Name: heterogeneity mapping of protein expression in tumors using quantitative immunofluorescence
Uploaded: 2011-10-25T13:00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Heterogeneity Mapping of Protein Expression in Tumors using Quantitative Immunofluorescence at JoVE.com

Dit werk werd mede ondersteund door de Schotse Funding Council (Grant Aantal HR07005, <a href="http://www.sfc.ac.uk/">http://www.sfc.ac.uk/</a> ), Medisch Onderzoek Schotland ( <a href="http://www.medicalresearchscotland.org.uk/">http://www.medicalresearchscotland.org.uk/</a> ), de Kanker Onderzoek Britse Experimenteel Kankeronderzoek Medicine Centre ( <a href="http://www.cancerresearchuk.org/">http://www.cancerresearchuk.org/</a> ), en de Breakthrough Breast Cancer ( <a href="http://breakthrough.org.uk/">http://breakthrough.org.uk/</a> ).

1. Tissue voorbereiding <ol class="lalpha"><li> Microtomy <ol class="lroman"><li> Deel formaline gefixeerd paraffine ingebed tumor blokken op 4 micrometer dik met behulp van een roterende microtoom. </li><li> Leg de delen op positief geladen microscopische dia&#39;s. </li><li> Incubeer dia&#39;s in een 37 ° C oven gedurende de nacht. </li></ol></li><li> Opslagruimte <ol><li> Bewaar secties in een -18 ° C tot -25 ° C vriezer, om verlies van antigeniciteit te voorkomen. </li></ol></li></ol> 2. Immunofluorescentie van weefselcoupes <ol class="lalpha"><li> Ontdoen en rehydratatie <ol class="lroman"><li> Dewax dia&#39;s in xyleen twee keer gedurende 5 minuten. </li><li> Hydrateren dia&#39;s in 99%, 99%, 80%, 50% van ethanol en stromend water gedurende 2 minuten van elke in orde is. </li></ol></li><li> Antigen Retrieval <ol class="lroman"><li> Voer de warmte geïnduceerde antigen herstel, met behulp van 0,15 mM natriumcitraat, pH 6,0 buffer in een snelkookpan gedurende 5 min in de microwave. </li><li> Cool down dia&#39;s voor 20 minuten. </li><li> Spoel de objectglaasjes in 0,05% PBST gedurende 5 minuten op de rocker. </li></ol></li><li> Het blokkeren van de procedure <ol class="lroman"><li> Behandel secties in 3% waterstofperoxide gedurende 10 minuten. </li><li> Spoel de objectglaasjes in 0,05% PBST gedurende 5 minuten op de rocker. </li><li> Voeg de secties om Sequenza Immunokleuring rack. </li><li> Behandel secties in serum vrij eiwit te blokkeren gedurende 10 minuten. </li></ol></li><li> Primair antilichaam incubatie <ol class="lroman"><li> Incubeer primaire antilichaam verdund tot een optimale verdunning in Dako antilichamen verdunningsmiddel voor 1 uur bij kamertemperatuur. </li><li> Spoel in 0,05% PBST drie keer voor 5 minuten per stuk. </li></ol></li><li> Epitheliale masker (Cytokeratine) incubatie <ol class="lroman"><li> Incubeer muis anti-pan cytokeratin, verdund in Dako 01:50 antilichaam verdunningsmiddel overnacht bij 4 ° C. </li></ol></li><li> Epitheliale masker visualisatie <ol class="lroman"><li> Bereid een 1:25 verdunning van de geit anti-muis Alexa555 secondary antilichaam in de pre-verdunde Envision geit-konijn antilichaam HRP-oplossing. Incubeer dia&#39;s in het donker voor 1,5 uur bij kamertemperatuur. </li><li> Spoel in 0,05% PBST drie keer voor 5min per stuk. </li></ol></li><li> Target visualisatie <ol class="lroman"><li> Overdracht van de dia&#39;s uit de Sequenza om de vochtigheid kamer. </li><li> Combineer Target signaalversterking oplosmiddel (HistoRx bad E) en de Cy5 tyramide (HistoRx buis F) op 1:50 concentratie. Vortex om goed te mengen. Incubeer dia&#39;s in het donker gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Spoel in 0,05% PBST drie keer voor 5 minuten per stuk. </li><li> Uitdrogen dia&#39;s in 80% ethanol gedurende 1 minuut. </li><li> Lucht drogen dia&#39;s in het donker. </li></ol></li><li> Tegenkleuring en afdekken <ol class="lroman"><li> Van toepassing DAPI montage medium op de dekglaasjes en plaats de dekglaasjes over het weefsel secties. </li><li> Droge dia&#39;s &#39;s nachts in het donker. </li><li> Na de dia&#39;s zijn opgedroogd, veilig met nagellak aan enervoor dat het langdurig bewaren en te houden in een 4 ° C koelkast. </li></ol></li></ol> 3. Beeld vast te leggen met behulp van hele sectie scanning <ol class="lalpha"><li> Laad maximaal vijf dia&#39;s in de schuif cassette van de Aperio ScanScope FL diascanner. </li><li> Voor elke dia, selecteert u de algemene regio om de afbeelding met behulp van de interface in het ScanScope Console. Selecteer de regio om alle weefsels omvatten op de dia, ongeacht kleuringspatroon of andere waarneembare aspecten van het monster. </li><li> Met behulp van de ScanScope Console, voor elk kanaal (DAPI, Cy3 en Cy5) te bepalen een optimale belichting als volgt: <ol class="lroman"><li> Selecteer een regio van weefsel te ondervragen - dit gebied moeten, idealiter in de tumor gebied van weefsel om de beste weergave te bieden. </li><li> Met behulp van de automatische belichting ScanScope Console-functie, evalueren van de belichtingstijd voorgesteld voor elk kanaal, samen met beeld scherp te stellen. </li><li> Herhaal dan tot 3-5 regio&#39;s van elk monster om samen tenfirm de stabiliteit van de waarde. </li></ol></li><li> Kies een extra regio (zoals aangetoond door een blauwe diamant op de ScanScope console afbeelding) uit de buurt van het weefsel, maar nog steeds binnen de dekglaasje regio van de glijbaan, op een achtergrond waar vlakke veld correctie beelden zullen worden verworven voor elk filter te definiëren. </li><li> Herziening van deze foto&#39;s voorafgaand aan de beeldopname. Als de beelden lijken te hoge achtergrond of andere afbeelding artefacten hebben, moet het beeld regio worden verplaatst en nieuwe beelden verworven. </li><li> De verworven digitale dia&#39;s worden automatisch geupload naar de Aperio Spectrum database. </li></ol> 4. AQUA automatische beeldanalyse <ol class="lalpha"><li> Bekijk de digitale hele dia&#39;s in de Spectrum-database en annoteren tumor gebieden van belang in de context van het hele weefsel en kleuringspatroon (s). </li><li> Selecteer de dia met behulp van AQUAnalysis van de digitale lijst met dia&#39;s in de Spectrum-database te analyseren door te dubbelklikken op de duimspijker beeld (als alternatief, schakelt u het selectievakje naast de afbeelding en selecteer vervolgens in het menu aan de bovenkant van de lijst &#39;Images View&#39;). Dit opent automatisch de ImageScope software en de kleur samengevoegde afbeelding van het weefselmonster. </li><li> Deze software gebruiken om het beeld met behulp van het bijgeleverde gereedschap navigeren. </li><li> Met behulp van de bijbehorende H &amp; E (ofwel de fysieke dia of een geannoteerde afbeelding), aantekeningen het gebied van de rente op de fluorescerende beeld. Meerdere regio&#39;s van belang, de individuele omcirkelde gebieden, kunnen worden geselecteerd op een enkel monster. Er is ook een &#39;negatieve&#39; tool die wordt gebruikt om gebieden binnen een geselecteerde regio (dat wil zeggen beschadigd weefsel, gebieden met een slechte histologie, niet-tumor gebieden, puin, etc.) uit te sluiten. </li><li> Sla de annotatielaag (s) op de afbeelding. </li><li> Terug naar het Spectrum hoofdmenu en schakelt u het selectievakje naast het beeld dat was gewoon geannoteerd. Selecteer &#39;Analyseer&#39; uit het menu strip aan de bovenkant van de lijst. </li><li> In de Analysis venster, die zullen komen, select &quot;HistoRx AQUA Analysis&quot; uit het pull-down menu. </li><li> Als er meerdere lagen van annotaties, gebruik de selectievakjes om de juiste laag (s) voor analyse te selecteren. </li><li> Druk op de &#39;Analyze&#39; knop als je klaar bent om te beginnen. </li><li> Op dit punt, zal een console geminimaliseerd venster in de taakbalk van Windows. Dit toont de voortgang van de overdracht van beelden van de Spectrum database naar de lokale PC (de &#39;pull&#39; werking). </li><li> Zodra de data wordt overgedragen, zal AQUAnalysis lanceren. De gebruiker kan vervolgens gebruik maken van alle van de interne functies van de software te bekijken, navigeren en analyseren van beelden. </li><li> De geannoteerde regio van het beeld van de Spectrum-database is opgedeeld in 512x512 pixel afbeelding tegels - die elk zal afzonderlijk worden gescoord. </li><li> Voor deze studie werd een onbewaakt AQUA scoring algoritme, gebaseerd op gegevens clustering, gebruikt 8. In dit algoritme, zijn AQUA scores als volgt gegenereerd: <ol class="lroman"><li> De pan-cytokeratine image signal is thresholded boven de achtergrond en die pixels worden gebruikt om een ​​tumor &#39;masker&#39;, die vervolgens wordt gebruikt voor de volgende berekeningen te definiëren. De high-expressie pan-cytokeratin pixels worden ook de cytoplasmatische / niet-nucleaire regio&#39;s van de tumorcellen. </li><li> Pixels met een hoge signaal in de DAPI kanaal dat zich binnen de tumor masker worden geïdentificeerd als kernenergie in de natuur. </li><li> De clustering algoritme onderzoekt ook pixels die lage intensiteit voor zowel DAPI vlekken of cytokeratine expressie en pogingen om gedeeltelijk ze toe te schrijven aan de nucleaire of cytoplasmatische compartimenten, of achtergrond hebben ofwel. </li><li> Als alle pixels worden toegewezen aan een van de tumor compartimenten of achtergrond, de intensiteit van het signaal van het doelwit proteïne (ER of HER2) wordt vervolgens berekend binnen elk van de compartimenten en genormaliseerd naar de grootte van de compartimenten, waardoor de productie van AQUA scores. </li><li> Afbeeldingen die niet over voldoende tumor vertegenwoordiging werden niet gescoord (zoals gedefinieerd door mensen met less dan 5% van de pixels die tumor). Deze regio&#39;s produceren ook een &#39;Eindresultaat&#39; waarde genaamd &#39;Fail&#39; en kan dus verwijderd worden in de daaropvolgende statistische analyses. </li><li> Bovendien, als na toetsing, een exploitant velden, die niet geschikt waren voor het scoren te wijten aan sample of imaging artefacten (bijv. gevouwen weefsel, puin) geïdentificeerd, werden deze velden geredigeerd te scoren en produceerde een &#39;Final Result&#39;, genaamd &#39;Fail&#39;. </li></ol></li><li> De resultaten van AQUA scoren zijn tabellen van de scores die bij elke 512x512 pixel tegel in de regio van belang in een hele weefselsectie steekproef. Deze bestanden, in. CSV-formaat, kan vervolgens worden gebruikt voor verdere statistische analyse. </li></ol> 5. Statistische analyse: Alle statistische analyses zijn uitgevoerd in SPSS (IBM) <ol><li> Waar mogelijk, voor grote operaties, het genereren van SPSS syntax-code-bestanden (. SPS) om gegevens manipulaties en analyses stappen uit te voeren. Voorbeeld syntax code wordt verstrekt als aanvullende bestanden. </li><li&gt; Lees databestanden in SPSS. Verwijder ongebruikte variabelen in de ruwe data (bijv. instrument specifieke parameters, AQUA scores van de niet-gebruikte compartimenten). </li><li> Waar de regio&#39;s een &#39;Eindresultaat&#39; van &#39;Fail&#39; (zie hierboven) hebben, markeren deze waarden als SYSMIS, die hen verwijdert van de numerieke analyses. </li><li> Geaggregeerde alle gegevens voor alle dia&#39;s voor elke marker (ER of HER2) in een enkele stamgegevens in SPSS formaat. Gebruik deze master file voor alle volgende berekeningen. </li><li> Met behulp van een SPSS syntax-bestand (een voor elke marker: ER of HER2 (zie aanvullende syntax-bestanden) gegevens werd verder gevalideerd en Simpson indices van diversiteit als volgt berekend: <ol class="lroman"><li> Het genereren van een meester analytisch bestand, om wijziging van de master data set eerder gegenereerd te voorkomen. </li><li> Validatie van de master data afgezet tegen de ruwe data en beelden gegenereerd. </li><li> Produceren overzichtsstatistieken voor AQUA scores voor elk monster (graaf van velden, gemiddelde score, de mediaan score, mogelijk b.m score, maximale score, en de standaarddeviatie van de scores voor monster). </li><li> Check een willekeurige steekproef van de resultaten ten opzichte van de oorspronkelijke ruwe data output-bestanden en tegen de RAW-beeldgegevens gescoord. </li></ol></li><li> Om de warmte kaartbeelden (getoond in de figuren 2 en 3) te genereren: <ol class="lroman"><li> &#39;Bin&#39; van de AQUA score gegevens (met behulp van de &quot;Visual binning &#39;functie in SPSS) in acht verschillende niveaus. Voor de ER, werden nucleaire scores gebruikt voor HER2, cytoplasmatische scores werden gebruikt. </li><li> Ontlenen bakken zodanig dat elke bak een gelijk percentage van de beschikbare cases uit de gehele dataset representeert. </li><li> Gebruik maken van de SPSS functie &#39;Split File&#39;, zodat alle volgende uitvoer zou worden op het niveau van een &#39;per dia / monster &quot;. </li><li> Plot elke regio (wat overeenkomt met een 512x512 tegel) door de x, y-coördinaten en kleur met een waarde die overeenkomt met de bin in waarvan zij is toegekend (zie figuren 2 en 3). </li></ol></li><li> Voor het genereren van heterogeniteit scores, werd code geschreven om een ​​Simpson&#39;s genererenindex van de diversiteit met behulp van AQUA scores. <ol class="lroman"><li> De Simpson index van diversiteit, zoals hier gebruikt, wordt gedefinieerd als: <img alt="Vergelijking 1" src="/files/ftp_upload/3334/3334eq1.jpg" /> Waarbij N het totaal aantal scores / velden worden gebruikt voor een gegeven monster en n het aantal scores / velden in een bepaalde groep van gestandaardiseerde scores (geproduceerd zoals hieronder beschreven). </li></ol></li><li> Gebruik de master-analytische bestand hierboven beschreven voor de gegevensbron. In de getoonde voorbeelden zijn alle ER berekeningen die de nucleaire AQUA score en HER2 berekeningen die de cytoplasmatische AQUA score. Voer de onderstaande berekeningen voor elk monster / dia. </li><li> Omdat fluorescentie van gegevens is onderworpen aan de variantie instabiliteit, zodanig dat fout omvang uitdraagt ​​met intensiteit, toe te passen logaritmische (base 2) normalisatie aan alle AQUA scores. </li><li> Verder is de genormaliseerde (log-getransformeerde) gegevens om te zetten in z-(standaard) scores. <ol class="lroman"><li> De Z-score transformatie is berekend op eens volgt: Z = (AQUA score - gemiddelde van alle scores voor een sample) / standaarddeviatie van de scores voor het monster. Dit vertaalt zich de verdeling van de scores in een verdeling van de afwijkingen rond de centrale waarde van nul afwijking. </li></ol></li><li> Bin deze Z-score waarden in zes groepen (&lt;-2, -2 - -1, -1 - 0, 0-1, 1 - 2,&gt; 2). </li><li> Bereken het aantal waarden toegekend in elke bak en bedrag voor elke bak. Gebruik deze waarde, samen met het totaal aantal velden, een waarde voor elk van de zes bakken worden gebruikt voor de index te berekenen. </li><li> Som van deze waarden en aftrekken van de ene naar de index van diversiteit te produceren. </li><li> De diversiteit index geeft een indicatie van de spreiding van scores rond het gemiddelde voor een bepaald monster. Dus, hogere indices wijzen op een bredere spreiding van de scores, of toegenomen heterogeniteit van meningsuiting. Omgekeerd, lagere indices, geven minder variatie in de expressie meten en homogene expressie in het monster. Dit wordt geïllustreerd in Figures 2 en 3. </li></ol> 6. Representatieve resultaten: Gerichte therapie met een relatief lage toxiciteit stoffen, zoals tamoxifen en trastuzumab, zijn niet standaard van zorg voor patiënten met ovariumcarcinoom. Er zijn duidelijke aanwijzingen dat de platina-taxaan eerstelijns chemotherapie is superieur aan andere chemotherapie voor eierstokkanker 9-13, en terwijl 70-80% van de patiënten in eerste instantie te reageren, de meesten zullen terugval en sterven van hun ziekte. Meting van biomarkers, die naar aanleiding van alternatieve therapieën kunnen voorspellen zou nuttig zijn bij het selecteren van geïndividualiseerde therapie voor elke patiënt, en aangezien chemotherapie oefent druk uit op een selectie tumor, overlevende tumorcellen kunnen bezitten verschillende karakteristieken en vertegenwoordigen een subpopulatie van de tumor voor de therapie; kwantificering van deze verandering zou dus nuttig zijn. We pasten onze heterogeniteit in kaart brengen van aanpak van de ER en HER2 expressie in eierstokkanker exemplaren voor en na de chemotherapie, in de Order om kwantitatieve veranderingen in expressie te meten, en beoordelen van de relatie tussen de biomarker expressie voor en na de therapie. Zowel de ER en HER2 aan te tonen duidelijke heterogeniteit binnen de afzonderlijke tumoren, en in sommige tumoren, van de Simpson index verandert na de behandeling van relatief hoge heterogeniteit aan lage heterogeniteit, vertegenwoordigd door het verminderen van Simpson&#39;s index scores (zie figuren 2 en 3). Dit ondersteunt het idee dat klonale selectie ontstaat als reactie op cytotoxische chemotherapie, wat nog belangrijker is, dit kan worden misbruikt via gerichte therapie tegen de resterende bevolking, met het oog op een betere behandeling te personaliseren voor kankerpatiënten. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/3334/3334fig1.jpg" /> Figuur 1. Hematoxyline en eosine gekleurde microfoto&#39;s van de verschillende gebieden van dezelfde eierstokkanker met variabele morfologie. (A) x40 microfoto toont twee aangrenzende gebieden van de tumor met verschillende morfologie. Hoog vermogen uitzicht (x200) onthullen cellen met cytoplasmatische clearing en een solide patroon van de groei in het bovenste deel van de tumor (B), terwijl het onderste deel van het weefsel (C) heeft meer homogene eosinofiele cytoplasma en een papillaire groeipatroon. Deze tumor zou echter, worden geclassificeerd als sereuze papillaire histologische subtype ten behoeve van verdere beheer. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/3334/3334fig2.jpg" /> Figuur 2. Heterogeniteit heatmaps van ER expressie van eiwitten in cytokeratine-positieve kanker van de eierstokken weefsel, vóór (bovenste paneel) en na (onderste paneel) therapie. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/3334/3334fig3.jpg" /> Figuur 3. Heterogeniteit heatmaps van HER2 expressie van eiwitten in cytokeratine-positieve kanker van de eierstokken weefsel, vóór (bovenste paneel) en na (onderste paneel) therapie.

<ol>
	<li>Gutierrez, M. L., Sayagues, J. M., Del Mar, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytogenetic+heterogeneity+of+pancreatic+ductal+adenocarcinomas:+identification+of+intratumoral+pathways+of+clonal+evolution.">Cytogenetic heterogeneity of pancreatic ductal adenocarcinomas: identification of intratumoral pathways of clonal evolution.</a> Histopathology. 58, 486-497 (2011).</li><li>Yachida, S., Jones, S., Bozic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distant+metastasis+occurs+late+during+the+genetic+evolution+of+pancreatic+cancer.">Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer.</a> Nature. 467, 1114-1117 (2010).</li><li>Gutierrez, M. L., Sayagues, J. M., Del Mar, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytogenetic+heterogeneity+of+pancreatic+ductal+adenocarcinomas:+identification+of+intratumoral+pathways+of+clonal+evolution.">Cytogenetic heterogeneity of pancreatic ductal adenocarcinomas: identification of intratumoral pathways of clonal evolution.</a> Histopathology. 58, 486-497 (2011).</li><li>Yachida, S., Jones, S., Bozic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distant+metastasis+occurs+late+during+the+genetic+evolution+of+pancreatic+cancer.">Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer.</a> Nature. 467, 1114-1117 (2010).</li><li>Liu, J., Lau, S. K., Varma, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mapping+of+tumor+heterogeneity+on+clinical+tissue+specimens+with+multiplexed+quantum+dots.">Molecular mapping of tumor heterogeneity on clinical tissue specimens with multiplexed quantum dots.</a> ACS Nano. 4, 2755-2765 (2010).</li><li>Camp, R. L., Chung, G. G., Rimm, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+subcellular+localization+and+quantification+of+protein+expression+in+tissue+microarrays.">Automated subcellular localization and quantification of protein expression in tissue microarrays.</a> Nat. Med. 8, 1323-1327 (2002).</li><li>Simpson, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+biodiversity.">Measurement of biodiversity.</a> Nature. 163, 688-68 (1949).</li><li>Gustavson, M. D., Bourke-Martin, B., Reilly, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+unsupervised+pixel-based+clustering+algorithm+for+compartmentalization+of+immunohistochemical+expression+using+Automated+Quantitative+Analysis.">Development of an unsupervised pixel-based clustering algorithm for compartmentalization of immunohistochemical expression using Automated Quantitative Analysis.</a> Appl. Immunohistochem. Mol. Morphol. 17, 329-337 (2009).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paclitaxel+plus+carboplatin+versus+standard+chemotherapy+with+either+single-agent+carboplatin+or+cyclophosphamide,+doxorubicin,+and+cisplatin+in+women+with+ovarian+cancer:+the+ICON3+randomised+trial.">Paclitaxel plus carboplatin versus standard chemotherapy with either single-agent carboplatin or cyclophosphamide, doxorubicin, and cisplatin in women with ovarian cancer: the ICON3 randomised trial.</a> Lancet. 360, 505-515 (2002).</li><li>McGuire, W. P., Hoskins, W. J., Brady, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclophosphamide+and+cisplatin+compared+with+paclitaxel+and+cisplatin+in+patients+with+stage+III+and+stage+IV+ovarian+cancer.">Cyclophosphamide and cisplatin compared with paclitaxel and cisplatin in patients with stage III and stage IV ovarian cancer.</a> N. Engl. J. Med. 334, 1-6 (1996).</li><li>Muggia, F. M., Braly, P. S., Brady, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+III+randomized+study+of+cisplatin+versus+paclitaxel+versus+cisplatin+and+paclitaxel+in+patients+with+suboptimal+stage+III+or+IV+ovarian+cancer:+a+gynecologic+oncology+group+study.">Phase III randomized study of cisplatin versus paclitaxel versus cisplatin and paclitaxel in patients with suboptimal stage III or IV ovarian cancer: a gynecologic oncology group study.</a> J. Clin. Oncol. 18, 106-115 (2000).</li><li>Piccart, M. J., Bertelsen, K., James, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Randomized+intergroup+trial+of+cisplatin-paclitaxel+versus+cisplatin-cyclophosphamide+in+women+with+advanced+epithelial+ovarian+cancer:+three-year+results.">Randomized intergroup trial of cisplatin-paclitaxel versus cisplatin-cyclophosphamide in women with advanced epithelial ovarian cancer: three-year results.</a> J. Natl. Cancer. Inst. 92, 699-708 (2000).</li><li>Cannistra, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+of+the+ovary.">Cancer of the ovary.</a> N. Engl. J. Med. 351, 2519-2529 (2004).</li><li>Baker, A. F., Dragovich, T., Ihle, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+phosphoprotein+as+a+biological+marker+of+tumor+signaling.">Stability of phosphoprotein as a biological marker of tumor signaling.</a> Clin. Cancer. Res. 11, 4338-4340 (2005).</li><li>Espina, V., Edmiston, K. H., Heiby, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+portrait+of+tissue+phosphoprotein+stability+in+the+clinical+tissue+procurement+process.">A portrait of tissue phosphoprotein stability in the clinical tissue procurement process.</a> Mol. Cell. Proteomics. 7, 1998-2018 (2008).</li><li>Klymkowsky, M. W., Savagner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial-mesenchymal+transition:+a+cancer+researcher's+conceptual+friend+and+foe.">Epithelial-mesenchymal transition: a cancer researcher's conceptual friend and foe.</a> Am. J. Pathol. 174, 1588-1593 (2009).</li><li>Kurrey, N. K., Jalgaonkar, S. P., Joglekar, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Snail+and+slug+mediate+radioresistance+and+chemoresistance+by+antagonizing+p53-mediated+apoptosis+and+acquiring+a+stem-like+phenotype+in+ovarian+cancer+cells.">Snail and slug mediate radioresistance and chemoresistance by antagonizing p53-mediated apoptosis and acquiring a stem-like phenotype in ovarian cancer cells.</a> Stem. Cells. 27, 2059-2068 (2009).</li><li>Creighton, C. J., Li, X., Landis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Residual+breast+cancers+after+conventional+therapy+display+mesenchymal+as+well+as+tumor-initiating+features.">Residual breast cancers after conventional therapy display mesenchymal as well as tumor-initiating features.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 13820-13825 (2009).</li><li>Aitken, S. J., Thomas, J. S., Langdon, S. P., Harrison, D. J., Faratian, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+changes+in+ER,+PR+and+HER2+expression+in+primary+breast+cancer+and+paired+nodal+metastases.">Quantitative analysis of changes in ER, PR and HER2 expression in primary breast cancer and paired nodal metastases.</a> Ann. Oncol. 21, 1254-1261 (2010).</li><li>Sayagues, J. M., Abad, M. M., Melchor, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratumoural+cytogenetic+heterogeneity+of+sporadic+colorectal+carcinomas+suggests+several+pathways+to+liver+metastasis.">Intratumoural cytogenetic heterogeneity of sporadic colorectal carcinomas suggests several pathways to liver metastasis.</a> J. Pathol. 221, 308-319 (2010).</li></ol>

JC, MG, CJ, en CS zijn medewerkers van HistoRx, Inc

De methode die hierin beschreven maakt kwantificering van moleculaire heterogeniteit in standaard formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde histologische secties van tumor materiaal. De methode maakt het mogelijk een waarde die moet worden toegekend aan de mate van heterogeniteit in een weefsel sectie, zodat deze vervolgens kan rekening worden gehouden als een variabele in biomarker ontwikkeling en analyse. Terwijl in het algemeen verdient het de voorkeur dat weefsel biomarkers homogeen zijn met betrekking tot de expressie, zodat de test is minder gevoelig voor sampling error &#39;of vooringenomenheid, kan het onder bepaalde omstandigheden zinvol om heterogeniteit kwantificeren als een parameter. Bijvoorbeeld, zoals in het voorbeeld ter illustratie van ER en HER2, gemeenschappelijke biomarkers tonen aanzienlijke heterogeniteit van meningsuiting en het is momenteel niet bekend of dit een onafhankelijke prognostische of voorspellende factor met betrekking tot de klinische resultaten of respons op de therapie, respectievelijk vertegenwoordigt. Ook, zoals geïllustreerd, kan de therapie zelf dynamisch veranderen debestanddeel populaties van cellen, en dus het meten van de doelstelling verrijking nuttig zou kunnen zijn in het begeleiden van behandeling besluiten. Echter, de techniek beperkt door dezelfde factoren die de traditionele histopathologische of biomerker (zoals immunohistochemische) analyses te beperken. Het resultaat is afhankelijk van het type, de grootte en de kwaliteit van het weefsel wordt geanalyseerd, en dus een enkele weefselsectie wellicht niet representatief voor de gehele tumor. Inderdaad, kan de Simpson index van onnodig groot zijn naar grootte van het weefsel (aantal frames gevangen en AQUA scores gemeten). De immunogeniciteit van de epitopen die gemeten kan worden onderworpen aan oncontroleerbare pre-analytische factoren die artifactually hun expressie te veranderen in het weefsel sectie (zoals koude ischemie tijd, of de lengte van de fixatie, en edge artefact). Dit is vooral een probleem voor fosfo-epitopen, die algemeen bekend zijn labiel 14, 15. Daarom is de techniek is dan misschien beter geschikttot resectie exemplaren in plaats van kleine biopsies, en uitgevoerd op meerdere secties in plaats van slechts een. Uiteindelijk kan 3D-imaging technieken bieden een kans om beter te kwantificeren deze parameter. De techniek zoals gepresenteerd kan ook worden beperkt door biologische factoren, zoals de variabiliteit in de expressie van de cytokeratine maskeren epitoop. Dit kan van bijzonder belang in deze vormen van kanker, met inbegrip van eierstok-en borstkanker, die epitheliale-to-mesenchymale transitie (EMT) ondergaan of zijn verrijkt voor niet-epitheliale componenten of stamcellen 16, zoals onlangs is aangetoond dat het plaatsvindt in chemotherapie- behandeld eierstokkanker in vitro 17, en bij patiënten met borstkanker in reactie op de behandeling 18. Deze beperking kan worden overwonnen met behulp van alternatieve maskering antilichamen (of cocktails van antilichamen), zoals cytokeratine plus vimentine, die opgereguleerd in EMT 16. Bovendien, omdat andere componenten van het weefsel (de microenvironment), zoals fibroblasten of vasculaire endotheliale cellen zijn in toenemende mate ook het doelwit van biologische therapieën, kan de techniek ook worden uitgebreid met deze onderdelen scoren, met behulp van specifieke maskers voor de compartimenten van belang, zoals PECAM / CD31 tot vlek voor vasculaire endotheliale cellen . Hoewel de aanpassing van de index van de Simpson is gebruikt als een maatstaf voor heterogeniteit in het huidige protocol door zijn eenvoud, kunnen ook andere maatregelen van de heterogeniteit worden gebruikt, zoals eenvoudige metingen van de centrale tendens (gemiddelde, variantie, mediaan, etc). Daarnaast zou de Simpson index van de berekeningen worden aangepast om beter bij een bepaalde test bevolking. Het gebruik van Z-score transformaties kan de score te meer van toepassing voor meerdere markers, aangezien de heterogeniteit is gebaseerd op afwijkingen rond het gemiddelde voor een data-set. Echter, het totale assortiment van scoren worden beperkt in dit soort van transformatie. Sommige modellen kan beterom gewoon bin de werkelijke AQUA scores voor alle monsters van een bepaalde markering in te stellen. De selectie van het aantal bakken en cutoffs is ook een beperking in het bereik van de waarden die kan leiden en kan worden geoptimaliseerd voor alternatieve experimentele ontwerpen. We hebben gebruik gemaakt ER en HER2 in de huidige studie als kandidaat biomarkers, omdat ze worden al gebruikt in de kliniek, helpen bij het beantwoorden relevante klinische vragen met betrekking tot de werkzaamheid van gerichte therapieën, en het is bekend dat een aanzienlijke heterogeniteit en verandering vertonen in het basisonderwijs en verre ziekte 19. Echter, de optimale marker van heterogeniteit nog worden vastgesteld. Andere mogelijkheden kunnen zijn cytogenetische markers van klonaliteit zoals die vroeger ook in de interfase FISH studies 20. De aanpak moet nader worden gevalideerd in grote, goed geannoteerde klinische cohorten of klinische trials om verdere vaststelling van de relevantie van deze parameter in kanker biologie.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> ScanScope FL </td><td> Aperio </td><td> ScanScope FL </td><td> Gebruikt als voorzien van leverancier </td></tr><tr><td> Spectrum </td><td> Aperio </td><td> Spectrum </td><td> Configuratie en catalogusnummers zullen variëren over de manier waarop lokale instellingen het opzetten van hun database en IT-structuur. </td></tr><tr><td> AQUAnalysis, in combinatie met AQUAjustment </td><td> HistoRx </td><td> V2.3 </td><td> De AQUAjustment pakket maakt AQUAnalysis te gebruiken beelden die zijn opgeslagen in het Spectrum. </td></tr><tr><td> HER2 </td><td> Dako </td><td> A0485 </td><td> 1 op 400 verdunning </td></tr><tr><td> muis anti-pan cytokeratine </td><td> Dako </td><td> M3515 </td><td> 1 op 50 verdunning </td></tr><tr><td> Antilichaam verdunningsmiddel </td><td> Dako </td&gt; <td> S0809 </td><td></td></tr><tr><td> Envision geit-konijn HRP </td><td> Dako </td><td> K4003 </td><td></td></tr><tr><td> Eiwit blok </td><td> Dako </td><td> X0909 </td><td></td></tr><tr><td> Geit anti-muis Alexa555 </td><td> Invitrogen </td><td> A21422 </td><td></td></tr><tr><td> DAPI afdekmedium </td><td> Invitrogen </td><td> P36931 </td><td></td></tr><tr><td> Cy5 tyramide </td><td> HistoRx </td><td> AQ-EMR1-00001 </td><td></td></tr><tr><td> Sequenza Immunokleuring Center </td><td> Thermo Scientific Shandon </td><td> 73300001 </td><td> Hier gebruikt voor de bench-top immunofluorescentiekleuring </td></tr></tbody></table>

heterogeneity mapping of protein expression in tumors using quantitative immunofluorescence

Morfologische heterogeniteit binnen een individuele tumor is goed herkend door histopathologists in de chirurgische praktijk. Hoewel dit vaak in de vorm van gebieden van de verschillende differentiatie in erkende histologische subtypes, of verschillende pathologische graad, vaak zijn er meer subtiele verschillen in fenotype die nauwkeurige classificatie (figuur 1) trotseren. Uiteindelijk, omdat morfologie wordt bepaald door de onderliggende moleculaire fenotype, gebieden met zichtbare verschillen zijn waarschijnlijk gepaard gaan met verschillen in de expressie van eiwitten die cellulaire functie en gedrag orkestreren, en dus uiterlijk. De betekenis van zichtbare en onzichtbare (moleculaire) heterogeniteit voor de prognose is onbekend, maar recente aanwijzingen dat, althans op genetisch niveau, heterogeniteit bestaat in de primaire tumor 1,2, en sommige van deze sub-klonen aanleiding geven tot uitgezaaide ( en dus dodelijke) ziekte. Bovendien zijn sommige eiwittengemeten als biomarkers, omdat ze de doelstellingen van de therapie (bijvoorbeeld ER en HER2 voor tamoxifen en trastuzumab (Herceptin), respectievelijk). Als deze eiwitten tonen variabele expressie binnen een tumor dan therapeutische respons kan ook variabel zijn. De meest gebruikte histopathologische scoren regelingen voor immunohistochemie negeren, of numeriek gehomogeniseerd de kwantificering van de eiwitexpressie. Ook in destructieve technieken, waarbij de tumor monsters worden gehomogeniseerd (zoals gen expressie profilering), kan kwantitatieve informatie worden opgehelderd, maar de ruimtelijke informatie verloren gaat. Genetische heterogeniteit in kaart brengen van aanpak bij alvleesklierkanker zijn ofwel vertrouwd op generatie van een enkele celsuspensie 3, of op macrodissection 4. Een recente studie heeft gebruikt quantum dots in om morfologische en moleculaire heterogeniteit in prostaatkankerweefsel 5 kaart, ter staving van een principe dat morfologie en moleculaire in kaart brengen haalbaar is, maar valt short van de kwantificering van de heterogeniteit. Sinds immunohistochemie is op zijn best, zijn slechts semi-kwantitatief en onder voorbehoud van intra-en inter-observer bias, meer gevoelige en kwantitatieve methoden nodig om nauwkeurig in kaart en te kwantificeren weefsel heterogeniteit in situ. We hebben ontwikkeld en toegepast een experimentele en statistische methoden om systematisch kwantificeren van de heterogeniteit van eiwitexpressie in hele weefselcoupes van tumoren, op basis van de Automated Kwantitatieve Analyse (AQUA) systeem 6. Weefselcoupes zijn gelabeld met specifieke antilichamen gericht tegen cytokeratines en doelstellingen van belang, gekoppeld aan fluorofoor-gelabelde secundaire antilichamen. Dia&#39;s worden afgebeeld met behulp van een whole-slide fluorescentie scanner. Beelden worden onderverdeeld in honderden tot duizenden tegels, en elke tegel wordt vervolgens toegewezen een AQUA score die een maat voor eiwit concentratie binnen de epitheliale (tumor) component van het weefsel. Heatmaps worden gegenereerd om weefsel expressie van de eiwitten en een toegewezen heterogeniteit score te vertegenwoordigen, met behulp van een statistische maatstaf voor heterogeniteit oorspronkelijk gebruikt in de ecologie, op basis van de Simpson&#39;s index van de biodiversiteit 7. Tot op heden zijn er geen pogingen om systematisch in kaart en deze variabiliteit te kwantificeren in combinatie met eiwit expressie, in histologische preparaten. Hier illustreren we het eerste gebruik van de methode toegepast op de ER en HER2 biomarker expressie in eierstokkanker. Met behulp van deze methode maakt de weg vrij voor het analyseren van heterogeniteit als een onafhankelijke variabele in studies van de biomarker uitdrukking in translationeel onderzoek, om vast te stellen de betekenis van heterogeniteit in de prognose en voorspelling van reacties op de therapie.

Watch this Scientific Journal Video about Heterogeneity Mapping of Protein Expression in Tumors using Quantitative Immunofluorescence at JoVE.com

Heterogeneity Mapping of Protein Expression in Tumors using Quantitative Immunofluorescence

Hier beschrijven we een methode om moleculaire heterogeniteit kwantificeren in histologische secties van tumor materiaal met behulp van kwantitatieve immunofluorescentie, beeldanalyse, en een statistische maatstaf voor heterogeniteit. De methode is bedoeld voor gebruik in klinische biomarker ontwikkeling en analyse.

Heterogeniteit in kaart brengen van de expressie van eiwitten in tumoren met behulp van kwantitatieve Immunofluorescentie

Morphologic heterogeneity within an individual tumor is well-recognized by histopathologists in surgical practice. While this often takes the form of ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

Oprichting en Voortplanting van Human Retinoblastoom Tumoren in het immuunsysteem van deficiënte muizen

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Evaluatie van de Nanodeeltje Opname in Tumoren in real time via intravitale Imaging

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR)

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR qPCR

MicroRNA Detectie in prostaattumoren op Kwantitatieve Real-time PCR (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process ...

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

Identificatie van<em&gt; Sleeping Beauty</em&gt; Transposon inserties in vaste tumoren met Linker-gemedieerde PCR

Genomic, proteomic, transcriptomic, and epigenomic analyses of human tumors indicate that there are thousands of anomalies within each cancer genome ...

In vitro Organoid Culture of Primary Mouse Colon Tumors

In vitro Organoid Culture of Primary Mouse Colon Tumors

In vitro organoïde Cultuur van primaire Mouse Colon Tumoren

Several  human and murine colon cancer cell lines have been established, physiologic  integrity of colon tumors such as multiple cell layers, basal-apical ...

The Use of Reverse Phase Protein Arrays (RPPA) to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers

The Use of Reverse Phase Protein Arrays RPPA to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers

Het gebruik van omgekeerde fase eiwitseries (RPPA) naar Protein Expression Variatie Verkennen binnen Individuele Nier cel kankers

Currently there is no curative treatment for metastatic clear cell renal cell cancer, the commonest variant of the disease. A key factor in this treatment ...

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

In vivo optische beeldvorming van hersentumoren en artritis met fluorescerende SAPC-DOPS nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent ...

Coordinate Mapping of Hyolaryngeal Mechanics in Swallowing

Coördineren Mapping van Hyolaryngeal Mechanics in Slikken

Characterizing hyolaryngeal movement is important to dysphagia research. Prior methods require multiple measurements to obtain one kinematic measurement ...

Quantitative Mass Spectrometric Profiling of Cancer-cell Proteomes Derived From Liquid and Solid Tumors

Kwantitatieve Massaspectrometrische Profilering van Kanker-cel proteoom Afgeleid Van vloeibare en vaste tumoren

In-depth analyses of cancer cell proteomes are needed to elucidate oncogenic pathomechanisms, as well as to identify potential drug targets and diagnostic ...

Clinicopathological Analysis of miRNA Expression in Breast Cancer Tissues by Using miRNA In Situ Hybridization

Clinicopathological Analysis of miRNA Expression in Breast Cancer Tissues by Using miRNA In Situ Hybridization

Clinicopathologische Analyse van miRNA expressie in Breast Cancer weefsels met behulp van miRNA<em&gt; In Situ</em&gt; hybridisatie

In this article, we describe a detailed protocol for miRNA detection in breast cancer tissue using in situ hybridization with a digoxigenin-labelled LNA ...