Name: heterogeneity mapping of protein expression in tumors using quantitative immunofluorescence
Uploaded: 2011-10-25T13:00:00
Duration: 7 min 54 s
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、この作品は、スコットランドの財政審議会（承認番号HR07005によって部分的にサポートされていました<a href="http://www.sfc.ac.uk/">http://www.sfc.ac.uk/</a>医学研究スコットランド（、） <a href="http://www.medicalresearchscotland.org.uk/">http://www.medicalresearchscotland.org.uk/</a> ）、がん研究英国の実験がん医学センター（ <a href="http://www.cancerresearchuk.org/">http://www.cancerresearchuk.org/~~V</a> ）、および画期的な乳がん（ <a href="http://breakthrough.org.uk/">http://breakthrough.org.uk/</a> ）。

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	<li>Gutierrez, M. L., Sayagues, J. M., Del Mar, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytogenetic+heterogeneity+of+pancreatic+ductal+adenocarcinomas:+identification+of+intratumoral+pathways+of+clonal+evolution.">Cytogenetic heterogeneity of pancreatic ductal adenocarcinomas: identification of intratumoral pathways of clonal evolution.</a> Histopathology. 58, 486-497 (2011).</li><li>Yachida, S., Jones, S., Bozic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distant+metastasis+occurs+late+during+the+genetic+evolution+of+pancreatic+cancer.">Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer.</a> Nature. 467, 1114-1117 (2010).</li><li>Gutierrez, M. L., Sayagues, J. M., Del Mar, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytogenetic+heterogeneity+of+pancreatic+ductal+adenocarcinomas:+identification+of+intratumoral+pathways+of+clonal+evolution.">Cytogenetic heterogeneity of pancreatic ductal adenocarcinomas: identification of intratumoral pathways of clonal evolution.</a> Histopathology. 58, 486-497 (2011).</li><li>Yachida, S., Jones, S., Bozic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distant+metastasis+occurs+late+during+the+genetic+evolution+of+pancreatic+cancer.">Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer.</a> Nature. 467, 1114-1117 (2010).</li><li>Liu, J., Lau, S. K., Varma, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mapping+of+tumor+heterogeneity+on+clinical+tissue+specimens+with+multiplexed+quantum+dots.">Molecular mapping of tumor heterogeneity on clinical tissue specimens with multiplexed quantum dots.</a> ACS Nano. 4, 2755-2765 (2010).</li><li>Camp, R. L., Chung, G. G., Rimm, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+subcellular+localization+and+quantification+of+protein+expression+in+tissue+microarrays.">Automated subcellular localization and quantification of protein expression in tissue microarrays.</a> Nat. Med. 8, 1323-1327 (2002).</li><li>Simpson, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+biodiversity.">Measurement of biodiversity.</a> Nature. 163, 688-68 (1949).</li><li>Gustavson, M. D., Bourke-Martin, B., Reilly, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+unsupervised+pixel-based+clustering+algorithm+for+compartmentalization+of+immunohistochemical+expression+using+Automated+Quantitative+Analysis.">Development of an unsupervised pixel-based clustering algorithm for compartmentalization of immunohistochemical expression using Automated Quantitative Analysis.</a> Appl. Immunohistochem. Mol. Morphol. 17, 329-337 (2009).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paclitaxel+plus+carboplatin+versus+standard+chemotherapy+with+either+single-agent+carboplatin+or+cyclophosphamide,+doxorubicin,+and+cisplatin+in+women+with+ovarian+cancer:+the+ICON3+randomised+trial.">Paclitaxel plus carboplatin versus standard chemotherapy with either single-agent carboplatin or cyclophosphamide, doxorubicin, and cisplatin in women with ovarian cancer: the ICON3 randomised trial.</a> Lancet. 360, 505-515 (2002).</li><li>McGuire, W. P., Hoskins, W. J., Brady, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclophosphamide+and+cisplatin+compared+with+paclitaxel+and+cisplatin+in+patients+with+stage+III+and+stage+IV+ovarian+cancer.">Cyclophosphamide and cisplatin compared with paclitaxel and cisplatin in patients with stage III and stage IV ovarian cancer.</a> N. Engl. J. Med. 334, 1-6 (1996).</li><li>Muggia, F. M., Braly, P. S., Brady, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+III+randomized+study+of+cisplatin+versus+paclitaxel+versus+cisplatin+and+paclitaxel+in+patients+with+suboptimal+stage+III+or+IV+ovarian+cancer:+a+gynecologic+oncology+group+study.">Phase III randomized study of cisplatin versus paclitaxel versus cisplatin and paclitaxel in patients with suboptimal stage III or IV ovarian cancer: a gynecologic oncology group study.</a> J. Clin. Oncol. 18, 106-115 (2000).</li><li>Piccart, M. J., Bertelsen, K., James, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Randomized+intergroup+trial+of+cisplatin-paclitaxel+versus+cisplatin-cyclophosphamide+in+women+with+advanced+epithelial+ovarian+cancer:+three-year+results.">Randomized intergroup trial of cisplatin-paclitaxel versus cisplatin-cyclophosphamide in women with advanced epithelial ovarian cancer: three-year results.</a> J. Natl. Cancer. Inst. 92, 699-708 (2000).</li><li>Cannistra, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+of+the+ovary.">Cancer of the ovary.</a> N. Engl. J. Med. 351, 2519-2529 (2004).</li><li>Baker, A. F., Dragovich, T., Ihle, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+phosphoprotein+as+a+biological+marker+of+tumor+signaling.">Stability of phosphoprotein as a biological marker of tumor signaling.</a> Clin. Cancer. Res. 11, 4338-4340 (2005).</li><li>Espina, V., Edmiston, K. H., Heiby, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+portrait+of+tissue+phosphoprotein+stability+in+the+clinical+tissue+procurement+process.">A portrait of tissue phosphoprotein stability in the clinical tissue procurement process.</a> Mol. Cell. Proteomics. 7, 1998-2018 (2008).</li><li>Klymkowsky, M. W., Savagner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial-mesenchymal+transition:+a+cancer+researcher's+conceptual+friend+and+foe.">Epithelial-mesenchymal transition: a cancer researcher's conceptual friend and foe.</a> Am. J. Pathol. 174, 1588-1593 (2009).</li><li>Kurrey, N. K., Jalgaonkar, S. P., Joglekar, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Snail+and+slug+mediate+radioresistance+and+chemoresistance+by+antagonizing+p53-mediated+apoptosis+and+acquiring+a+stem-like+phenotype+in+ovarian+cancer+cells.">Snail and slug mediate radioresistance and chemoresistance by antagonizing p53-mediated apoptosis and acquiring a stem-like phenotype in ovarian cancer cells.</a> Stem. Cells. 27, 2059-2068 (2009).</li><li>Creighton, C. J., Li, X., Landis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Residual+breast+cancers+after+conventional+therapy+display+mesenchymal+as+well+as+tumor-initiating+features.">Residual breast cancers after conventional therapy display mesenchymal as well as tumor-initiating features.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 13820-13825 (2009).</li><li>Aitken, S. J., Thomas, J. S., Langdon, S. P., Harrison, D. J., Faratian, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+changes+in+ER,+PR+and+HER2+expression+in+primary+breast+cancer+and+paired+nodal+metastases.">Quantitative analysis of changes in ER, PR and HER2 expression in primary breast cancer and paired nodal metastases.</a> Ann. Oncol. 21, 1254-1261 (2010).</li><li>Sayagues, J. M., Abad, M. M., Melchor, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratumoural+cytogenetic+heterogeneity+of+sporadic+colorectal+carcinomas+suggests+several+pathways+to+liver+metastasis.">Intratumoural cytogenetic heterogeneity of sporadic colorectal carcinomas suggests several pathways to liver metastasis.</a> J. Pathol. 221, 308-319 (2010).</li></ol>

JC、MG、CJ、そしてCSはHistoRx、（株）の従業員です

方法はここに腫瘍材料の標準的なホルマリン固定、パラフィン包埋組織学セクションの分子多様性の定量化を可能にする説明。方法は、これはその後、バイオマーカーの開発と分析の変数として考慮することができるように、組織切片の不均質性の度合いに割り当てられる値を許可します。一般的には、組織のバイオマーカーのアッセイは、サンプリングエラーやバイアスの影響を受けにくくなるように、表現に関して均質であることが好ましいが、それはいくつかの状況下でのパラメータとして不均一性を定量化するために有用かもしれません。 ERとHER2のための例示の例に示すように、例えば、一般的なバイオマーカーは発現のかなりの異質性を示すが、このことを、それぞれ臨床転帰や治療への応答に関して、独立した予後または予測因子を、表しているかどうか現時点では不明です。同様に、図に示すように、治療自体が動的に変更するかもしれない構成する細胞の集団、そしてターゲット濃縮の測定は、治療上の意思決定を導くのに有用かもしれません。 しかし、技術は従来の病理組織学的またはバイオマーカー（など免疫組織化学など）の分析を制限する同じ要因によって制限されます。その結果、タイプ、サイズ、および分析される組織の品質に依存し、したがって、単一の組織切片では、腫瘍全体を代表できない場合があります。実際、シンプソンの指数は、不当に組織の大きさ（キャプチャとAQUAのスコアが測定されたフレームの数）によってバイアスされることがあります。測定されるエピトープの免疫原性は、人為的に組織切片（例えば冷阻血時間、または固定の長さ、およびエッジのアーティファクトなど）を介してそれらの発現を変化させる制御できない分析前の要因が適用される場合があります。これは特に悪名高い不安定な14、15であるリン酸化エピトープ、のための問題です。そのための手法は適しているかもしれません。切除標本ではなく、小さな生検に、というだけのものよりも、複数のセクションで実行されます。最終的に、3Dイメージング技術は、より良い、このパラメータを定量化する機会を提供する場合があります。 提示された技術はまた、ケラチンマスキングのエピトープの発現の変動性などの生物学的要因によって制限される場合があります。これは、卵巣と上皮間葉移行（EMT）を受けるか、非上皮成分または幹細胞16に濃縮されている乳がん、を含む、これらのがんに特に懸念されるなど、最近で発生することが示されているかもしれない化学療法- 試験管17、および治療​​18〜応答における乳癌患者の卵巣癌を治療。この制限は、EMT 16にアップレギュレートされるサイトケラチンプラスビメンチン、などの代替マスキング抗体（または抗体のカクテル）、使用して克服することができる。加えて、組織の他のコンポーネント（マイクからroenvironment）、線維芽細胞や血管内皮細胞はまた、ますます生物学的治療の標的とされているような、技術はまた、血管内皮細胞に対して染色するなどPECAM / CD31のような関心の区画のための特定のマスクを、使用して、これらのコンポーネントを獲得するために拡張される。 シンプソンの指数の適応は、その単純さのため、現在のプロトコルの不均一性の尺度として使用されているが、異質のその他の措置は、中心傾向の単純な測定値（平均、分散、中央値など）として、使用することができる。また、シンプソンの指数の計算は、より良い特定のテストの人口に合わせて変更することができます。 Z -スコアの変換の使用は、異質性がデータセットの平均値周りの偏差に​​基づいているので、得点が複数のマーカーのためのより適切にすることができます。しかし、得点の全体の範囲は、変換のこのタイプに制限することができます。設計によっては、方が適切な場合があります。単に特定のマーカーセットのすべてのサンプルのため実際のAQUAスコアをbinに。ビンとカットオフの数の選択もつながると代替実験的な設計に最適化される値の範囲の制限です。 我々は、彼らがすでに診療所で使用されているので、標的療法の有効性に関して、関連する臨床上の疑問に答えるため、バイオマーカー候補として現在の研究でERとHER2を使用している、と主と遠くにかなりの異質性と変化を示すことが知られている病気19。しかしながら、異質性の最適なマーカーは決定されていない。他の可能性は、以前に間期FISHの研究20で使用されるようなクローンの細胞遺伝学的マーカーが含まれる場合があります。アプローチは、さらにがんの生物学では、このパラメータの妥当性を確立するために大規模な、よく注釈付きの臨床コホートまたは臨床試験のさらなる検証が必要です。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td> ScanScope FL </td><td>アペリオ</td><td> ScanScope FL </td><td>使用されるようにベンダーから装備</td></tr><tr><td>スペクトラム</td><td>アペリオ</td><td>スペクトラム</td><td>構成とカタログ番号は、地元の機関がそのデータベースとIT構造のセットアップ方法によって異なります。 </td></tr><tr><td> AQUAjustmentと一緒にAQUAnalysis、 </td><td> HistoRx </td><td> V2.3 </td><td> AQUAjustmentパッケージはAQUAnalysisがスペクトラムに格納されているイメージを使用することができます。 </td></tr><tr><td> HER2 </td><td> Dako社製</td><td> A0485 </td><td> 400希釈の1 </td></tr><tr><td>マウス抗パンサイトケラチン</td><td> Dako社製</td><td> M3515 </td><td> 50希釈の1 </td></tr><tr><td>抗体の希釈剤</td><td> Dako社製</TD&gt; <td> S0809 </td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギHRPを思い描く</td><td> Dako社製</td><td> K4003 </td><td></td></tr><tr><td>タンパク質のブロック</td><td> Dako社製</td><td> X0909 </td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗マウスAlexa555 </td><td>インビトロジェン</td><td> A21422 </td><td></td></tr><tr><td> DAPIは、培地を取り付け</td><td>インビトロジェン</td><td> P36931 </td><td></td></tr><tr><td> Cy5標識チラミド</td><td> HistoRx </td><td> AQ - EMR1 - 00001 </td><td></td></tr><tr><td> Sequenzaの免疫染色センター</td><td>サーモサイエンティフィックシャンドン</td><td> 73300001 </td><td>ベンチトップ免疫蛍光染色のためにここで使用</td></tr></tbody></table>

heterogeneity mapping of protein expression in tumors using quantitative immunofluorescence

個々の腫瘍内の形態学的不均一性は外科診療におけるhistopathologistsでよく認識されています。これはしばしば認識組織学的サブタイプへの明確な差別化の領域の形態、または別の病理学的悪性度をとる一方で、多くの場合、正確な分類（図1）逆らう表現型でより多くの微妙な違いがあります。最終的に、形態が根底にある分子表現型によって規定されているので、目に見える違いはある地域では、外観の細胞機能と動作を調整し、従って、タンパク質の発現の違いを添付する可能性があります。予後のための可視と不可視の（分子）不均一性の意義は不明であるが、最近の証拠は、少なくとも遺伝子レベルで、異質性が、原発腫瘍の1,2に存在する、そしてこれらのサブクローンの一部が転移を生じさせる、ことを示唆している（したがって、致命的な）疾患。 また、いくつかのタンパク質は彼らは治療の目標（タモキシフェンとトラスツズマブ（ハーセプチン）のインスタンスのERとHER2、それぞれのための）であるため、バイオマーカーとして測定。これらのタンパク質は、腫瘍内の変数式を表示する場合は、治療反応も変数があります。免疫組織化学用に広く使用されている病理組織学的スコアリングのスキームは、どちらか無視するか、数値的にタンパク質発現の定量化をホモジナイズする。同様に、腫瘍サンプルをホモジナイズしている破壊的な技術、（そのような遺伝子発現プロファイリングなど）で、定量的な情報を明らかにすることができますが、空間情報は失われます。膵臓癌の遺伝的異質性のマッピングのアプローチは、単一の細胞懸濁液3の世代上で、またはmacrodissection 4に頼ってきた。最近の研究では、形態と分子のマッピングが実現可能であることを原理の証明を提供し、前立腺癌組織5の形態学的および分子多様性をマッピングするために量子ドットを使用するが、sを落下している異質性を定量化するのホルト。免疫組織化学では唯一、最高の状態で、半定量的および内および間の観察者バイアスの対象となるので、より高感度かつ定量的手法は、正確にその場で組織の不均一性をマッピングし、定量化するために必要です。 我々は（AQUA）自動定量分析に基づいて、体系的に腫瘍の全体の組織切片でのタンパク質発現の不均一性を定量化するためにシステム6を実験的および統計的方法論を開発し、適用しています。組織切片を蛍光標識二次抗体に結合サイトケラチンと興味の対象に対して向けられた特異的な抗体で標識されています。スライドは全体のスライド蛍光スキャナーを用いて画像化している。画像は、タイルの数百〜数千に細分化され、各タイルは、組織の上皮（腫瘍）コンポーネント内のタンパク質濃度の尺度であるAQUAのスコアが割り当てられます。 HEAtmapsはSimpsonの多様性のインデックス7に基づいて、もともとは生態学で使用される不均一性の統計的尺度を用いて、タンパク質の組織発現と割り当てられている不均一性のスコアを表すために生成されます。 現在までに組織学的製剤で、体系的に蛋白質の発現と並行してこの変動をマッピングし、定量化する試みがなされていない。ここで、我々は、ERおよび卵巣癌におけるHER2バイオマーカーの発現に適用されるメソッドの最初の使用例を示します。このメソッドを使用すると、予後と治療への応答の予測の不均一性の重要性を確立するために、トランスレーショナル研究におけるバイオマーカーの発現の研究​​の独立変数としての異質性を分析するための道を開く。

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Heterogeneity Mapping of Protein Expression in Tumors using Quantitative Immunofluorescence

ここでは定量的免疫蛍光法、画像解析、および不均質性の統計的尺度を用いて腫瘍材料の組織切片の分子多様性を定量化する方法を説明します。方法は、臨床バイオマーカーの開発と分析に使用することを目的としています。

定量的免疫蛍光法を用いて腫瘍におけるタンパク質発現の不均一性のマッピング

Morphologic heterogeneity within an individual tumor is well-recognized by histopathologists in surgical practice. While this often takes the form of ...

Research

JoVE Journal

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In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

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