Name: derivation of enriched oligodendrocyte cultures and oligodendrocyte/neuron myelinating co-cultures from post-natal murine tissues
Uploaded: 2011-08-21T12:00:00
Duration: 18 min 17 s
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<p class="jove_content">该项目被授予一个从加拿大多发性硬化症协会RKRWO的资助，是一个从加拿大多发性硬化症协会的助学金的获得者。特别提款权是一种多发性硬化症协会从加拿大和加拿大卫生研究院的博士后奖学金获得者。 </p>

<ol>
	<li>Avellana-Adalid, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+of+rat+oligodendrocyte+progenitors+into+proliferative+"oligospheres"+that+retain+differentiation+potential.">Expansion of rat oligodendrocyte progenitors into proliferative "oligospheres" that retain differentiation potential.</a> <em style='font-style: italic'>J Neurosci Res</em>. <b>45</b>, 558-570 (1996).</li><li>McCarthy, K. D., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue.">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> <em style='font-style: italic'>J Cell Biol</em>. <b>85</b>, 890-902 (1980).</li><li>Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death+and+control+of+cell+survival+in+the+oligodendrocyte+lineage.">Cell death and control of cell survival in the oligodendrocyte lineage.</a> <em style='font-style: italic'>Cell</em>. <b>70</b>, 31-46 (1992).</li><li>Chan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NGF+controls+axonal+receptivity+to+myelination+by+Schwann+cells+or+oligodendrocytes.">NGF controls axonal receptivity to myelination by Schwann cells or oligodendrocytes.</a> <em style='font-style: italic'>Neuron</em>. <b>43</b>, 183-1891 (2004).</li><li>Camara, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin-mediated+axoglial+interactions+initiate+myelination+in+the+central+nervous+system.">Integrin-mediated axoglial interactions initiate myelination in the central nervous system.</a> <em style='font-style: italic'>J Cell Biol</em>. <b>185</b>, 699-712 (2009).</li><li>Ishibashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+promote+myelination+in+response+to+electrical+impulses.">Astrocytes promote myelination in response to electrical impulses.</a> <em style='font-style: italic'>Neuron</em>. <b>49</b>, 823-832 (2006).</li><li>Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+rat+and+mouse+oligodendrocyte+precursor+cells.">Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells.</a> <em style='font-style: italic'>Nat Protoc</em>. <b>2</b>, 1044-1051 (2007).</li><li>Pedraza, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production,+characterization,+and+efficient+transfection+of+highly+pure+oligodendrocyte+precursor+cultures+from+mouse+embryonic+neural+progenitors.">Production, characterization, and efficient transfection of highly pure oligodendrocyte precursor cultures from mouse embryonic neural progenitors.</a> <em style='font-style: italic'>Glia</em>. <b>56</b>, 1339-1352 (2008).</li><li>Lewin, G. R., Ritter, A. M., Mendell, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+role+of+nerve+growth+factor+in+the+development+of+myelinated+nociceptors.">On the role of nerve growth factor in the development of myelinated nociceptors.</a> <em style='font-style: italic'>J Neurosci</em>. <b>12</b>, 1896-1905 (1992).</li><li>Greene, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+in+vitro+studies+on+the+nerve+growth+factor+(NGF)+requirement+of+neurons.+II.+Sensory+neurons.">Quantitative in vitro studies on the nerve growth factor (NGF) requirement of neurons. II. Sensory neurons.</a> <em style='font-style: italic'>Dev Biol</em>. <b>58</b>, 106-113 (1977).</li></ol>

<p class="jove_content">没有利益冲突的声明。 </p>

<p class="jove_content">这份报告介绍了隔离分化中的OL，丰富的文化或OL / DRGN联合培养的小鼠OPCs的一个方法。单独培养时，OPCs的分化成的MBP <sup>+已经</sup> OLS，生产髓鞘膜张。 DRGN突起病床时，OLS enwrap与MBP的DRGN突起<sup>+已经</sup>膜。这种模式的好处OL介导的神经轴突ensheathment复杂的基础调查。 </p><p class="jove_content">虽然建立这样的文化具有极大的价值，在技术上是具有挑战性的。特别是，要求方面，包括高效的组织消化/解离，维持平衡文化传媒pH值，并DRGN媒体的变化。重要的是要考虑消化的长度，组织量被消化和trituration金额影响疗效和最终结果的组织分解。这不是不寻常经验的研究人员获得从分离的神经系统组织细胞的产量低。此外，小鼠OPCs的倾向，特别是在碱性条件下，培养基的pH值的变化要敏感。文化维持在8.5％的CO <sub>2，</sub>目的是为了防止这种情况，因为OPCs的出现，以更好地容忍超过基本微酸性条件。喂养DRGNs方面，媒体的变化，必须迅速执行，不会变干的神经元，但是，一定要轻柔，以不破坏发展中国家突起床。突然媒体的变化可能撞出从基板突起的床，并有可能导致在其完整的解离盖玻片。 </p><p class="jove_content">这个模型系统的潜在好处极大地掩盖其技术要求的性质。这种系统的优点之一是产后小鼠细胞培养推导的使用，规避需要牺牲养殖女性收获胚胎组织。另一个优点是生长因子的缺乏扩大的OPCs（GFS）的要求。混合胶质文化提供了一个环境，支持OPCs的，大概是由于星形胶质细胞源性营养因子的存在传播。其他方法，如通过神经球<sup>7,8</sup>推导，依靠政府飞行服务队的有丝分裂的属性，如碱性成纤维细胞生长因子（bFGF），表皮生长因子（EGF）和血小板衍生生长因子（PDGF）为OPC扩张。同样，产后（P5 - 10）DRGNs的小鼠，避免与神经生长因子（NGF），神经<em>营养因子</em>在体外<sup>胚胎DRGNs 9，10</sup>生存所需补充的文化传媒的要求。它的利益，以避免使用神经生长因子，因为它产生负面影响的OLS myelinating能力培养DRGNs <sup>4</sup>时。避免使用GF -为辅的媒体也有经济利益，作为在大规模使用时，这些试剂成为昂贵的。 </p><p class="jove_content">或许，这种文化模式最重要的好处是它从鼠标的唯一组织的推导，从而提供机会来自各种各样的转基因小鼠线OPCs的和DRGNs。这允许DRGN和/或OPC特定的属性，执政髓鞘的研究。这将是重要的，特别是阐明受体/配体的相互作用，调节OL介导的神经轴突髓鞘。总之，这是由于神经科学的研究及其应用朝着理解的基础髓鞘的分子线索方面很有价值的技术。 </p>

<html><table border="1"><tbody><tr><td> <strong>产品名称</strong> </td><td> <strong>公司</strong> </td><td> <strong>产品编号</strong> </td></tr><tr><td>贝科改良Eagle培养基（DMEM） </td><td>多节</td><td> 319 - 005 - CL </td></tr><tr><td>汉克的平衡盐溶液（HBSS） </td><td> Invitrogen公司</td><td> 14170-112 </td></tr><tr><td>最小的重要媒体（MEM） </td><td> GIBCO公司</td><td> 12360-038 </td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS） </td><td> GIBCO公司</td><td> 10091-148 </td></tr><tr><td>青霉素，链霉素（PEN /链球菌） </td><td> GIBCO公司</td><td> 15140-122 </td></tr><tr><td> GlutaMAX </td><td> Invitrogen公司</td><td> 35050-061 </td></tr><tr><td>聚- L -赖氨酸</td><td> Sigma - Aldrich公司</td><td> P2636 </td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA） </td><td> Sigma - Aldrich公司</td><td> A4503 </td></tr><tr><td>人力merosin纯化蛋白（液氮） </td><td> Millipore公司</td><td> CC085 </td></tr><tr><td>重组大鼠睫状神经营养因子（CNTF） </td><td> PeproTech </td><td> 450-50 </td></tr><tr><td> L -甲状腺素</td><td> Biochemika </td><td> 89430 </td></tr><tr><td>全息转</td><td> Sigma - Aldrich公司</td><td> T0665 </td></tr><tr><td> B27的补充</td><td> GIBCO公司</td><td> 0080085 - SA </td></tr><tr><td>牛胰岛素</td><td> Sigma - Aldrich公司</td><td> I6634 </td></tr><tr><td> 3,3&#39;,5 -三碘- L -甲状腺素</td><td> Sigma - Aldrich公司</td><td> I6634 </td></tr><tr><td>孕酮</td><td> Sigma - Aldrich公司</td><td> P8783 </td></tr><tr><td>腐胺</td><td> Sigma - Aldrich公司</td><td> P7505 </td></tr><tr><td>亚硒酸钠</td><td> Sigma - Aldrich公司</td><td> S5261 </td></tr><tr><td> 5 - 氟-2&#39; - 脱氧尿苷（FUDR） </td><td> Sigma - Aldrich公司</td><td> F0503 </td></tr><tr><td>木瓜蛋白酶溶液</td><td>沃辛顿</td><td> LS003126 </td></tr><tr><td> DNaseI </td><td>罗氏</td><td> 1010159001 </td></tr><tr><td> L -半胱氨酸</td><td> Sigma - Aldrich公司</td><td> C7352 </td></tr><tr><td> 24孔组织培养皿</td><td>蜂星</td><td> 662-160 </td></tr><tr><td>组织培养瓶发泄第T25 - </td><td>康宁</td><td> 430639 </td></tr><tr><td> 10厘米的组织培养皿</td><td>康宁</td><td> 430167 </td></tr><tr><td> 10厘米的培养皿</td><td> Fisher Scientific则</td><td> 0875713 </td></tr><tr><td>胶原酶一个</td><td>罗氏</td><td> 103578 </td></tr><tr><td> CellTrics 50微米过滤器（可选） </td><td> PARTEC </td><td> 04-004-2327 </td></tr><tr><td>髓鞘碱性蛋白（MBP）抗体</td><td> ABD Serotec </td><td> MCA409S </td></tr><tr><td> NG2抗体</td><td> Millipore公司</td><td> AB5320 </td></tr><tr><td>髓鞘相关糖蛋白（MAG）抗体</td><td> Millipore公司</td><td> MAB1567 </td></tr><tr><td> 2&#39;，3&#39; -环核苷酸的3&#39; -磷酸二酯酶（CNP）的抗体</td><td> Covance公司</td><td> SMI - 91R - 100 </td></tr><tr><td>肌动蛋白泛AB - 5抗体</td><td>杰拉德</td><td> 10R - A106AX </td></tr><tr><td>神经丝- 200（NF）抗体</td><td> Sigma - Aldrich公司</td><td> N4142 </td></tr><tr><td>微管蛋白β- 3链（Tuj1）抗体</td><td> Millipore公司</td><td> MAB5544 </td></tr><tr><td>的Alexa Fluor 488山羊抗兔IgG（H + L）二级抗体</td><td> Invitrogen公司</td><td> A11008 </td></tr><tr><td>的Alexa Fluor 555山羊抗小鼠IgG（H + L）二级抗体</td><td> Invitrogen公司</td><td> A21422 </td></tr><tr><td>的Alexa Fluor 647山羊抗大鼠（IgG抗体）（H + L）二级抗体</td><td> Invitrogen公司</td><td> A21247 </td></tr><tr><td>羊抗鼠IgG（H + L）HRP标记二抗</td><td> BioRad公司</td><td> 170-6516 </td></tr><tr><td>羊抗鼠IgG（H + L）HRP标记二抗</td><td>圣克鲁斯生物技术</td><td> SC - 2065 </td></tr><tr><td> 4&#39;,6 - diamidino 2 -苯基吲哚（DAPI） </td><td> Sigma - Aldrich公司</td><td> D9542 </td></tr></tbody></table><p class="jove_step">媒体食谱</p><p class="jove_content"> <strong>100X的OL -补编</strong> </p><table border="1"><tbody><tr><td> <strong>成分</strong> </td><td> <strong>添加的</strong>金额</td></tr><tr><td> DMEM培养液</td><td> 100毫升</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td> 1.02摹</td></tr><tr><td>孕酮</td><td> 0.6毫克</td></tr><tr><td>腐胺</td><td> 161毫克</td></tr><tr><td>亚硒酸钠</td><td> 0.05毫克</td></tr><tr><td> 3,3&#39;,5 -三碘- L -甲状腺素</td><td> 4毫克</td></tr></tbody></table><p class="jove_content"> *贮存于-80 ° C在250μL，分装</p>T“&gt; <strong>OL媒体</strong> </p><table border="1"><tbody><tr><td> <strong>成分</strong> </td><td> <strong>添加的</strong>金额</td></tr><tr><td> DMEM培养液</td><td> 23.75毫升</td></tr><tr><td> 100X的OL补充</td><td> 250μL </td></tr><tr><td>牛胰岛素（1毫克/毫升的股票） </td><td> 125微升</td></tr><tr><td> GlutaMAX </td><td> 250μL </td></tr><tr><td>全息转（从33毫克/毫升的股票） </td><td> 37.5微升</td></tr><tr><td> B27的补充</td><td> 500μL， </td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td> 125微升</td></tr><tr><td>睫状神经营养因子（从50毫微克/μL股票） </td><td> 25μL </td></tr></tbody></table><p class="jove_content"> <strong>混合胶质文化传媒（在DMEM）</strong> </p><table border="1"><tbody><tr><td> <strong>成分</strong> </td><td> <strong>终浓度</strong> </td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td> 10％ </td></tr><tr><td> PEN /链球菌，从股票（0.33％） </td><td> 33单位/ ml青霉素和33μg/ mL链霉素</td></tr><tr><td> GlutaMAX </td><td> 1％ </td></tr></tbody></table><p class="jove_content"> <strong>DRGN媒体（在DMEM）</strong> </p><table border="1"><tbody><tr><td> <strong>成分</strong> </td><td> <strong>终浓度</strong> </td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td> 10％ </td></tr><tr><td> PEN /链球菌（从1％的股份） </td><td> 100单位/ ml青霉素和100μg/ mL链霉素</td></tr></tbody></table><p class="jove_step">消解液配方： </p><p class="jove_content"> <strong>OPC木瓜蛋白酶溶液（在MEM）</strong> </p><table border="1"><tbody><tr><td> <strong>成分</strong> </td><td> <strong>终浓度</strong> </td></tr><tr><td>木瓜蛋白酶溶液</td><td> 1.54毫克/毫升</td></tr><tr><td> L -半胱氨酸</td><td> 360微克/毫升</td></tr><tr><td> DNaseI </td><td> 60微克/毫升</td></tr></tbody></table><p class="jove_content"> <strong>DRG的木瓜蛋白酶溶液（在HBSS中）</strong> </p><table border="1"><tbody><tr><td> <strong>成分</strong> </td><td> <strong>终浓度</strong> </td></tr><tr><td>木瓜蛋白酶</td><td> 1.54毫克/毫升</td></tr><tr><td> L -半胱氨酸</td><td> 360微克/毫升</td></tr></tbody></table><p class="jove_content"> <strong>DRG的胶原酶A溶液（HBSS在）</strong> </p><table border="1"><tbody><tr><td> <strong>成分</strong> </td><td> <strong>终浓度</strong> </td></tr><tr><td>胶原酶一个</td><td> 4毫克/毫升。 </td></tr></tbody></table>

derivation of enriched oligodendrocyte cultures and oligodendrocyte/neuron myelinating co-cultures from post-natal murine tissues

<p class="jove_content">确定基本的OL发展的分子机制，推动我们的OL生物学知识不仅是关键，但也有了解脱髓鞘疾病，如多发性硬化症（MS）的发病机制的影响。细胞发育通常与原代细胞培养模型研究。原代细胞培养有利于对一个给定的细胞类型的评价提供了一个受控<em>环境</em>中，体内多余的变量。虽然从大鼠的职等文化提供入职等生物大量的洞察力，类似的努力，建立从小鼠OL的文化遭到了主要障碍。发展文化小鼠的主要OLS方法是必须以利用现有的转基因小鼠线的优势。 </p><p class="jove_content">已被描述为啮齿类动物组织中提取OPCs的多种方法，从神经球的推导，差速贴壁纯化和<sup>immunopurification</sup> 1-3范围。虽然许多方法提供了成功，最需要丰富的文化时间和/或昂贵的设备/试剂。为了解决这个问题，净化适应最初是由麦卡锡和DE Vellis <sup>2</sup>描述的方法，从小鼠组织的OPCs的首选。此方法涉及物理分离OPCs的来自新生儿灭鼠皮质的神经胶质混合文化。结果是可以分化成OL丰富文化的纯化OPC人口。这种做法是有吸引力，因为其文化相对短的时间和不必要的生长因子或immunopanning抗体要求。 </p><p class="jove_content">虽然在纯化文化探索的OL发展的机制是知识性的，它不提供有关生理环境评估髓鞘的形成。与神经元共培养OLS将给予调节OL介导的神经轴突髓鞘的分子基础的洞察力。对于很多OL /神经元共培养研究，背根神经节（DRGNs）已被证明是神经类型的选择。他们是由于其易于提取，少量污染的细胞，并形成致密突起的病床与OLS的合作文化的理想选择。 <sup>4-6，</sup>虽然研究使用鼠/鼠标myelinating xenocultures已经发表，这样的推导方法OL / DRGN myelinating产后小鼠组织中的合作文化并没有被描述。在这里，我们目前对如何有效地产生这样的文化，以及预期结果的例子详细的方法。这些方法有助于解决OL开发/ myelinating功能的相关问题，并在神经科学领域的有用工具。 </p>

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Derivation of Enriched Oligodendrocyte Cultures and Oligodendrocyte/Neuron Myelinating Co-cultures from Post-natal Murine Tissues

<p class="jove_content">本文介绍的方法，从中获得丰富的人口在原代​​培养的小鼠少突胶质前体细胞（OPCS），它分化为成熟的少突胶质细胞（OLS）。此外，本报告介绍的技术生产小鼠myelinating播种到小鼠背根神经节（DRGNs）突起床鼠标OPCs的合作文化。</p>

丰富的少突胶质细胞培养和Myelinating产后小鼠组织联合培养的少突胶质细胞/神经元的推导

Identifying the molecular mechanisms underlying OL development is not only critical to furthering our knowledge of OL biology, but also has implications ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Cryopreservation of Cortical Tissue Blocks for the Generation of Highly Enriched Neuronal Cultures

生成高度丰富的神经文化皮层组织块冷冻保存

In this study, we outline a standardized protocol for the successful cryopreservation and thawing of cortical brain tissue blocks to generate highly ...

科研

神经科学

Derivation of Glial Restricted Precursors from E13 mice

从E13小鼠胶质限制前体的推导

This is a protocol for derivation of glial restricted precursor (GRP) cells from the spinal cord of E13 mouse fetuses. These cells are early precursors ...

Progenitor-derived Oligodendrocyte Culture System from Human Fetal Brain

来自祖，人脑少突胶质细胞培养系统

Differentiation of human neural progenitors into neuronal and glial cell types offers a model to study and compare molecular regulation of neural cell ...

Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from <em>Xenopus</em> Nerve-muscle Co-cultures

Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures

同时前和突触后电生理记录<em&gt;爪蟾</em神经肌肉文化

Much information about the coupling of  presynaptic ionic currents with the release of neurotransmitter has been obtained  from invertebrate preparations, ...

Preparation of Neuronal Co-cultures with Single Cell Precision

神经元共培养与单细胞精度的制备

Microfluidic embodiments of the Campenot chamber have attracted great interest from the neuroscience community. These interconnected co-culture platforms ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

器官切片文化研究少突胶质细胞动力学和髓鞘

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

Investigating Functional Regeneration in Organotypic Spinal Cord Co-cultures Grown on Multi-electrode Arrays

调查器官脊髓联合培养物中生长多电极阵列功能再生

Adult higher vertebrates have a limited potential to recover from spinal cord injury. Recently, evidence emerged that propriospinal connections are a ...

Derivation of Leptomeninges Explant Cultures from Postmortem Human Brain Donors

从尸检人脑软脑膜捐助外植体培养的推导

Even though great progress has been made in the clinical characterization of Parkinson&#39;s disease, several studies report that the diagnosis of ...

Neuron-Macrophage Co-cultures to Activate Macrophages Secreting Molecular Factors with Neurite Outgrowth Activity

神经元-巨噬细胞共培养活化巨噬细胞分泌突起活性的分子因子

There is strong evidence that macrophages can participate in the regeneration or repair of injured nervous system. Here, we describe a protocol in which ...

Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures

髓鞘有机小脑片培养的制备及免疫染色

In the nervous system, myelin is a complex membrane structure generated by myelinating glial cells, which ensheathes axons and facilitates fast electrical ...