Name: heterogeneity mapping of protein expression in tumors using quantitative immunofluorescence
Uploaded: 2011-10-25T13:00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Heterogeneity Mapping of Protein Expression in Tumors using Quantitative Immunofluorescence at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet i en del af den skotske Funding Rådet (Grant Number HR07005, <a href="http://www.sfc.ac.uk/">http://www.sfc.ac.uk/</a> ), Medicinsk Forskning Skotland ( <a href="http://www.medicalresearchscotland.org.uk/">http://www.medicalresearchscotland.org.uk/</a> ), Kræftens Forskning Storbritannien Forsøgscenter Cancer Medicin Centre ( <a href="http://www.cancerresearchuk.org/">http://www.cancerresearchuk.org/</a> ), og Breakthrough Breast Cancer ( <a href="http://breakthrough.org.uk/">http://breakthrough.org.uk/</a> ).

1. Tissue forberedelse <ol class="lalpha"><li> Microtomy <ol class="lroman"><li> § formalinfikserede fast paraffinindlejret tumorblokke på 4 μm tykkelse ved hjælp af en roterende microtome. </li><li> Placer sektioner på positivt ladede mikroskopiske dias. </li><li> Inkubér objektglassene i et 37 ° C ovn natten over. </li></ol></li><li> Opbevaring <ol><li> Store sektioner i et -18 ° C til -25 ° C fryser, for at forhindre tab af antigen. </li></ol></li></ol> 2. Immunofluorescens af vævssnit <ol class="lalpha"><li> Afvoksning og Rehydrering <ol class="lroman"><li> Dewax dias i xylen to gange i 5 min. </li><li> Rehydrere objektglassene i 99%, 99%, 80%, 50% af ethanol og rindende vand i 2 min på hver i orden. </li></ol></li><li> Antigen Retrieval <ol class="lroman"><li> Udfør varmen inducerede antigenet hentning, ved hjælp af 0,15 mm natriumcitrat, pH 6,0 buffer i en trykkoger i 5 min i microwave. </li><li> Afkøle lysbilleder til 20 min. </li><li> Skyl objektglassene i 0,05% PBST i 5 min på rocker. </li></ol></li><li> Blokering af proceduren <ol class="lroman"><li> Forkæl sektioner i 3% brintoverilte i 10 min. </li><li> Skyl objektglassene i 0,05% PBST i 5 min på rocker. </li><li> Tilføj sektioner for at Sequenza immunfarvning rack. </li><li> Forkæl sektioner i serum frit protein blok i 10 min. </li></ol></li><li> Primært antistof inkubation <ol class="lroman"><li> Inkuber Primært antistof fortyndes til optimal fortynding i Dako Antibody Diluent i 1 time ved stuetemperatur. </li><li> Skyl i 0,05% PBST tre gange i 5 min hver. </li></ol></li><li> Epithelial maske (cytokeratin) inkubation <ol class="lroman"><li> Inkubér muse anti-pan cytokeratin, fortyndes 1:50 i Dako Antibody Diluent natten over ved 4 ° C. </li></ol></li><li> Epithelial maske visualisering <ol class="lroman"><li> Forbered en 1:25 fortynding af ged anti-mus Alexa555 secondary antistof i den præ-fortyndet Envision ged-kanin HRP antistof løsning. Inkuber slides i mørke i 1,5 timer ved stuetemperatur. </li><li> Skyl i 0,05% PBST tre gange i 5min hver. </li></ol></li><li> Target visualisering <ol class="lroman"><li> Overfør dias fra den Sequenza til fugtigt kammer. </li><li> Kombiner Target signalforstærkning fortyndingsmiddel (HistoRx badekar E) og Cy5 Tyramide (HistoRx rør F) på 1:50 koncentration. Vortex at blande grundigt. Inkuber slides i mørke i 10 min ved stuetemperatur. </li><li> Skyl i 0,05% PBST tre gange i 5 min hver. </li><li> Dehydrer objektglassene i 80% ethanol i 1 min. </li><li> Lufttørre dias i mørke. </li></ol></li><li> Kontrastfarvning og dækglas <ol class="lroman"><li> Anvend DAPI Mounting Medium på dækglas og placer dækglas over vævssnit. </li><li> Tør dias natten i mørke. </li><li> Efter dias har tørret, sikkert med neglelak til ENsikker på langsigtet bevaring og holde i en 4 ° C køleskab. </li></ol></li></ol> 3. Billedoptagelse ved hjælp af hele afsnittet scanning <ol class="lalpha"><li> Læg op til fem dias i det dias kassette af Aperio ScanScope FL slide scanner. </li><li> For hvert dias, skal du vælge den generelle regionen til billedet ved hjælp af brugergrænsefladen i ScanScope Console. Vælg regionen til at omfatte alle de væv på diaset, uanset farvningsmønster eller andre observerbare aspekter af prøven. </li><li> Ved hjælp af ScanScope Console, for hver kanal (DAPI, Cy3 og Cy5) bestemme en optimal eksponering som følger: <ol class="lroman"><li> Vælg en region af væv til at afhøre - for dette område bør ideelt set være i tumor-regionen af ​​væv til at give den bedste repræsentation. </li><li> Brug af ScanScope Console AE funktion, eksponeringstid foreslået for hver kanal vurderer, sammen med billede fokus. </li><li> Gentag i op til 3-5 regioner af hver prøve at samarbejdenfirm stabiliteten af ​​værdien. </li></ol></li><li> Vælg en ekstra region (som vist med en blå diamant på ScanScope konsollen billedet) væk fra vævet, men stadig inden for dækglas region diaset, at definere en baggrund område, hvor fladt feltet korrektion billeder vil blive erhvervet for hvert filter. </li><li> Anmeldelse disse billeder forud for billedoptagelse. Hvis billederne ser ud til at have en høj baggrund eller andet billede artefakter, skal det billede, regionen skal flyttes, og nye billeder erhvervet. </li><li> De tilkøbte digitale billede billeder uploades automatisk i Aperio Spectrum databasen. </li></ol> 4. AQUA automatiseret billedanalyse <ol class="lalpha"><li> Se digitale hele slide billeder i Spectrum databasen og anmærke tumor områder af interesse i forbindelse med hele væv og farvningsmønster (r). </li><li> Vælg diaset til at analysere ved hjælp AQUAnalysis fra den digitale slide listen i Spectrum databasen ved at dobbeltklikke på tommelfingerensøm billede (alternativt, skal du markere afkrydsningsfeltet ud for billedet og vælg &#39;Vis billeder&#39; fra menuen øverst på listen). Dette automatisk åbner ImageScope software og farve flettede billede af vævsprøve. </li><li> Brug denne software til at navigere rundt i billedet ved hjælp af det medfølgende værktøj. </li><li> Brug den medfølgende H &amp; E (enten de fysiske dias eller en kommenteret billedet), anmærke regionen renter af de fluorescerende billedet. Flere regioner af interesse, individuelle cirklede områder, kan vælges på en enkelt prøve. Der er også en &#39;negative&#39; værktøj, som bruges til at udelukke områder inden for en udvalgt region (dvs. beskadiget væv, områder med dårlig histologi, ikke-tumor områder, snavs, osv.). </li><li> Gem annotation lag (r) på billedet. </li><li> Retur til Spectrum hovedmenuen, og vælg afkrydsningsfeltet ud for det billede, der var lige kommenteret. Vælg &#39;Analyze&#39; fra menuen stribe hen over toppen af ​​listen. </li><li> I analysen vindue der kommer op, SeleCT &quot;HistoRx AQUA Analysis&quot; fra pull-down menuen. </li><li> Hvis der er flere lag af annotationer, kan du bruge afkrydsningsfelterne til at vælge den rigtige lag (r) til analyse. </li><li> Tryk på &quot;Analyze&quot;-knappen når de er klar til at begynde. </li><li> På dette tidspunkt, vil et minimeret konsol-vinduet vises på proceslinjen i Windows. Dette vil vise forløbet af overførslen af ​​billederne fra Spectrum database til den lokale pc (&quot;pull&quot; operation). </li><li> Når data er overført, vil AQUAnalysis lancering. Brugeren kan derefter bruge alle de interne funktioner i softwaren til at se, navigere i og analysere billeder. </li><li> Den kommenteret region i billedet fra Spectrum databasen er brudt ind i 512x512 pixel billede fliser - som hver især vil blive scoret individuelt. </li><li> For denne undersøgelse, var et uovervåget AQUA scoring algoritme, baseret på data klyngedannelse, brugte 8. I denne algoritme, er AQUA scoringer genereres som følger: <ol class="lroman"><li> Den pan-cytokeratin billedet signal er thresholded ovennævnte baggrund og disse pixels bruges til at definere en svulst &#39;maske&#39;, som derefter bruges til efterfølgende beregninger. Den høje-udtryk pan-cytokeratin pixel også definere cytoplasmatisk / ikke-nukleare områder af tumorcellerne. </li><li> Pixels med høj signal i DAPI kanal, der er inden for tumor masken er identificeret som kernekraft i naturen. </li><li> Den clustering algoritme også undersøger pixels, der har en lav intensitet for enten DAPI farvning eller cytokeratin udtryk og forsøger at delvist tilskrive dem til enten nukleare eller cytoplasmatisk rum, eller baggrund. </li><li> Når alle pixels henføres til en af ​​svulsten rum eller baggrunden, intensiteten af ​​signalet fra målet protein (ER eller HER2) er herefter beregnet inden for hvert af de rum og normaliseret til størrelsen af ​​det rum, hvilket frembringer AQUA scoringer. </li><li> Billeder som ikke har tilstrækkelig tumor repræsentation blev ikke scoret (som defineret af dem med less end 5% af pixel, der repræsenterer tumor). Disse regioner også producere en &#39;Final Result&#39; værdi, der hedder &#39;ikke bestået&#39; og dermed kan fjernes i de efterfølgende statistiske analyser. </li><li> Desuden, hvis det efter nærmere undersøgelse, en operatør, identificeret områder, som ikke var egnet til scoring på grund af prøven eller billedbehandling artefakter (f.eks foldet væv, snavs), blev disse områder redigeret fra scoring og produceret et &quot;Final Result &#39;kaldes&#39; ikke bestået &#39;. </li></ol></li><li> Resultaterne af AQUA scoring er borde af scoringer forbundet med hver 512x512 pixel flise i regionen af ​​interesse inden for et helt vævssnit prøve. Disse filer, i. CSV-format, kan så bruges til efterfølgende statistiske analyse. </li></ol> 5. Statistisk Analyse: Alle statistiske analyser er udført i SPSS (IBM) <ol><li> Hvor det er muligt, for store operationer, genererer SPSS syntax code-filer (. SPS) til at udføre data manipulationer og analyser trin. Eksempel syntaks kode er forudsat som supplerende filer. </li><li&gt; Læs datafiler ind i SPSS. Fjern ubrugte variabler i de rå data (f.eks instrument specifikke parametre, AQUA scores fra ikke-udnyttede rum). </li><li> Hvor regioner har et &#39;Final Result &quot;af&quot; ikke bestået &quot;(se ovenfor), markerer disse værdier som SYSMIS, som fjerner dem fra den numeriske analyser. </li><li> Aggregerede alle data for alle dias for hver markør (ER eller HER2) i en enkelt master datasæt i SPSS-format. Brug denne master file for alle efterfølgende beregninger. </li><li> Brug af en SPSS syntax-fil (et for hver markør: ER eller HER2 (se supplerende syntaks-filer) data blev yderligere valideret og Simpson Indeks for mangfoldighed beregnes som følger: <ol class="lroman"><li> Generer en master analytisk-fil, for at forhindre ændring af master datasættet tidligere genereret. </li><li> Validere stamdata modregnes de rå data, der genereres og billeder. </li><li> Producere Sammenfattende statistikker for AQUA scores for hver prøve (antal af marker, betyder score, median score, minimum score, maksimal score, og standardafvigelse af scores for prøve). </li><li> Check en tilfældig stikprøve af resultater mod den oprindelige rå data output-filer og mod de rå billeddata scoret. </li></ol></li><li> For at generere varme kortet billeder (vist i figur 2 og 3): <ol class="lroman"><li> &#39;Bin&#39; AQUA score data (ved hjælp af &#39;Visual Binning&#39; funktionen i SPSS) i otte individuelle niveauer. For ER blev nukleare scores anvendes, for HER2 blev cytoplasmisk scores brugt. </li><li> Udlede skraldespande sådan, at hver bin repræsenterer en lige andel af tilgængelige sager fra hele datasættet. </li><li> Brug SPSS funktionen &#39;Split File&#39;, så alle efterfølgende udgang ville være på en &quot;pr slide / prøve« niveau. </li><li> Plot hver region (svarende til en 512x512 flise) ved sin x, y koordinater og farve med en værdi, der svarer til skraldespanden ind, som det blev tildelt (se figur 2 og 3). </li></ol></li><li> For at generere heterogenitet scoringer, blev kode skrevet til at generere en Simpsonsindeks for mangfoldighed ved hjælp af AQUA scoringer. <ol class="lroman"><li> Simpson &#39;indeks over mangfoldighed, som anvendes her, er defineret som: <img alt="Ligning 1" src="/files/ftp_upload/3334/3334eq1.jpg" /> Hvor N er det samlede antal scoringer / felter bruges til en given prøve, og n er antallet af scoringer / felter i en given gruppe af standardiserede scores (fremstillet som beskrevet nedenfor). </li></ol></li><li> Brug master analytiske fil, der er beskrevet ovenfor for datakilde. I de viste eksempler, brugte alle ER beregninger den nukleare AQUA score og HER2 beregninger brugt cytoplasmiske AQUA score. Udfør nedenstående beregninger for hver prøve / dias. </li><li> Siden fluorescens data er underlagt varians ustabilitet, således at fejlen størrelsesorden udbreder med intensitet, anvende logaritmisk (base 2) normalisering til alle AQUA scoringer. </li><li> Yderligere omdanne den normaliserede (log transformerede) data til z-(standard) scoringer. <ol class="lroman"><li> Z-score transformation er beregnet ens følger: Z = (AQUA score - gennemsnit af alle scoringer for en prøve) / standardafvigelse scoringer for prøven. Dette udmønter fordelingen af ​​scorer i en fordeling af afvigelser omkring den centrale værdi på nul afvigelse. </li></ol></li><li> Bin disse Z-score værdier i seks grupper (&lt;-2, -2 - -1, -1 - 0, 0 - 1, 1 - 2,&gt; 2). </li><li> Beregn antallet af værdier tildelt til hver bin og beløb for hver bin. Brug denne værdi sammen med det samlede antal felter, at beregne en værdi for hver af de seks spande bruges til indekset. </li><li> Summen af ​​disse værdier og trække fra den ene til at producere indekset for mangfoldighed. </li><li> Mangfoldigheden indekset giver en indikator for spredning af scoringer omkring den betyder for en bestemt prøve. Således højere indeks indikerer en bredere spredning af scoringer, eller øget heterogenitet udtryksformer. Omvendt, lavere indeks, indikerer mindre variation i udtrykket måling og homogene udtryk i prøven. Dette er illustreret i Figures 2 og 3. </li></ol> 6. Repræsentative resultater: Målrettet behandling med relativt lav toksicitet agenter, såsom tamoxifen og trastuzumab, som ikke er standard for pleje af kræft i æggestokkene patienter. Der er god dokumentation for, at platin-taxan first-line kemoterapi er bedre end andre med kemoterapi for kræft i æggestokkene 9-13, og mens 70-80% af patienterne i første omgang reagerer, vil de fleste tilbagefald og dø af deres sygdom. Måling af biomarkører, som kan forudsige respons til alternative behandlingsformer vil være nyttigt for valget af individuel terapi for hver patient, og siden kemoterapi udøver selektionstryk på en tumor, kan overlevende tumorceller har forskellige karakteristika og repræsenterer en delpopulation af tumor før behandling; kvantificere denne ændring kan derfor være nyttig. Vi anvendte vores heterogenitet kortlægning tilgang til skadestuen og HER2 udtryk i kræft i æggestokkene prøver før og efter kemoterapi, i Order at måle kvantitative ændringer i udtryk, og vurdere forholdet mellem biomarkør udtryk før og efter behandlingen. Både ER og HER2 demonstrere markeret heterogenitet inden for de enkelte tumorer, og i nogle tumorer, Simpson-indeks ændringer efter behandlingen af ​​et relativt højt heterogenitet til lav heterogenitet repræsenteret ved faldende Simpson-indekset scorer (se figur 2 og 3). Dette støtter den opfattelse, at klonselektion sker som reaktion på cytotoksisk kemoterapi, hvad vigtigere er, kan dette udnyttes ved hjælp af målrettet terapi mod den resterende befolkning, for bedre at personliggøre behandling for kræftpatienter. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/3334/3334fig1.jpg" /> Figur 1. Hematoxylin og eosin farves mikrofotografier forskellige områder af den samme kræft i æggestokkene viser varierende morfologi. (A) x40 photomicrograph viser to tilstødende områder af tumor med varierende morfologi. Høj effekt visninger (x200) viser celler med cytoplasmatisk clearing og en solid mønster i væksten i den øverste del af tumor (B), mens den nederste del af væv (C), der er mere homogen eosinofil cytoplasma og en papillær vækstmønster. Denne tumor vil dog blive klassificeret som serøs papillære histologiske subtype med henblik på videre håndtering. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/3334/3334fig2.jpg" /> Figur 2. Heterogenitet heatmaps af ER protein udtryk i cytokeratin-positiv kræft i æggestokkene væv, før (øverste panel) og efter (nederste panel) behandling. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/3334/3334fig3.jpg" /> Figur 3. Heterogenitet heatmaps af HER2-protein udtryk i cytokeratin-positiv kræft i æggestokkene væv, før (øverste panel) og efter (nederste panel) behandling.

<ol>
	<li>Gutierrez, M. L., Sayagues, J. M., Del Mar, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytogenetic+heterogeneity+of+pancreatic+ductal+adenocarcinomas:+identification+of+intratumoral+pathways+of+clonal+evolution.">Cytogenetic heterogeneity of pancreatic ductal adenocarcinomas: identification of intratumoral pathways of clonal evolution.</a> Histopathology. 58, 486-497 (2011).</li><li>Yachida, S., Jones, S., Bozic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distant+metastasis+occurs+late+during+the+genetic+evolution+of+pancreatic+cancer.">Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer.</a> Nature. 467, 1114-1117 (2010).</li><li>Gutierrez, M. L., Sayagues, J. M., Del Mar, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytogenetic+heterogeneity+of+pancreatic+ductal+adenocarcinomas:+identification+of+intratumoral+pathways+of+clonal+evolution.">Cytogenetic heterogeneity of pancreatic ductal adenocarcinomas: identification of intratumoral pathways of clonal evolution.</a> Histopathology. 58, 486-497 (2011).</li><li>Yachida, S., Jones, S., Bozic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distant+metastasis+occurs+late+during+the+genetic+evolution+of+pancreatic+cancer.">Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer.</a> Nature. 467, 1114-1117 (2010).</li><li>Liu, J., Lau, S. K., Varma, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mapping+of+tumor+heterogeneity+on+clinical+tissue+specimens+with+multiplexed+quantum+dots.">Molecular mapping of tumor heterogeneity on clinical tissue specimens with multiplexed quantum dots.</a> ACS Nano. 4, 2755-2765 (2010).</li><li>Camp, R. L., Chung, G. G., Rimm, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+subcellular+localization+and+quantification+of+protein+expression+in+tissue+microarrays.">Automated subcellular localization and quantification of protein expression in tissue microarrays.</a> Nat. Med. 8, 1323-1327 (2002).</li><li>Simpson, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+biodiversity.">Measurement of biodiversity.</a> Nature. 163, 688-68 (1949).</li><li>Gustavson, M. D., Bourke-Martin, B., Reilly, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+unsupervised+pixel-based+clustering+algorithm+for+compartmentalization+of+immunohistochemical+expression+using+Automated+Quantitative+Analysis.">Development of an unsupervised pixel-based clustering algorithm for compartmentalization of immunohistochemical expression using Automated Quantitative Analysis.</a> Appl. Immunohistochem. Mol. Morphol. 17, 329-337 (2009).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paclitaxel+plus+carboplatin+versus+standard+chemotherapy+with+either+single-agent+carboplatin+or+cyclophosphamide,+doxorubicin,+and+cisplatin+in+women+with+ovarian+cancer:+the+ICON3+randomised+trial.">Paclitaxel plus carboplatin versus standard chemotherapy with either single-agent carboplatin or cyclophosphamide, doxorubicin, and cisplatin in women with ovarian cancer: the ICON3 randomised trial.</a> Lancet. 360, 505-515 (2002).</li><li>McGuire, W. P., Hoskins, W. J., Brady, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclophosphamide+and+cisplatin+compared+with+paclitaxel+and+cisplatin+in+patients+with+stage+III+and+stage+IV+ovarian+cancer.">Cyclophosphamide and cisplatin compared with paclitaxel and cisplatin in patients with stage III and stage IV ovarian cancer.</a> N. Engl. J. Med. 334, 1-6 (1996).</li><li>Muggia, F. M., Braly, P. S., Brady, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+III+randomized+study+of+cisplatin+versus+paclitaxel+versus+cisplatin+and+paclitaxel+in+patients+with+suboptimal+stage+III+or+IV+ovarian+cancer:+a+gynecologic+oncology+group+study.">Phase III randomized study of cisplatin versus paclitaxel versus cisplatin and paclitaxel in patients with suboptimal stage III or IV ovarian cancer: a gynecologic oncology group study.</a> J. Clin. Oncol. 18, 106-115 (2000).</li><li>Piccart, M. J., Bertelsen, K., James, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Randomized+intergroup+trial+of+cisplatin-paclitaxel+versus+cisplatin-cyclophosphamide+in+women+with+advanced+epithelial+ovarian+cancer:+three-year+results.">Randomized intergroup trial of cisplatin-paclitaxel versus cisplatin-cyclophosphamide in women with advanced epithelial ovarian cancer: three-year results.</a> J. Natl. Cancer. Inst. 92, 699-708 (2000).</li><li>Cannistra, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+of+the+ovary.">Cancer of the ovary.</a> N. Engl. J. Med. 351, 2519-2529 (2004).</li><li>Baker, A. F., Dragovich, T., Ihle, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+phosphoprotein+as+a+biological+marker+of+tumor+signaling.">Stability of phosphoprotein as a biological marker of tumor signaling.</a> Clin. Cancer. Res. 11, 4338-4340 (2005).</li><li>Espina, V., Edmiston, K. H., Heiby, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+portrait+of+tissue+phosphoprotein+stability+in+the+clinical+tissue+procurement+process.">A portrait of tissue phosphoprotein stability in the clinical tissue procurement process.</a> Mol. Cell. Proteomics. 7, 1998-2018 (2008).</li><li>Klymkowsky, M. W., Savagner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial-mesenchymal+transition:+a+cancer+researcher's+conceptual+friend+and+foe.">Epithelial-mesenchymal transition: a cancer researcher's conceptual friend and foe.</a> Am. J. Pathol. 174, 1588-1593 (2009).</li><li>Kurrey, N. K., Jalgaonkar, S. P., Joglekar, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Snail+and+slug+mediate+radioresistance+and+chemoresistance+by+antagonizing+p53-mediated+apoptosis+and+acquiring+a+stem-like+phenotype+in+ovarian+cancer+cells.">Snail and slug mediate radioresistance and chemoresistance by antagonizing p53-mediated apoptosis and acquiring a stem-like phenotype in ovarian cancer cells.</a> Stem. Cells. 27, 2059-2068 (2009).</li><li>Creighton, C. J., Li, X., Landis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Residual+breast+cancers+after+conventional+therapy+display+mesenchymal+as+well+as+tumor-initiating+features.">Residual breast cancers after conventional therapy display mesenchymal as well as tumor-initiating features.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 13820-13825 (2009).</li><li>Aitken, S. J., Thomas, J. S., Langdon, S. P., Harrison, D. J., Faratian, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+changes+in+ER,+PR+and+HER2+expression+in+primary+breast+cancer+and+paired+nodal+metastases.">Quantitative analysis of changes in ER, PR and HER2 expression in primary breast cancer and paired nodal metastases.</a> Ann. Oncol. 21, 1254-1261 (2010).</li><li>Sayagues, J. M., Abad, M. M., Melchor, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratumoural+cytogenetic+heterogeneity+of+sporadic+colorectal+carcinomas+suggests+several+pathways+to+liver+metastasis.">Intratumoural cytogenetic heterogeneity of sporadic colorectal carcinomas suggests several pathways to liver metastasis.</a> J. Pathol. 221, 308-319 (2010).</li></ol>

JC, MG, CJ, og CS er ansat i HistoRx, Inc.

Metoden er beskrevet heri tillader kvantificering af molekylære heterogenitet i standard formalinfikserede, paraffinindstøbte histologisk dele af tumor materiale. Metoden tillader en værdi, der skal tildeles til graden af ​​heterogenitet i et væv afsnit, således at dette så kan tages i betragtning som en variabel i biomarkør udvikling og analyse. Mens det generelt er at foretrække, at vævs-biomarkører er homogene med hensyn til udtryk, således at analysen er mindre modtagelige for prøvetagning fejl eller partiskhed, kan det under visse omstændigheder være nyttigt at kvantificere forskellighed som en parameter. For eksempel, som vist i illustrativt eksempel på skadestuen og HER2, fælles biomarkører udviser stor heterogenitet udtryk og det er i øjeblikket uvist, om dette udgør en selvstændig prognostisk eller prædiktiv faktor med hensyn til klinisk udfald eller respons på behandlingen, hhv. På samme måde, som illustreret, kan terapi i sig selv dynamisk ændrebestanddel populationer af celler, og derfor måling af målet berigelse kunne være nyttigt at vejlede behandlingen beslutninger. Men den teknik, begrænset af de samme faktorer, som begrænser traditionel histopatologiske eller biomarkør (f.eks immunhistokemiske) analyser. Resultatet er afhængig af den type, størrelse og kvaliteten af ​​det væv, der analyseres, og derfor et enkelt vævssnit kan ikke være repræsentative for hele tumor. Faktisk kan Simpson-indeks være urimelig skævhed efter størrelse af væv (antallet af billeder taget til fange og AQUA scores målt). Immunogeniciteten af ​​de epitoper, der måles kan være genstand for ustyrlige præanalytiske faktorer, som artifactually ændre deres udtryk på tværs af vævssnit (såsom kolde iskæmi tid, eller længden af ​​fiksering, og kant artefakter). Dette er især et problem for fosfor-epitoper, som er notorisk labile 14, 15. Derfor teknikken kunne være bedre egnettil resektion prøver snarere end små biopsier, og udføres på flere sektioner i stedet for kun én. I sidste ende kan 3D-billeddiagnostiske teknikker giver mulighed for bedre at kvantificere denne parameter. Den teknik, som præsenteres kan også være begrænset af biologiske faktorer, såsom variation i udtryk for cytokeratin maskering epitop. Dette kan være af særlig bekymring i de kræftformer, herunder ovarie og brystkræft, der undergår epithelial-til-mesenchymale overgang (EMT), eller er beriget til ikke-epitelial komponenter eller stamceller 16, som har for nylig vist sig at forekomme i kemoterapi- behandles kræft i æggestokkene in vitro-17, og i brystkræftpatienter som reaktion på behandlingen 18. Denne begrænsning kan overvindes ved hjælp af alternative maskering antistoffer (eller cocktails af antistoffer), som f.eks cytokeratin plus vimentin, der er opreguleret i EMT 16. Hertil kommer, da andre dele af væv (MICroenvironment), såsom fibroblaster eller vaskulære endotelceller er også i stigende grad ramt af biologiske behandlinger, kan teknikken også blive udvidet til at score disse komponenter, brug af særlige masker til rum af interesse, såsom PECAM / CD31 til pletten for vaskulære endotelceller . Selv om tilpasning af Simpson-indekset har været brugt som et mål for heterogenitet i den nuværende protokol på grund af sin enkelhed, kan andre foranstaltninger af heterogenitet skal anvendes, såsom simple målinger af centrale tendens (middelværdi, varians, median, osv.). Derudover kunne Simpson indeks beregninger ændres til bedre passer til en bestemt testpopulationen. Brugen af ​​Z-score transformationer gør det muligt at score at være mere relevant for flere markører, da heterogeniteten er baseret på afvigelse omkring middel for et datasæt. Dog kan den samlede vifte af scoring være begrænset i denne type transformation. Nogle mønstre kan være bedre egnetblot bin selve AQUA score for alle prøver af en bestemt markør sæt. Udvælgelsen af ​​antallet af beholdere og cutoffs er også en begrænsning i det område af værdier, som kan medføre og kan være optimeret til alternativ eksperimenterende designs. Vi har brugt skadestuen og HER2 i den aktuelle undersøgelse som kandidat biomarkører, da de allerede anvendes i klinikken, hjælpe med at besvare relevante kliniske spørgsmål med hensyn til effekten af ​​målrettede behandlinger, og er kendt for at udstille en betydelig heterogenitet og forandringer i folkeskolen og fjern sygdom 19. Men den optimale markør af heterogenitet er endnu ikke fastslået. Andre muligheder kunne være cytogenetiske markører for clonality, såsom dem, der tidligere blev anvendt i mellemfasen FISH undersøgelser 20. Den tilgang kræver yderligere validering i store, godt kommenteret kliniske kohorter eller kliniske forsøg for yderligere at fastlægge relevansen af ​​denne parameter i cancer biologi.

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagenset </td><td> Firma </td><td> Katalog nummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> ScanScope FL </td><td> Aperio </td><td> ScanScope FL </td><td> Anvendes som udstyret fra leverandør </td></tr><tr><td> Spectrum </td><td> Aperio </td><td> Spectrum </td><td> Konfiguration og katalognumre vil variere afhængig af, hvordan lokale institutioner oprettet deres database-og IT-struktur. </td></tr><tr><td> AQUAnalysis, sammenholdt med AQUAjustment </td><td> HistoRx </td><td> V2.3 </td><td> Den AQUAjustment Pakken gør det muligt AQUAnalysis at bruge billeder gemt i Spectrum. </td></tr><tr><td> HER2 </td><td> Dako </td><td> A0485 </td><td> 1 i 400 fortynding </td></tr><tr><td> muse anti-pan cytokeratin </td><td> Dako </td><td> M3515 </td><td> 1 ud af 50 fortynding </td></tr><tr><td> Antibody Diluent </td><td> Dako </td&gt; <td> S0809 </td><td></td></tr><tr><td> Envision ged-kanin HRP </td><td> Dako </td><td> K4003 </td><td></td></tr><tr><td> Protein blok </td><td> Dako </td><td> X0909 </td><td></td></tr><tr><td> Ged anti-mus Alexa555 </td><td> Invitrogen </td><td> A21422 </td><td></td></tr><tr><td> DAPI Mounting Medium </td><td> Invitrogen </td><td> P36931 </td><td></td></tr><tr><td> Cy5 Tyramide </td><td> HistoRx </td><td> AQ-EMR1-00001 </td><td></td></tr><tr><td> Sequenza immunfarvning center </td><td> Thermo Scientific Shandon </td><td> 73300001 </td><td> Anvendes her for bench-top immunfluorescens farvning </td></tr></tbody></table>

heterogeneity mapping of protein expression in tumors using quantitative immunofluorescence

Morfologiske heterogenitet inden for den enkelte tumor er godt anerkendt af histopathologists i kirurgisk praksis. Mens det ofte tager form af områder med forskellige differentiering i anerkendte histologiske undertyper, eller forskellige patologiske kvalitet, ofte er der mere subtile forskelle i fænotypen, som trodser nøjagtig klassificering (Figur 1). I sidste ende, da morfologi er dikteret af den underliggende molekylære fænotype, områder med synlige forskelle, der sandsynligvis vil blive ledsaget af forskelle i ekspression af proteiner, som iscenesætte cellulære funktion og adfærd, og derfor udseende. Betydningen af synlige og usynlige (molekylær) heterogenitet for prognosen er ukendt, men nye oplysninger tyder på, at i det mindste på det genetiske niveau, heterogenitet findes i den primære tumor 1,2, og nogle af disse sub-kloner give anledning til metastatisk ( og derfor dødelige) sygdom. Desuden er nogle proteiner ermålt som biomarkører, fordi de er mål for behandling (for eksempel skadestuen og HER2 for tamoxifen og trastuzumab (Herceptin), henholdsvis). Hvis disse proteiner vise variable udtryk inden for en tumor så terapeutisk Reaktionerne kan også være variabel. Den udbredte histopatologiske scoring ordninger for immunhistokemi enten ignorere eller numerisk homogenisere en kvantificering af protein udtryk. Tilsvarende i destruktive teknikker, hvor tumorprøver er homogeniseret (såsom genekspression profilering), kan kvantitative oplysninger være belyst, men geografisk information er gået tabt. Genetisk heterogenitet kortlægning tilgange inden for bugspytkirtelkræft har påberåbt sig enten på generering af en enkelt celle suspension 3, eller på macrodissection 4. En nylig undersøgelse har anvendt kvantepunkter for at kortlægge morfologiske og molekylære heterogenitet i prostata cancer væv 5, giver bevis for princippet om, at morfologi og molekylær kortlægning er muligt, men faldende sHort at kvantificere den heterogenitet. Siden immunhistokemi er i bedste fald er kun semi-kvantitativ og genstand for intra-og inter-observatør bias, mere følsomme og kvantitative metoder, der kræves for at præcist at kortlægge og kvantificere væv heterogenitet in situ. Vi har udviklet og anvendt en eksperimentel og statistiske metoder med henblik på systematisk at kvantificere heterogenitet af protein udtryk i hele vævssnit af tumorer, baseret på Automated Kvantitativ analyse (Aqua) system 6. Vævssnittene er mærket med specifikke antistoffer rettet mod cytokeratiner og mål af interesse, koblet til fluoroforen-mærkede sekundære antistoffer. Slides er filmede med en hel-slide fluorescens scanner. Billederne er opdelt i flere hundrede til tusinder af fliser, og hver flise er derefter tildelt en AQUA score, som er en måling af protein koncentration inden for epithelial (tumor) komponent i væv. HEAtmaps genereres til at repræsentere væv udtryk for proteiner og en heterogenitet tildelte score ved hjælp af en statistisk måling af heterogenitet oprindeligt brugt i økologi, baseret på Simpson biodiversitet indeks 7. Til dato har der ikke været nogen forsøg på systematisk at kortlægge og kvantificere denne variation i tandem med protein udtryk i histologiske præparater. Her viser vi den første brug af den anvendte metode til skadestuen og HER2 biomarkør udtryk i kræft i æggestokkene. Med denne metode baner vejen for at analysere forskellighed som en uafhængig variabel i studier af biomarkør udtryk i translationelle undersøgelser med henblik på at fastslå betydningen af ​​heterogenitet i prognosen og forudsigelse af respons på behandlingen.

Watch this Scientific Journal Video about Heterogeneity Mapping of Protein Expression in Tumors using Quantitative Immunofluorescence at JoVE.com

Heterogeneity Mapping of Protein Expression in Tumors using Quantitative Immunofluorescence

Her beskriver vi en metode til at kvantificere molekylære heterogenitet i histologiske dele af tumor materiale ved hjælp af kvantitative immunfluorescens, billedanalyse, og et statistisk mål for heterogenitet. Metoden er beregnet til brug i klinisk biomarkør udvikling og analyse.

Heterogenitet Kortlægning af protein udtryk i tumorer ved hjælp af kvantitative Immunofluorescens

Morphologic heterogeneity within an individual tumor is well-recognized by histopathologists in surgical practice. While this often takes the form of ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR)

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR qPCR

MicroRNA Påvisning i prostata tumorer ved kvantitativ real-time PCR (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process ...

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

Identifikation af<em&gt; Tornerose</em&gt; Transposon Insertioner i solide tumorer med Linker-medieret PCR

Genomic, proteomic, transcriptomic, and epigenomic analyses of human tumors indicate that there are thousands of anomalies within each cancer genome ...

In vitro Organoid Culture of Primary Mouse Colon Tumors

In vitro Organoid Culture of Primary Mouse Colon Tumors

In vitro Organoid Kultur i Primary Mouse tyktarmstumorer

Several  human and murine colon cancer cell lines have been established, physiologic  integrity of colon tumors such as multiple cell layers, basal-apical ...

The Use of Reverse Phase Protein Arrays (RPPA) to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers

The Use of Reverse Phase Protein Arrays RPPA to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers

Anvendelse af omvendt fase-protein Arrays (RPPA) at udforske Protein Expression Variation i de enkelte renalcellecarcinom Kræft

Currently there is no curative treatment for metastatic clear cell renal cell cancer, the commonest variant of the disease. A key factor in this treatment ...

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

In Vivo Optical Imaging af hjernetumorer og Gigt Brug Fluorescent SAPC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent ...

Coordinate Mapping of Hyolaryngeal Mechanics in Swallowing

Koordinere Kortlægning af Hyolaryngeal Mechanics synke

Characterizing hyolaryngeal movement is important to dysphagia research. Prior methods require multiple measurements to obtain one kinematic measurement ...

Quantitative Mass Spectrometric Profiling of Cancer-cell Proteomes Derived From Liquid and Solid Tumors

Kvantitativ Massespektrometrisk profilering kræft-celle proteomer arvet fra flydende og faste tumorer

In-depth analyses of cancer cell proteomes are needed to elucidate oncogenic pathomechanisms, as well as to identify potential drug targets and diagnostic ...

Clinicopathological Analysis of miRNA Expression in Breast Cancer Tissues by Using miRNA In Situ Hybridization

Clinicopathological Analysis of miRNA Expression in Breast Cancer Tissues by Using miRNA In Situ Hybridization

Klinisk-patologisk analyse af miRNA Expression i Breast Cancer væv ved hjælp miRNA<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering

In this article, we describe a detailed protocol for miRNA detection in breast cancer tissue using in situ hybridization with a digoxigenin-labelled LNA ...