Name: heterogeneity mapping of protein expression in tumors using quantitative immunofluorescence
Uploaded: 2011-10-25T13:00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Heterogeneity Mapping of Protein Expression in Tumors using Quantitative Immunofluorescence at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet i en del av den skotske Funding Council (Grant Number HR07005; <a href="http://www.sfc.ac.uk/">http://www.sfc.ac.uk/</a> ), Medical Research Skottland ( <a href="http://www.medicalresearchscotland.org.uk/">http://www.medicalresearchscotland.org.uk/</a> ), Kreftregisteret Forskning britiske Experimental Cancer Medicine Centre ( <a href="http://www.cancerresearchuk.org/">http://www.cancerresearchuk.org/</a> ), og gjennombrudd Breast Cancer ( <a href="http://breakthrough.org.uk/">http://breakthrough.org.uk/</a> ).

1. Tissue forberedelse <ol class="lalpha"><li> Skjæringen <ol class="lroman"><li> Seksjon formalinfiksert parafin embedded tumor blokker på 4 mikrometer tykkelse ved hjelp av en rotasjonsmikrotom. </li><li> Plasser delene på positivt ladede mikroskopiske lysbilder. </li><li> Inkuber lysbilder i en 37 ° C ovnen over natten. </li></ol></li><li> Lagring <ol><li> Oppbevar seksjoner i en -18 ° C til -25 ° C fryseboks, for å forhindre tap av antigenisitet. </li></ol></li></ol> 2. Immunfluorescens av vev seksjoner <ol class="lalpha"><li> Avvoksing og Rehydrering <ol class="lroman"><li> Dewax lysbilder i xylen to ganger for 5 min. </li><li> Rehydrere lysbilder i 99%, 99%, 80%, 50% av etanol og rennende vann i 2 min på hver i orden. </li></ol></li><li> Antigen henting <ol class="lroman"><li> Utfør varmen indusert antigen henting, bruker 0,15 mm natriumsitrat, pH 6,0 buffer i en trykkoker for 5 min i mitet. </li><li> Kjøl deg ned lysbilder i 20 min. </li><li> Skyll lysbilder i 0,05% PBST for 5 min på rocker. </li></ol></li><li> Blokkering prosedyre <ol class="lroman"><li> Behandle seksjoner i 3% hydrogen peroxide i 10 min. </li><li> Skyll lysbilder i 0,05% PBST for 5 min på rocker. </li><li> Legg delene til Sequenza farging rack. </li><li> Behandle seksjoner i Serum fritt protein blokk i 10 min. </li></ol></li><li> Primære antistoff inkubering <ol class="lroman"><li> Inkuber Primær antistoff fortynnes til optimal fortynning i Dako antistoff fortynningsmiddel i 1 time ved romtemperatur. </li><li> Skyll i 0,05% PBST tre ganger for 5 min hver. </li></ol></li><li> Epitelial maske (Cytokeratin) inkubering <ol class="lroman"><li> Inkuber mus anti-pan cytokeratin, fortynnet 1:50 i Dako antistoff fortynningsmiddel over natten ved 4 ° C. </li></ol></li><li> Epiteliale maske visualisering <ol class="lroman"><li> Klargjør en 1:25 fortynning av goat anti-mus Alexa555 erecondary antistoff i pre-utvannet Envision goat-kanin HRP antistoff løsning. Inkuber lysbilder i mørke i 1,5 timer ved romtemperatur. </li><li> Skyll i 0,05% PBST tre ganger for 5min hver. </li></ol></li><li> Target visualisering <ol class="lroman"><li> Overfør lysbilder fra Sequenza til fuktighet kammer. </li><li> Kombiner Target signal forsterkning fortynningsmiddel (HistoRx badekar E) og Cy5 Tyramide (HistoRx tube F) kl 01:50 konsentrasjon. Vortex for å blande godt. Inkuber lysbilder i mørke i 10 min ved romtemperatur. </li><li> Skyll i 0,05% PBST tre ganger for 5 min hver. </li><li> Dehydrere lysbilder i 80% etanol for 1 min. </li><li> Lufttørke lysbilder i mørket. </li></ol></li><li> Kontrafarging og coverslipping <ol class="lroman"><li> Påfør DAPI montering medium på Dekkglass og plasser Dekkglass over vev seksjoner. </li><li> Tørr lysbilder natten i mørket. </li><li> Etter lysbildene har tørket, sikkert med neglelakk til enat langsiktig bevaring og holde i en 4 ° C kjøleskapet. </li></ol></li></ol> 3. Bilde ta med hele avsnittet skanning <ol class="lalpha"><li> Load opptil fem lysbilder i raset kassett av Aperio ScanScope FL skyve skanner. </li><li> For hvert lysbilde, velg general regionen til bilde ved hjelp av grensesnittet i ScanScope Console. Velg området til å omfatte alle vev på lysbildet, uavhengig av flekker mønster eller andre observerbare aspekter av prøven. </li><li> Bruke ScanScope Console, for hver kanal (DAPI, Cy3 og Cy5) avgjøre en optimal eksponering som følger: <ol class="lroman"><li> Velg en region av vev for å forhøre - dette området burde, ideelt sett, være i tumor regionen vev for å gi best representasjon. </li><li> Bruke ScanScope Console autoexposure funksjonen, evaluere eksponeringstiden foreslått for hver kanal, sammen med bilde fokus. </li><li> Gjenta løpet opptil 3-5 regioner i hver prøve å samarbeidenfirm stabilitet av verdien. </li></ol></li><li> Velg en ekstra region (som vist av en blå diamant på ScanScope konsollen bildet) vekk fra vevet, men likevel innenfor den coverslipped regionen i raset, for å definere en bakgrunn område hvor flat feltet korrigering bilder vil bli kjøpt for hvert filter. </li><li> Gjennomgå disse bildene før image oppkjøpet. Hvis bildene synes å ha høy bakgrunn eller andre bilderester, bør bildet regionen flyttes og nye bilder ervervet. </li><li> De oppkjøpte digitale lysbildene er lastet automatisk inn i Aperio Spectrum database. </li></ol> Fire. AQUA automatisert bildeanalyse <ol class="lalpha"><li> Se de digitale hele lysbildene i Spectrum databasen og kommentere tumor områder av interesse i sammenheng med hele vev og farging av mønster (s). </li><li> Velg lysbildet å analysere ved hjelp AQUAnalysis fra den digitale gli listen i Spectrum databasen ved å dobbeltklikke på tommelenspiker image (alternativt, merker ved siden av bildet og velg deretter &quot;Vis bilder&quot; fra menyen øverst på listen). Dette åpner automatisk ImageScope programvare og farge fusjonerte bilde av vevsprøve. </li><li> Bruk denne programvaren til å navigere i bildet ved hjelp av verktøyene som følger med. </li><li> Ved hjelp av medfølgende H &amp; E (enten fysiske lysbildet eller en annotert bilde), kommentere regionen av interesse på fluorescerende bildet. Flere regioner av interesse, sirklet enkelte områder, kan velges på en enkelt prøve. Det finnes også en &quot;negativ&quot; verktøy som brukes til å ekskludere områder innenfor en valgt region (dvs. skadet vev, områder med dårlig histologi, non-tumor områder, rusk, etc.). </li><li> Lagre merknaden layer (e) på bildet. </li><li> Tilbake til Spectrum hovedmenyen og velger avmerkingsboksen ved siden av bildet som ble nettopp kommenterte. Velg &quot;Analyser fra menyen stripen øverst på listen. </li><li> I analysen vinduet som kommer opp, Select &quot;HistoRx AQUA Analysis&quot; fra rullegardinmenyen. </li><li> Hvis det er flere lag med merknader, bruke avmerkingsboksene til å velge riktig lag (er) for analyse. </li><li> Trykk på &#39;Analyser&#39; knappen når du er klar til å begynne. </li><li> På dette punktet, vil et minimert konsoll vinduet vises i Windows oppgavelinjen. Dette vil vise fremdriften i overføring av bilder fra Spectrum databasen til den lokale PC (den &quot;pull&quot; drift). </li><li> Når dataene er overført, blir AQUAnalysis lanseringen. Brukeren kan da bruke alle de interne funksjoner av programvaren for å vise, navigere og analysere bilder. </li><li> Den kommenterte regionen bildet fra Spectrum databasen er delt inn i 512x512 pixel image fliser - som hver for seg vil bli scoret individuelt. </li><li> For denne studien, var en unsupervised AQUA scoring algoritme, basert på data clustering, brukte 8. I denne algoritmen er AQUA skårer generert som følger: <ol class="lroman"><li> Den pan-cytokeratin image signal er thresholded over bakgrunn og de pikslene brukes til å definere en svulst &#39;maske&#39; som deretter brukes for etterfølgende beregninger. Den høye-uttrykket pan-cytokeratin piksler også definere cytoplasmatiske / ikke-kjernefysiske regioner av kreftceller. </li><li> Piksler med høyt signal i DAPI kanalen som er innen svulsten maske er identifisert som kjernefysisk i naturen. </li><li> Den clustering algoritmen undersøker også piksler som har lav intensitet for enten DAPI flekker eller cytokeratin uttrykk og forsøk på å delvis attributt dem til enten kjernefysisk eller cytoplasmatisk rom, eller bakgrunn. </li><li> Når alle pikslene er tilordnet en av svulsten avdelinger eller bakgrunn, intensiteten av signal fra målet protein (ER eller HER2) beregnes deretter innen hver av avdelingene og normalisert til størrelsen på avdelingene, og dermed produsere AQUA score. </li><li> Bilder som ikke har tilstrekkelig tumor representasjon ble ikke scoret (som definert av de med less enn 5% av piksler som representerer tumor). Disse områdene har også produsere en &#39;Final Result&#39; verdi kalt &quot;Fail&quot; og kan dermed bli fjernet i senere statistiske analyser. </li><li> I tillegg, hvis upon gjennomgang, en operatør identifisert områder som ikke var egnet for scoring på grunn av sample eller bildediagnostikk gjenstander (f.eks foldet vev, rusk), var disse feltene Redacted fra scoring og produsert en &#39;Final Result&#39; kalt &quot;Fail&quot;. </li></ol></li><li> Resultatene av AQUA scoring er tabeller over skårer tilknyttet hver 512x512 pixel flis i regionen av interesse innenfor en hel vev seksjon prøven. Disse filene, i. CSV-format, kan deretter brukes for senere statistisk analyse. </li></ol> 5. Statistisk analyse: Alle statistiske analyser er utført i SPSS (IBM) <ol><li> Der det er mulig, for store operasjoner, generere SPSS syntaks kode-filer (. SPS) til å utføre data manipulasjoner og analyse trinn. Eksempel syntaks kode er gitt som supplerende filer. </li><li&gt; Les datafiler i SPSS. Fjern ubrukte variabler i rådata (f.eks instrument bestemte parametere, AQUA score fra ikke-utnyttet rom). </li><li> Der regioner har en &quot;endelig resultat&quot; av &quot;Fail&quot; (se ovenfor), Mark disse verdiene som SYSMIS, som fjerner dem fra den numeriske analyser. </li><li> Samlede alle data for alle lysbilder for hver markør (ER eller HER2) i en enkelt master datasett i SPSS-format. Bruk denne hovedfilen for alle etterfølgende beregninger. </li><li> Bruke en SPSS syntaks fil (ett for hver markør: ER eller HER2 (se supplerende syntaks filer) data ble ytterligere validert og Simpsons Indekser av mangfold beregnes som følger: <ol class="lroman"><li> Generer en mester analytisk fil, for å forhindre endringer av master datasettet tidligere generert. </li><li> Validere stamdata satt mot rådata og bilder generert. </li><li> Lag sammendrag statistikk for AQUA score for hver prøve (teller til felt, gjennomsnittsskår, median score, minimum score, maksimal score, og standardavvik av skårer for utvalget). </li><li> Sjekk et tilfeldig utvalg av resultatene mot de opprinnelige rådata utdatafiler og mot den rå bildedata scoret. </li></ol></li><li> For å generere varme kartbilder (vist i figur 2 og 3): <ol class="lroman"><li> &#39;Bin&#39; AQUA poengsum data (ved hjelp av &quot;Visual Binning&quot;-funksjonen i SPSS) i åtte individuelle nivåer. For ER ble kjernefysiske score brukt, for HER2, ble cytoplasmatiske score brukt. </li><li> Utlede skuffer slik at hver bin representerer en lik prosentandel av tilgjengelig saker fra hele datasettet. </li><li> Bruk SPSS funksjonen &quot;Split File&quot;, slik at alle påfølgende utgang ville være på en &quot;per lysbilde / sample&quot; nivå. </li><li> Plot hver region (tilsvarende en 512x512 flis) av sin x, y koordinater og farge med en verdi tilsvarende den bin der det ble tildelt (se figur 2 og 3). </li></ol></li><li> For å generere heterogenitet score, ble kode skrevet for å generere et Simpsonsindeks av mangfold bruke AQUA score. <ol class="lroman"><li> The Simpsons indeks av mangfold, som brukes her, er definert som: <img alt="Ligning 1" src="/files/ftp_upload/3334/3334eq1.jpg" /> Der N er det totale antall poeng / felt brukes for en gitt prøve og n er antall poeng / felt i en gitt gruppe av standardiserte skårer (produsert som beskrevet nedenfor). </li></ol></li><li> Bruk mestre analytiske file beskrevet ovenfor for datakilde. I eksemplene vist, brukte alle ER beregninger kjernefysiske AQUA score og HER2 beregninger brukt cytoplasmatiske AQUA score. Utfør beregningene nedenfor for hver prøve / lysbilde. </li><li> Siden fluorescens data er underlagt varians ustabilitet, forplanter seg slik at feilen størrelsesorden med intensitet, påfør logaritmisk (base 2) normalisering til alle AQUA score. </li><li> Videre transformere normalisert (log transformert) data til z-(standard) score. <ol class="lroman"><li> Z-score transformasjon er beregnet ener følgende: Z = (AQUA score - gjennomsnitt av alle score for en prøve) / standardavvik av score for prøven. Denne oversetter fordelingen av skårer til en fordeling av avvik rundt den sentrale verdien null avvik. </li></ol></li><li> Bin disse Z-score verdier inn i seks grupper (&lt;-2, -2 til -1, -1 - 0, 0-1, 1-2,&gt; 2). </li><li> Beregn antall verdier tildelt i hvert bin og sum for hver bin. Bruk denne verdien, sammen med det totale antall felt, for å beregne en verdi for hver av de seks vinduer som brukes for indeksen. </li><li> Sum disse verdiene og trekker fra den ene til å produsere indeksen mangfold. </li><li> Den diversitetsindeks gir en indikator på spredningen av score rundt gjennomsnittet for en bestemt prøve. Dermed høyere indekser indikerer et bredere spredning av score, eller økt heterogenitet av uttrykk. Omvendt lavere indekser, tyder på mindre variasjon i uttrykk måling og homogent uttrykk i prøven. Dette er illustrert i Figures 2 og 3. </li></ol> Seks. Representant Resultater: Målrettet behandling med relativt lav toksisitet agenter, for eksempel tamoxifen og trastuzumab, er ikke standard vare for eggstokkreft pasienter. Det er god dokumentasjon på at platina-taxan første-linje kjemoterapi er overlegen andre kjemoterapiregimer for eggstokkreft 9-13, og mens 70-80% av pasientene i utgangspunktet svare, de fleste vil tilbakefall og dør av sykdommen. Måling av biomarkører som kan forutsi responsen til alternative behandlingsformer vil være nyttig i valg av individualisert behandling for hver pasient, og siden kjemoterapi utøver utvalg press på en svulst, kan overlevende kreftceller har forskjellige egenskaper og representerer en undergruppe av svulsten før behandlingen; tallfeste dette endringen kan derfor være nyttig. Vi har brukt vår heterogenitet kartlegging tilnærming til ER og HER2 uttrykk i eggstokkreft prøver før og etter kjemoterapi, i Order for å måle kvantitative endringer i uttrykk, og vurdere forholdet mellom biomarkør uttrykk før og etter behandling. Både ER og HER2 demonstrere merket heterogenitet innenfor enkelte svulster, og i enkelte svulster, Simpson indeks endringer etter behandlingen fra relativt høy heterogenitet til lave heterogenitet, representert ved å redusere Simpson indeks score (se figur 2 og 3). Dette støtter tanken om at klonal utvelgelse skjer i respons på cytostatika, enda viktigere, kan dette utnyttes ved hjelp av målrettet terapi mot den gjenværende befolkningen, for bedre å personliggjøre behandling for kreftpasienter. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/3334/3334fig1.jpg" /> Figur 1. Hematoxylin og eosin farget photomicrographs forskjellige områder av samme eggstokkreft viser variable morfologi. (A) x40 mikrofotografiet viser to tilstøtende områder av tumor med varierende morfologi. Høy effekt visninger (x200) avdekker celler med cytoplasmatiske clearing og en solid mønster av vekst i den øvre delen av svulsten (B), mens den nedre delen av vevet (C) har mer homogen eosinofil cytoplasma og en papillær vekst mønster. Dette svulst ville imidlertid være klassifisert som serøs papillær histologisk subtype i forbindelse med videre ledelse. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/3334/3334fig2.jpg" /> Figur 2. Heterogenitet heatmaps av ER protein uttrykk i cytokeratin-positive eggstokkreft vev, før (øvre panel) og etter (nedre panel) terapi. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/3334/3334fig3.jpg" /> Figur 3. Heterogenitet heatmaps av HER2 protein uttrykk i cytokeratin-positive eggstokkreft vev, før (øvre panel) og etter (nedre panel) terapi.

<ol>
	<li>Gutierrez, M. L., Sayagues, J. M., Del Mar, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytogenetic+heterogeneity+of+pancreatic+ductal+adenocarcinomas:+identification+of+intratumoral+pathways+of+clonal+evolution.">Cytogenetic heterogeneity of pancreatic ductal adenocarcinomas: identification of intratumoral pathways of clonal evolution.</a> Histopathology. 58, 486-497 (2011).</li><li>Yachida, S., Jones, S., Bozic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distant+metastasis+occurs+late+during+the+genetic+evolution+of+pancreatic+cancer.">Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer.</a> Nature. 467, 1114-1117 (2010).</li><li>Gutierrez, M. L., Sayagues, J. M., Del Mar, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytogenetic+heterogeneity+of+pancreatic+ductal+adenocarcinomas:+identification+of+intratumoral+pathways+of+clonal+evolution.">Cytogenetic heterogeneity of pancreatic ductal adenocarcinomas: identification of intratumoral pathways of clonal evolution.</a> Histopathology. 58, 486-497 (2011).</li><li>Yachida, S., Jones, S., Bozic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distant+metastasis+occurs+late+during+the+genetic+evolution+of+pancreatic+cancer.">Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer.</a> Nature. 467, 1114-1117 (2010).</li><li>Liu, J., Lau, S. K., Varma, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mapping+of+tumor+heterogeneity+on+clinical+tissue+specimens+with+multiplexed+quantum+dots.">Molecular mapping of tumor heterogeneity on clinical tissue specimens with multiplexed quantum dots.</a> ACS Nano. 4, 2755-2765 (2010).</li><li>Camp, R. L., Chung, G. G., Rimm, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+subcellular+localization+and+quantification+of+protein+expression+in+tissue+microarrays.">Automated subcellular localization and quantification of protein expression in tissue microarrays.</a> Nat. Med. 8, 1323-1327 (2002).</li><li>Simpson, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+biodiversity.">Measurement of biodiversity.</a> Nature. 163, 688-68 (1949).</li><li>Gustavson, M. D., Bourke-Martin, B., Reilly, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+unsupervised+pixel-based+clustering+algorithm+for+compartmentalization+of+immunohistochemical+expression+using+Automated+Quantitative+Analysis.">Development of an unsupervised pixel-based clustering algorithm for compartmentalization of immunohistochemical expression using Automated Quantitative Analysis.</a> Appl. Immunohistochem. Mol. Morphol. 17, 329-337 (2009).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paclitaxel+plus+carboplatin+versus+standard+chemotherapy+with+either+single-agent+carboplatin+or+cyclophosphamide,+doxorubicin,+and+cisplatin+in+women+with+ovarian+cancer:+the+ICON3+randomised+trial.">Paclitaxel plus carboplatin versus standard chemotherapy with either single-agent carboplatin or cyclophosphamide, doxorubicin, and cisplatin in women with ovarian cancer: the ICON3 randomised trial.</a> Lancet. 360, 505-515 (2002).</li><li>McGuire, W. P., Hoskins, W. J., Brady, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclophosphamide+and+cisplatin+compared+with+paclitaxel+and+cisplatin+in+patients+with+stage+III+and+stage+IV+ovarian+cancer.">Cyclophosphamide and cisplatin compared with paclitaxel and cisplatin in patients with stage III and stage IV ovarian cancer.</a> N. Engl. J. Med. 334, 1-6 (1996).</li><li>Muggia, F. M., Braly, P. S., Brady, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+III+randomized+study+of+cisplatin+versus+paclitaxel+versus+cisplatin+and+paclitaxel+in+patients+with+suboptimal+stage+III+or+IV+ovarian+cancer:+a+gynecologic+oncology+group+study.">Phase III randomized study of cisplatin versus paclitaxel versus cisplatin and paclitaxel in patients with suboptimal stage III or IV ovarian cancer: a gynecologic oncology group study.</a> J. Clin. Oncol. 18, 106-115 (2000).</li><li>Piccart, M. J., Bertelsen, K., James, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Randomized+intergroup+trial+of+cisplatin-paclitaxel+versus+cisplatin-cyclophosphamide+in+women+with+advanced+epithelial+ovarian+cancer:+three-year+results.">Randomized intergroup trial of cisplatin-paclitaxel versus cisplatin-cyclophosphamide in women with advanced epithelial ovarian cancer: three-year results.</a> J. Natl. Cancer. Inst. 92, 699-708 (2000).</li><li>Cannistra, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+of+the+ovary.">Cancer of the ovary.</a> N. Engl. J. Med. 351, 2519-2529 (2004).</li><li>Baker, A. F., Dragovich, T., Ihle, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+phosphoprotein+as+a+biological+marker+of+tumor+signaling.">Stability of phosphoprotein as a biological marker of tumor signaling.</a> Clin. Cancer. Res. 11, 4338-4340 (2005).</li><li>Espina, V., Edmiston, K. H., Heiby, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+portrait+of+tissue+phosphoprotein+stability+in+the+clinical+tissue+procurement+process.">A portrait of tissue phosphoprotein stability in the clinical tissue procurement process.</a> Mol. Cell. Proteomics. 7, 1998-2018 (2008).</li><li>Klymkowsky, M. W., Savagner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial-mesenchymal+transition:+a+cancer+researcher's+conceptual+friend+and+foe.">Epithelial-mesenchymal transition: a cancer researcher's conceptual friend and foe.</a> Am. J. Pathol. 174, 1588-1593 (2009).</li><li>Kurrey, N. K., Jalgaonkar, S. P., Joglekar, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Snail+and+slug+mediate+radioresistance+and+chemoresistance+by+antagonizing+p53-mediated+apoptosis+and+acquiring+a+stem-like+phenotype+in+ovarian+cancer+cells.">Snail and slug mediate radioresistance and chemoresistance by antagonizing p53-mediated apoptosis and acquiring a stem-like phenotype in ovarian cancer cells.</a> Stem. Cells. 27, 2059-2068 (2009).</li><li>Creighton, C. J., Li, X., Landis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Residual+breast+cancers+after+conventional+therapy+display+mesenchymal+as+well+as+tumor-initiating+features.">Residual breast cancers after conventional therapy display mesenchymal as well as tumor-initiating features.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 13820-13825 (2009).</li><li>Aitken, S. J., Thomas, J. S., Langdon, S. P., Harrison, D. J., Faratian, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+changes+in+ER,+PR+and+HER2+expression+in+primary+breast+cancer+and+paired+nodal+metastases.">Quantitative analysis of changes in ER, PR and HER2 expression in primary breast cancer and paired nodal metastases.</a> Ann. Oncol. 21, 1254-1261 (2010).</li><li>Sayagues, J. M., Abad, M. M., Melchor, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratumoural+cytogenetic+heterogeneity+of+sporadic+colorectal+carcinomas+suggests+several+pathways+to+liver+metastasis.">Intratumoural cytogenetic heterogeneity of sporadic colorectal carcinomas suggests several pathways to liver metastasis.</a> J. Pathol. 221, 308-319 (2010).</li></ol>

JC, MG, CJ, og CS er ansatte i HistoRx, Inc.

Metoden beskrevet tillater kvantifisering av molekylær heterogenitet i standard formalin-fast, parafin-embedded histologisk deler av tumor materiale. Metoden tillater en verdi som skal tildeles graden av heterogenitet i et vev delen, slik at dette kan da tas i betraktning som en variabel i utvikling av biomarkører og analyse. Mens generelt er det å foretrekke at vevet biomarkører er homogene med hensyn til uttrykk, slik at analysen er mindre mottakelig for prøvetaking feil eller bias, kan det under visse omstendigheter være nyttig å kvantifisere heterogenitet som et parameter. For eksempel, som vist i illustrerende eksempel for ER og HER2, felles biomarkører viser betydelig heterogenitet uttrykksform og det er foreløpig ukjent hvorvidt dette representerer en selvstendig prognostisk eller prediktiv faktor med hensyn til klinisk utfall eller respons på behandling, henholdsvis. Likeledes, som illustrert, kan terapi i seg selv dynamisk endrebestanddel populasjoner av celler, og derfor måling av target berikelse kan være nyttig i guiding behandling beslutninger. Imidlertid er teknikken begrenset av de samme faktorene som begrenser tradisjonell histopatologiske eller biomarkør (som immunhistokjemisk) analyser. Resultatet er avhengig av type, størrelse og kvalitet av vev som blir analysert, og dermed en enkel vev paragraf kan ikke være representativ for hele svulsten. Faktisk kan Simpson indeks være utilbørlig partisk av størrelsen på vev (antall rammer fanget og AQUA score målt). Immunogenisiteten av epitoper som måles kan være gjenstand for ukontrollerbare preanalytiske faktorer som artifactually endre sine uttrykk på tvers av vev delen (som kald iskemi tid, eller lengden på fiksering, og kant gjenstand). Dette er spesielt et problem for fosfor-epitoper, som er notorisk 14 labile, 15. Derfor teknikken kan være bedre egnettil reseksjon prøver snarere enn små biopsier, og opptrådte på flere seksjoner i stedet for bare én. I siste instans kan 3D-imaging teknikker gi en mulighet til å bedre kvantifisere denne parameteren. Teknikken som presenteres kan også være begrenset av biologiske faktorer som variasjon i uttrykk for cytokeratin maskering epitop. Dette kan være spesielt opptatt av i disse kreftformer, blant annet eggstokkreft og brystkreft, som gjennomgår epitelial-til-mesenchymale overgang (EMT) eller er beriket for ikke-epiteliale komponenter eller stamceller 16, som nylig har vist seg å forekomme i kjemoterapi- behandlet eggstokkreft i 17 vitro, og hos brystkreftpasienter i respons på behandling 18. Denne begrensningen kan løses ved hjelp av alternative maskering antistoffer (eller cocktails av antistoffer), som cytokeratin pluss vimentin, som er oppregulert i EMT 16. I tillegg, siden andre komponenter i vevet (den microenvironment), som fibroblaster eller vaskulære endotelceller er også i økende grad angrepet av biologisk terapi, kan teknikken også utvides til å score disse komponentene, med bestemte masker for avdelinger av interesse, for eksempel PECAM / CD31 å farge for vaskulære endotelceller . Selv om tilpasning av Simpson-indeksen har vært brukt som et mål av heterogenitet i gjeldende protokoll grunn av sin enkelhet, kan andre tiltak av heterogenitet brukes, slik som enkle målinger av sentraltendens (gjennomsnitt, varians, median, etc). I tillegg kunne Simpson indeks beregninger bli endret for bedre å passe til en bestemt test befolkning. Bruk av Z-score transformasjoner lar scoring å være mer aktuelt for flere markører siden heterogeniteten er basert på avvik rundt gjennomsnittet for et datasett. Imidlertid kan den totale spekter av scoring være begrenset i denne type transformasjon. Noen design kan være bedre egnetå bare bin selve AQUA score for alle prøver av en bestemt markør sett. Valget av antallet spannene og tidsavgrensninger er også en begrensning i verdiområde som kan føre til, og kan være optimalisert for alternative eksperimentelle design. Vi har brukt ER og HER2 i den aktuelle studien som kandidat biomarkører, siden de er allerede brukt i klinikken, få svar på relevante kliniske spørsmål med hensyn til effekten av målrettet terapi, og er kjent for å vise betydelig heterogenitet og endring i grunnskolen og fjernt sykdom 19. Imidlertid fortsatt optimal markør av heterogenitet skal fastsettes. Andre muligheter kan omfatte cytogenetisk markører for clonality, slik som de tidligere har brukt i interfase FISH studier 20. Tilnærmingen krever videre validering i store, godt kommenterte kliniske kohorter eller kliniske studier for ytterligere å fastslå relevansen av denne parameteren i kreft biologi.

<table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagens </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> ScanScope FL </td><td> Aperio </td><td> ScanScope FL </td><td> Brukes som utstyrt fra leverandør </td></tr><tr><td> Spectrum </td><td> Aperio </td><td> Spectrum </td><td> Konfigurering og katalognummer vil variere om hvordan lokale institusjoner sette opp sin database og IT-struktur. </td></tr><tr><td> AQUAnalysis, i forbindelse med AQUAjustment </td><td> HistoRx </td><td> V2.3 </td><td> Den AQUAjustment Pakken lar AQUAnalysis å bruke bilder lagret i Spectrum. </td></tr><tr><td> HER2 </td><td> Dako </td><td> A0485 </td><td> 1 400 fortynning </td></tr><tr><td> mus anti-pan cytokeratin </td><td> Dako </td><td> M3515 </td><td> 1 av 50 fortynning </td></tr><tr><td> Antistoff fortynningsmiddel </td><td> Dako </td&gt; <td> S0809 </td><td></td></tr><tr><td> Envision goat-kanin HRP </td><td> Dako </td><td> K4003 </td><td></td></tr><tr><td> Protein blokk </td><td> Dako </td><td> X0909 </td><td></td></tr><tr><td> Geit anti-mus Alexa555 </td><td> Invitrogen </td><td> A21422 </td><td></td></tr><tr><td> DAPI montering medium </td><td> Invitrogen </td><td> P36931 </td><td></td></tr><tr><td> Cy5 Tyramide </td><td> HistoRx </td><td> AQ-EMR1-00001 </td><td></td></tr><tr><td> Sequenza farging Senter </td><td> Thermo Scientific Shandon </td><td> 73300001 </td><td> Brukes her for benk-top immunfluorescens flekker </td></tr></tbody></table>

heterogeneity mapping of protein expression in tumors using quantitative immunofluorescence

Morfologiske heterogenitet innenfor den enkelte tumor er godt anerkjent av histopathologists i kirurgisk praksis. Selv om dette ofte tar form av områdene distinkte differensiering inn i anerkjente histologiske subtyper, eller forskjellige patologisk karakter, ofte er det mer subtile forskjeller i fenotype som trosser nøyaktig klassifisering (Figur 1). Til syvende og sist, da morfologi er diktert av den underliggende molekylære fenotypen, områder med synlige forskjeller vil trolig være ledsaget av forskjeller i uttrykket av proteiner som orkestrere cellular funksjon og adferd, og derfor utseende. Betydningen av synlig og usynlig (molekylær) heterogenitet for prognosen er ukjent, men nyere bevis tyder på at, i hvert fall på genetisk nivå, eksisterer heterogenitet i primærtumor 1,2, og noen av disse sub-kloner gi opphav til metastatisk ( og derfor dødelig) sykdom. Dessuten, noen proteiner ermålt som biomarkører fordi de er utsatt for terapi (for eksempel ER og HER2 for tamoksifen og trastuzumab (Herceptin), henholdsvis). Dersom disse proteinene viser varierende uttrykk innenfor en svulst så terapeutisk respons kan også være variabel. Den brukte histopatologiske scoring ordninger for immunhistokjemi verken ignorere eller numerisk homogenisere kvantifisering av protein uttrykk. Tilsvarende, i destruktive teknikker, hvor svulsten prøvene homogenisert (som genekspresjon profilering), kan kvantitativ informasjon bli belyst, men romlig informasjon går tapt. Genetisk heterogenitet kartlegging tilnærminger i bukspyttkjertelkreft har stolt enten på generasjon av en enkelt celle suspensjon 3, eller på macrodissection fire. En fersk studie har brukt kvanteprikker for å kartlegge morfologisk og molekylært heterogenitet i prostata cancer vev 5, som gir bevis for prinsippet om at morfologi og molekylære kartleggingen er mulig, men faller erhort av kvantifisere heterogeniteten. Siden immunhistokjemi er i beste fall er bare semi-kvantitative og underlagt intra-og inter-observatør bias, mer følsom og kvantitative metoder som kreves for å nøyaktig kartlegge og kvantifisere vev heterogenitet in situ. Vi har utviklet og anvendt en eksperimentell og statistisk metode for å systematisk kvantifisere heterogenitet av protein uttrykk i hele vev deler av svulster, basert på Automated Quantitative Analysis (AQUA) system seks. Tissue seksjoner er merket med spesifikke antistoffer rettet mot cytokeratins og mål av interesse, koblet til fluoroforen-merket sekundære antistoffer. Slides er avbildes ved hjelp av en hel-slide fluorescens skanner. Bildene er delt inn i hundrevis til tusenvis av fliser, og hver flis er deretter tildelt en AQUA poengsum som er et mål av protein konsentrasjon i de epiteliale (tumor) komponent av vev. Heatmaps genereres å representere vev uttrykk av proteiner og en heterogenitet poengsum tildelt, ved hjelp av en statistisk mål på heterogenitet opprinnelig brukt i økologi, basert på Simpson biologiske mangfold index 7. Til dags dato har det vært noen forsøk på å systematisk kartlegge og kvantifisere denne variasjonen i tandem med protein uttrykk, i histologiske preparater. Her illustrerer vi den første bruken av metoden anvendt på ER og HER2 biomarkør uttrykk i eggstokkreft. Ved hjelp av denne metoden åpner for å analysere heterogenitet som en uavhengig variabel i studier av biomarkører uttrykk i translasjonell studier, for å fastslå betydningen av heterogenitet i prognose og prediksjon av respons på behandling.

Watch this Scientific Journal Video about Heterogeneity Mapping of Protein Expression in Tumors using Quantitative Immunofluorescence at JoVE.com

Heterogeneity Mapping of Protein Expression in Tumors using Quantitative Immunofluorescence

Her vil vi beskrive en metode for å kvantifisere molekylær heterogenitet i histologiske deler av tumor materiale ved bruk av kvantitative immunfluorescens, bildeanalyse, og et statistisk mål på heterogenitet. Metoden er beregnet for bruk i klinisk utvikling av biomarkører og analyse.

Heterogenitet Kartlegging av Protein Expression i Svulster med Kvantitative immunfluorescens

Morphologic heterogeneity within an individual tumor is well-recognized by histopathologists in surgical practice. While this often takes the form of ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR)

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR qPCR

MikroRNA Detection i prostatakreft ved Kvantitativ Real-time PCR (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process ...

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

Identifisering av<em&gt; Sleeping Beauty</em&gt; Transposon Innsettinger i solide svulster ved hjelp Linker-mediert PCR

Genomic, proteomic, transcriptomic, and epigenomic analyses of human tumors indicate that there are thousands of anomalies within each cancer genome ...

In vitro Organoid Culture of Primary Mouse Colon Tumors

In vitro Organoid Culture of Primary Mouse Colon Tumors

In vitro Organoid Culture of Primary Mouse colontumorer

Several  human and murine colon cancer cell lines have been established, physiologic  integrity of colon tumors such as multiple cell layers, basal-apical ...

The Use of Reverse Phase Protein Arrays (RPPA) to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers

The Use of Reverse Phase Protein Arrays RPPA to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers

Bruk av omvendt fase Protein Arrays (RPPA) til Explore Protein Expression Variasjon innen Individuelle nyre celle kreft

Currently there is no curative treatment for metastatic clear cell renal cell cancer, the commonest variant of the disease. A key factor in this treatment ...

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

I Vivo Optisk Imaging av hjernesvulster og leddgikt Bruke Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent ...

Coordinate Mapping of Hyolaryngeal Mechanics in Swallowing

Koordinere Kartlegging av Hyolaryngeal Mechanics i Svelge

Characterizing hyolaryngeal movement is important to dysphagia research. Prior methods require multiple measurements to obtain one kinematic measurement ...

Quantitative Mass Spectrometric Profiling of Cancer-cell Proteomes Derived From Liquid and Solid Tumors

Kvantitativ Massespektrometrisk Profilering av kreft-celle proteom Derived From Flytende og solide tumorer

In-depth analyses of cancer cell proteomes are needed to elucidate oncogenic pathomechanisms, as well as to identify potential drug targets and diagnostic ...

Clinicopathological Analysis of miRNA Expression in Breast Cancer Tissues by Using miRNA In Situ Hybridization

Clinicopathological Analysis of miRNA Expression in Breast Cancer Tissues by Using miRNA In Situ Hybridization

Clinicopathological Analyse av miRNA uttrykk i Breast Cancer vev ved hjelp miRNA<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering

In this article, we describe a detailed protocol for miRNA detection in breast cancer tissue using in situ hybridization with a digoxigenin-labelled LNA ...