu veya uçucu olmayan kısa ömürlü moleküllerdir 2 salgılanan ve / veya idrar, feromonlar 3 ana kaynak olduğu bilinen bir sıvı gibi biyolojik sıvılarda 3,4, içerdiği . Pheromonal iletişim kin etkileşimleri 5,6, hiyerarşik örgütler 3 ve cinsel etkileşimleri 7,8 gibi önemli hayvan yöntemlerinin çeşitli karıştığı ve dolayısıyla belirli bir türün 9,10,11 sağkalım ile doğrudan ilişkilidir. Farelerde, feromonları algılamak için yeteneği esas vomeronasal organ (VNO) 10,12, burun boşluğunun tabanında bulunan eşleştirilmiş bir yapı tarafından aracılık ve kıkırdak kapsül içine. Her VNO harici ile temas sağlayan bir lümen 13,14 ile tübüler bir şekilkimyasal dünya. Duyusal neuroepithelium esas vomeronasal bipolar duyu nöronları (VSNs) 15 oluşur. Her VSN kimyasal algılama 16 karıştığı 100 mikrovilluslar kadar taşıyan büyük bir dendritik topuzu ile biten lümen tek bir dendrit uzanır. VSNs, çok sayıda alt popülasyonlar mevcuttur. 17,18 farkındayız ligand (ler) tarafından muhtemelen bu nedenle ifade ve kemoreseptör ile ayırt edilirler. İki ana vomeronasal reseptör aileler, V1Rs ve V2Rs 19,20,21,22, 240 23 ve 120 24 üye sırasıyla oluşur ve neuroepithelium ayrı katmanlar olarak ifade edilir. Olfaktör reseptörleri (OO) 25 ve formil peptid reseptörleri (FPRs) 26,27 VSNs da ifade edilir. Bu algılama feromonlar nöronal alt popülasyonlar için olsun ya da olmasın aynı downstream sinyal yolağı bilinmemektedir. Geçirgen bir kalsiyum kanal (tarafından oynanan önemli bir rol rağmenOlgun nöronlar, 28 TRPC2 bağımsız transdüksiyon kanal mikrovilluslar TRPC2) 6,29 öne sürülmüştür . Nöronal alt popülasyonlar ve organın kendine özgü morfoloji sayısının yüksek olması nedeniyle, farmakolojik ve fizyolojik araştırmalar VNO sinyal elemanlarının karmaşıktır. Burada, kalsiyum görüntüleme incelemeler yapmak için fare VNO akut doku dilim hazırlık mevcut. Bu fizyolojik bir yaklaşım, daha önce Fura-02:00, kalsiyum boya yüklü VSNs genel veya bireysel alt popülasyonlar, doğal ortamda yaşayan bir doku, gözlem sağlar. Bu yöntem, herhangi bir GFP etiketli feromon reseptör eğitim için de uygundur ve diğer floresan kalsiyum problar kullanım için uyarlanabilir. Örnek olarak, biz burada, feromon V1rb2 reseptör çeviri GFP ifade polycistronic stratejisi ile bağlantılı olduğu VG fare hattı 30, kullanırlar . </p&gt;

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Pheromone Sensing in a Mouse Vomeronasal Acute Tissue Slice Preparation at JoVE.com

Imaging Pheromone Sensing in a Mouse Vomeronasal Acute Tissue Slice Preparation

Farelerde, feromonları algılamak için yeteneği esas vomeronasal organ (VNO) tarafından aracılık eder. Burada, kalsiyum görüntüleme yapmak için VNO akut doku dilim hazırlık açıklanmıştır. Bu fizyolojik bir yaklaşımdır alt popülasyonlar ve / veya bireysel nöronlar gözlemleri yaşayan bir doku sağlar ve reseptör-ligand tanımlanması için uygundur.

Görüntüleme Feromon Fare Vomeronasal Akut Doku Dilim Hazırlama içinde Algılama

Peter Karlson and Martin L&uuml;scher used the term pheromone for the first time in 19591 to describe chemicals used for intra-species communication. ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Multielectrode Array Recordings of the Vomeronasal Epithelium

Vomeronasal Epitel Multielectrode Dizi Kayıtlar

Understanding neural circuits requires methods to record from many neurons simultaneously. For in vitro studies, one currently available technology is ...

Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Fare Visual Cortex İnceltilen kafatası Hazırlık Kronik Görüntüleme

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The ...

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Patch Kelepçe bir Karanlık adapte Dilim Hazırlık Fare Retina Nöronlar Kayıtlar

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Slice Preparation, Organotypic Tissue Culturing and Luciferase Recording of Clock Gene Activity in the Suprachiasmatic Nucleus

Dilim hazırlanması, Organotipik Doku ekimi ve suprakiazmatik nükleus Saat Gen Faaliyet Lusiferaz Kayıt

A central circadian (~24 hr) clock coordinating daily rhythms in physiology and behavior resides in the suprachiasmatic nucleus (SCN) located in the ...

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

Çoklu-fare nöroanatomik Manyetik Rezonans Görüntüleme

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Imaging Neuronal Responses in Slice Preparations of Vomeronasal Organ Expressing a Genetically Encoded Calcium Sensor

Görüntüleme Nöronal cevaplar Vomeronasal Organ Dilim hazırlıklar Genetiği Kodlanmış Kalsiyum Sensör ifade

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within ...

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

Deri ve Kol ve bacak kemikleri innerve Fare Duyusal Sinir Lif doku hazırlanması ve immün

Detection and primary processing of physical, chemical and thermal sensory stimuli by peripheral sensory nerve fibers is key to sensory perception in ...

Preparation of Acute Subventricular Zone Slices for Calcium Imaging

Kalsiyum Görüntüleme için akut subventricular dilimi Dilimleri hazırlanması

The subventricular zone (SVZ) is one of the two neurogenic zones in the postnatal brain. The SVZ contains densely packed cells, including neural ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

Bozulmamış Vomeronasal Organ ve Aksesuar Koku Ampul Ex Vivo Hazırlıklar

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Slice It Hot: Acute Adult Brain Slicing in Physiological Temperature

Slice It Hot: Fizyolojik Sıcaklık Akut Yetişkin Beyin Dilimleme

Here we present a protocol for preparation of acute brain slices. This procedure is a critical element for electrophysiological patch-clamp experiments ...