Name: heterogeneity mapping of protein expression in tumors using quantitative immunofluorescence
Uploaded: 2011-10-25T13:00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Heterogeneity Mapping of Protein Expression in Tumors using Quantitative Immunofluorescence at JoVE.com

Detta arbete stöddes delvis av den skotska Funding Council (licensnummer HR07005, <a href="http://www.sfc.ac.uk/">http://www.sfc.ac.uk/</a> ), Medical Research Skottland ( <a href="http://www.medicalresearchscotland.org.uk/">http://www.medicalresearchscotland.org.uk/</a> ), Cancerföreningen Forskning Storbritannien Experimentell cancermedicin Centre ( <a href="http://www.cancerresearchuk.org/">http://www.cancerresearchuk.org/</a> ) och Breakthrough Breast Cancer ( <a href="http://breakthrough.org.uk/">http://breakthrough.org.uk/</a> ).

1. Tissue förberedelse <ol class="lalpha"><li> Microtomy <ol class="lroman"><li> § formalin fast paraffininbäddad tumörvävnad vid 4 ìm tjocklek med hjälp av en roterande mikrotomen. </li><li> Placera delarna på positivt laddade mikroskopiska bilder. </li><li> Inkubera objektglasen i ett 37 ° C ugn över natten. </li></ol></li><li> Förvaring <ol><li> Förvara avsnitt i en -18 ° C till -25 ° C frys, för att förhindra förlust av antigenicitet. </li></ol></li></ol> 2. Immunofluorescens på vävnadssnitt <ol class="lalpha"><li> Avvaxning och rehydrering <ol class="lroman"><li> Dewax bilder i xylen två gånger för 5 min. </li><li> Rehydrera bilder i 99%, 99%, 80%, 50% av etanol och rinnande vatten i 2 min på varje i ordning. </li></ol></li><li> Antigenåtervinning <ol class="lroman"><li> Utför värmen inducerad antigenåtervinning, med 0,15 Citrate mM Natrium, pH 6,0 buffert i en tryckkokare i 5 minuter i microwave. </li><li> Svalna diabilder i 20 min. </li><li> Skölj objektglasen i 0,05% PBST i 5 minuter på rocker. </li></ol></li><li> Blockera förfarande <ol class="lroman"><li> Behandla avsnitt i 3% väteperoxid i 10 min. </li><li> Skölj objektglasen i 0,05% PBST i 5 minuter på rocker. </li><li> Lägg till de avsnitt som Sequenza immunfärgning rack. </li><li> Behandla avsnitt i serum fritt protein kvarteret i 10 min. </li></ol></li><li> Primär antikropp inkubation <ol class="lroman"><li> Inkubera Primär antikropp utspätt till en optimal spädning i Dako Antibody Diluent under 1 timme i rumstemperatur. </li><li> Skölj i 0,05% PBST tre gånger i 5 minuter vardera. </li></ol></li><li> Epitelial mask (Cytokeratin) inkubering <ol class="lroman"><li> Inkubera mus-anti-pan Cytokeratin, utspädd 1:50 i Dako Antibody Diluent över natten vid 4 ° C. </li></ol></li><li> Epitelial mask visualisering <ol class="lroman"><li> Förbered en 1:25 spädning av get anti-mus Alexa555 secondary antikroppar i spätts Envision get-kanin HRP antikropp lösning. Inkubera objektglasen i mörker i 1,5 timmar i rumstemperatur. </li><li> Skölj i 0,05% PBST tre gånger för 5min vardera. </li></ol></li><li> Mål visualisering <ol class="lroman"><li> Överför bilder från Sequenza till fuktkammare. </li><li> Kombinera Target spädningsvätska signalförstärkning (HistoRx badkar E) och Cy5 Tyramide (HistoRx rör F) vid 1:50 koncentration. Vortex att blanda väl. Inkubera objektglasen i mörker i 10 minuter vid rumstemperatur. </li><li> Skölj i 0,05% PBST tre gånger i 5 minuter vardera. </li><li> Torka objektglasen i 80% etanol i 1 min. </li><li> Lufttorka objektglasen i mörkret. </li></ol></li><li> Motfärgning och coverslipping <ol class="lroman"><li> Applicera DAPI monteringsmedium på täckglas och placera täckglasen över vävnadssnitt. </li><li> Torr glider över natten i mörkret. </li><li> Efter att bilderna har torkat, säkert med nagellack ENsäker på lång sikt bevara och hålla i en 4 ° C kylskåp. </li></ol></li></ol> 3. Bild ta med hela avsnittet skanning <ol class="lalpha"><li> Ladda upp till fem bilder i bilden kassett av Aperio ScanScope FL diascanner. </li><li> För varje bild väljer du den allmänna regionen till bilden med hjälp av gränssnittet i ScanScope konsolen. Välj den region som omfattar alla vävnaden i bilden, oavsett färgningsmönstret eller andra observerbara aspekter av provet. </li><li> Använda ScanScope Console, för varje kanal (DAPI, Cy3 och Cy5) fastställa en optimal exponering enligt följande: <ol class="lroman"><li> Välj en region av vävnad att förhöra - detta område bör helst vara i tumören regionen vävnad för att ge bästa representation. </li><li> Använda ScanScope Console exponeringsautomatiken funktionen utvärdera exponeringstid föreslås för varje kanal, tillsammans med bildens fokus. </li><li> Upprepa på upp till 3-5 regioner i varje prov att samarbetanfirm stabiliteten i värde. </li></ol></li><li> Välj ett extra region (vilket framgår av en blå diamant på ScanScope konsolen bilden) från vävnaden, men ändå inom coverslipped regionen i bilden, för att definiera en bakgrund där platta fältet korrigering bilderna kommer att förvärvas för varje filter. </li><li> Granska dessa bilder innan bildtagning. Om bilderna verkar ha höga bakgrund eller andra artefakter bild, bör bilden regionen flyttas och nya bilder förvärvas. </li><li> Den förvärvade digitala bilden bilder laddas upp automatiskt i Aperio Spectrum databasen. </li></ol> 4. AQUA automatiserad bildanalys <ol class="lalpha"><li> Visa den digitala hela glaset bilder i spektrumet databasen och kommentera tumör intressanta områden inom ramen för hela vävnad och färgningsmönstret (er). </li><li> Markera bilden för att analysera med hjälp AQUAnalysis från den digitala bilden listan i Spectrum databasen genom att dubbelklicka på tummenspik bild (alternativt markerar du kryssrutan bredvid bilden och välj sedan &quot;Visa bilder&quot; i menyn längst upp i listan). Detta öppnar automatiskt ImageScope programvara och färg samman bild av vävnadsprov. </li><li> Använd denna programvara för att navigera i bilden med de medföljande verktygen. </li><li> Med hjälp av medföljande H &amp; E (antingen den fysiska bilden eller en kommenterad bild), kommentera regionen ränta på fluorescerande bilden. Flera regioner av intresse, cirklade enskilda områden kan väljas på ett enda prov. Det finns också en &quot;negativ&quot; verktyg som används för att utesluta områden inom ett valt område (dvs skadad vävnad, områden med dålig histologi, icke-tumör områden, skräp, etc.). </li><li> Spara anteckning lagret (s) på bilden. </li><li> Återgå till Spectrum huvudmenyn och markera kryssrutan bredvid den bild som var bara kommenteras. Välj &quot;Analysera&quot; på menyn remsan överst i listan. </li><li> I analysen fönster som kommer upp, SeleCT &quot;HistoRx AQUA Analysis&quot; från rullgardinsmenyn. </li><li> Om det finns flera lager av anteckningar, använda kryssrutorna för att välja lämplig lagret (er) för analys. </li><li> Tryck på &quot;Analyze&quot; knappen när redo att börja. </li><li> Vid denna punkt kommer ett minimerat konsol fönster visas i Aktivitetsfältet i Windows. Detta kommer att visa hur överföringen av bilder från Spectrum databasen till den lokala datorn (&quot;pull&quot; drift). </li><li> När data överförs, kommer AQUAnalysis lanseringen. Användaren kan sedan använda alla interna funktioner i programvaran för att visa, navigera och analysera bilder. </li><li> Den kommenterade regionen bilden från Spectrum-databasen är uppdelat i 512x512 plattor pixlar bilden - som alla kommer att göras individuellt. </li><li> För denna studie var en obevakad AQUA scoring algoritm baserad på data klustring, används 8. I denna algoritm är AQUA poäng genereras enligt följande: <ol class="lroman"><li> Den pan-Cytokeratin bild signal är thresholded ovanstående bakgrund och dessa pixlar används för att definiera en tumör &quot;mask&quot; som sedan används för efterföljande beräkningar. Den höga uttrycka pan-Cytokeratin pixlar definierar också cytoplasmiska / icke-nukleära delar av tumörceller. </li><li> Pixlar med hög signal i DAPI kanalen som ligger inom tumören masken identifieras som kärnkraft i naturen. </li><li> Den klustring algoritmen undersöker också pixlar som har låg intensitet för antingen DAPI färgning eller Cytokeratin uttryck och försök att delvis tillskriva dem till antingen kärnkraft eller cytoplasmiska fack, eller bakgrund. </li><li> När alla pixlar tilldelas en av tumören fack eller bakgrund, intensiteten i signalen från målprotein (ER eller HER2) beräknas sedan inom varje fack och normaliserade till storleken på facken, vilket ger AQUA poäng. </li><li> Bilder som inte hade tillräckligt med tumör representation inte fick (enligt definitionen av de med less än 5% av pixlar som representerar tumör). Dessa regioner producerar också en &quot;Slutresultat&quot; värdet kallas &quot;Underkänd&quot; och kan därför tas bort i senare statistiska analyser. </li><li> Dessutom, om det vid översyn, en operatör identifierat områden som inte var lämpliga för att göra poäng på grund av prov eller artefakter avbildning (t.ex. vikta vävnad, skräp), var de områden redigerad av poäng och producerade en &quot;Slutresultat&quot; kallas &quot;underkänd&quot;. </li></ol></li><li> Resultaten av AQUA poängsättning är tabellerna poäng i samband med varje 512x512 pixel kakel i regionen av intresse inom hela vävnad avsnitt prov. Dessa filer i. CSV-format, kan sedan användas för efterföljande statistisk analys. </li></ol> 5. Statistisk analys: Alla statistiska analyser utförs i SPSS (IBM) <ol><li> Där det är möjligt för stora verksamheter genererar SPSS-filer syntax kod (. SPS) för att utföra uppgifter manipulationer och steg analys. Exempel syntax kod finns som extra filer. </li><li&gt; Läs datafiler till SPSS. Ta bort oanvända variabler i rådata (t.ex. instrument specifika parametrar, AQUA poäng från icke utnyttjade-fack). </li><li> Där regioner har en &quot;Slutresultat&quot; av &quot;underkänd&quot; (se ovan), markera dessa värden som SYSMIS, som tar bort dem från de numeriska analyserna. </li><li> Aggregerade alla data för alla bilder för varje markör (ER eller HER2) till en enda master data in i SPSS-format. Använd denna Master File för alla efterföljande beräkningar. </li><li> Använda en SPSS-syntax-fil (en för varje markör: ER eller HER2 (se filer kompletterande syntax) uppgifter var ytterligare valideras och Simpsons Index mångfald beräknas enligt följande: <ol class="lroman"><li> Generera en mästare analytiskt fil, för att förhindra ändring av master data som tidigare genererade. </li><li> Validera master data ställs mot Rådata som genereras och bilder. </li><li> Utarbeta sammanfattande statistik för AQUA poäng för varje prov (räkna av fält, medelvärdet, median poäng, minimum poäng, maximal poäng, och en standardavvikelse på poäng för prov). </li><li> Kontrollera ett slumpmässigt urval av resultat mot den ursprungliga rådata utdatafiler och mot den råa bilddata poängsätts. </li></ol></li><li> För att generera värme kartbilder (visas i figurerna 2 och 3): <ol class="lroman"><li> &quot;Bin&quot; AQUA poäng data (med &quot;Visual Binning&quot; funktion i SPSS) i åtta individuella nivåer. För ER har kärnvapen poäng används till HER2, var cytoplasmisk poäng använts. </li><li> Härled lådor så att varje bin representerar en lika stor andel av tillgängliga fall från hela datamängden. </li><li> Använd SPSS funktionen &#39;Split File &quot;så att alla efterföljande utgång skulle vara på en&quot; per bild / prov &quot;nivå. </li><li> Tomt varje region (motsvarande en 512x512 kakel) genom sin x, y-koordinater och färg med ett värde motsvarande bin i vilket det tilldelats (se figur 2 och 3). </li></ol></li><li> För att generera heterogenitet poäng, var skriven för att generera en SimpsonsIndex över mångfalden med hjälp av AQUA poäng. <ol class="lroman"><li> Den Simpsons index mångfald, som används här, definieras som: <img alt="Ekvation 1" src="/files/ftp_upload/3334/3334eq1.jpg" /> Där N är det totala antalet poäng / fält som används för ett givet prov och n är antalet poäng / fält i en viss grupp av standardiserade poäng (produceras som beskrivs nedan). </li></ol></li><li> Använd befälhavaren analytiska filen som beskrivs ovan för datakälla. I exemplen, använde alla ER beräkningar den nukleära AQUA poäng och HER2-beräkningar använt cytoplasmiska AQUA poäng. Utför beräkningarna nedan för varje prov / bild. </li><li> Eftersom fluorescens-data gäller varians instabilitet, propagerar så att felet magnitud med intensitet, applicera logaritmisk (bas 2) normalisering till alla AQUA poäng. </li><li> Ytterligare omvandla de normaliserade (logga omvandlas) data till z-(standard) poäng. <ol class="lroman"><li> Z-score omvandling beräknas etts följande: Z = (Aqua poäng - genomsnittet för alla poäng för ett prov) / standardavvikelse poäng för provet. Detta översätter den fördelning av poängen i en fördelning av avvikelser runt den centrala värdet noll avvikelse. </li></ol></li><li> Bin dessa Z-score värden i sex grupper (&lt;-2, -2 - -1, -1 - 0, 0 - 1, 1 - 2,&gt; 2). </li><li> Beräkna antalet värden som tilldelas i varje bin och summa för varje bin. Använd detta värde, tillsammans med det totala antalet fält, för att beräkna ett värde för varje av de sex lådor som används för indexet. </li><li> Summan av dessa värden och subtrahera från en för att producera index för mångfald. </li><li> Mångfalden index ger ett mått på spridningen av poäng kring medelvärdet för ett visst prov. Således högre index visar på en bredare spridning av resultat, eller ökad heterogenitet uttryck. Omvänt, lägre index, visar mindre variation i uttryck mätning och homogent uttryck i provet. Detta illustreras i FigurES 2 och 3. </li></ol> 6. Representativa resultat: Målinriktad behandling med relativt låg toxicitet medel, såsom tamoxifen och trastuzumab, inte är standard vid vård av patienter äggstockscancer. Det finns goda bevis för att platina-taxan första linjens kemoterapi är överlägsen andra kemoterapiregimer för äggstockscancer 9-13, och medan 70-80% av patienter som initialt svarar, de flesta kommer att återfall och dör av sin sjukdom. Mätning av biomarkörer som kan förutsäga svar på alternativa behandlingar skulle vara bra att välja individualiserad terapi för varje patient, och eftersom kemoterapi utövar selektionstryck på en tumör, kan fortleva tumörceller har olika egenskaper och representerar en subpopulation av tumören före behandlingen, kvantifiera denna förändring kan därför vara användbar. Vi tillämpade vår syn heterogenitet kartläggning till ER och HER2-uttryck i prover äggstockscancer före och efter kemoterapi, i Order att mäta kvantitativa förändringar i uttryck och bedöma förhållandet mellan biomarkörer uttryck före och efter terapi. Både ER och HER2 visa märkt heterogenitet inom enskilda tumörer, och i vissa tumörer, Simpsons index förändringar efter terapin från relativt hög heterogenitet till låg heterogenitet, företrädd av minskande Simpsons index poäng (se figur 2 och 3). Detta stöder tanken att klonurvalet sker som svar på cytostatika, ännu viktigare, kan detta utnyttjas med riktad terapi mot den kvarvarande befolkningen, i syfte att bättre anpassa behandlingen för cancerpatienter. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/3334/3334fig1.jpg" /> Figur 1. Hematoxylin och eosin färgade mikrofotografier olika områden i samma äggstockscancer visar varierande morfologi. (A) x40 photomicrograph visar två angränsande områden i tumören med olika morfologi. Hög effekt visningar (x200) avslöjar celler med cytoplasmiska clearing och ett fast mönster av tillväxt i den övre delen av tumören (B), medan den nedre delen av vävnaden (C) har mer homogen eosinofila cytoplasma och en papillär tillväxtmönster. Denna tumör skulle dock klassificeras som serös papillär histologisk subtyp i syfte att ytterligare ledning. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/3334/3334fig2.jpg" /> Figur 2. Heterogenitet heatmaps av ER proteinuttryck i Cytokeratin-positiva äggstockscancer vävnad, före (övre panelen) och efter (undre panelen) terapi. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/3334/3334fig3.jpg" /> Figur 3. Heterogenitet heatmaps av HER2 protein uttryck i Cytokeratin-positiva äggstockscancer vävnad, före (övre panelen) och efter (undre panelen) terapi.

<ol>
	<li>Gutierrez, M. L., Sayagues, J. M., Del Mar, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytogenetic+heterogeneity+of+pancreatic+ductal+adenocarcinomas:+identification+of+intratumoral+pathways+of+clonal+evolution.">Cytogenetic heterogeneity of pancreatic ductal adenocarcinomas: identification of intratumoral pathways of clonal evolution.</a> Histopathology. 58, 486-497 (2011).</li><li>Yachida, S., Jones, S., Bozic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distant+metastasis+occurs+late+during+the+genetic+evolution+of+pancreatic+cancer.">Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer.</a> Nature. 467, 1114-1117 (2010).</li><li>Gutierrez, M. L., Sayagues, J. M., Del Mar, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytogenetic+heterogeneity+of+pancreatic+ductal+adenocarcinomas:+identification+of+intratumoral+pathways+of+clonal+evolution.">Cytogenetic heterogeneity of pancreatic ductal adenocarcinomas: identification of intratumoral pathways of clonal evolution.</a> Histopathology. 58, 486-497 (2011).</li><li>Yachida, S., Jones, S., Bozic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distant+metastasis+occurs+late+during+the+genetic+evolution+of+pancreatic+cancer.">Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer.</a> Nature. 467, 1114-1117 (2010).</li><li>Liu, J., Lau, S. K., Varma, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mapping+of+tumor+heterogeneity+on+clinical+tissue+specimens+with+multiplexed+quantum+dots.">Molecular mapping of tumor heterogeneity on clinical tissue specimens with multiplexed quantum dots.</a> ACS Nano. 4, 2755-2765 (2010).</li><li>Camp, R. L., Chung, G. G., Rimm, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+subcellular+localization+and+quantification+of+protein+expression+in+tissue+microarrays.">Automated subcellular localization and quantification of protein expression in tissue microarrays.</a> Nat. Med. 8, 1323-1327 (2002).</li><li>Simpson, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+biodiversity.">Measurement of biodiversity.</a> Nature. 163, 688-68 (1949).</li><li>Gustavson, M. D., Bourke-Martin, B., Reilly, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+unsupervised+pixel-based+clustering+algorithm+for+compartmentalization+of+immunohistochemical+expression+using+Automated+Quantitative+Analysis.">Development of an unsupervised pixel-based clustering algorithm for compartmentalization of immunohistochemical expression using Automated Quantitative Analysis.</a> Appl. Immunohistochem. Mol. Morphol. 17, 329-337 (2009).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paclitaxel+plus+carboplatin+versus+standard+chemotherapy+with+either+single-agent+carboplatin+or+cyclophosphamide,+doxorubicin,+and+cisplatin+in+women+with+ovarian+cancer:+the+ICON3+randomised+trial.">Paclitaxel plus carboplatin versus standard chemotherapy with either single-agent carboplatin or cyclophosphamide, doxorubicin, and cisplatin in women with ovarian cancer: the ICON3 randomised trial.</a> Lancet. 360, 505-515 (2002).</li><li>McGuire, W. P., Hoskins, W. J., Brady, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclophosphamide+and+cisplatin+compared+with+paclitaxel+and+cisplatin+in+patients+with+stage+III+and+stage+IV+ovarian+cancer.">Cyclophosphamide and cisplatin compared with paclitaxel and cisplatin in patients with stage III and stage IV ovarian cancer.</a> N. Engl. J. Med. 334, 1-6 (1996).</li><li>Muggia, F. M., Braly, P. S., Brady, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+III+randomized+study+of+cisplatin+versus+paclitaxel+versus+cisplatin+and+paclitaxel+in+patients+with+suboptimal+stage+III+or+IV+ovarian+cancer:+a+gynecologic+oncology+group+study.">Phase III randomized study of cisplatin versus paclitaxel versus cisplatin and paclitaxel in patients with suboptimal stage III or IV ovarian cancer: a gynecologic oncology group study.</a> J. Clin. Oncol. 18, 106-115 (2000).</li><li>Piccart, M. J., Bertelsen, K., James, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Randomized+intergroup+trial+of+cisplatin-paclitaxel+versus+cisplatin-cyclophosphamide+in+women+with+advanced+epithelial+ovarian+cancer:+three-year+results.">Randomized intergroup trial of cisplatin-paclitaxel versus cisplatin-cyclophosphamide in women with advanced epithelial ovarian cancer: three-year results.</a> J. Natl. Cancer. Inst. 92, 699-708 (2000).</li><li>Cannistra, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+of+the+ovary.">Cancer of the ovary.</a> N. Engl. J. Med. 351, 2519-2529 (2004).</li><li>Baker, A. F., Dragovich, T., Ihle, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+phosphoprotein+as+a+biological+marker+of+tumor+signaling.">Stability of phosphoprotein as a biological marker of tumor signaling.</a> Clin. Cancer. Res. 11, 4338-4340 (2005).</li><li>Espina, V., Edmiston, K. H., Heiby, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+portrait+of+tissue+phosphoprotein+stability+in+the+clinical+tissue+procurement+process.">A portrait of tissue phosphoprotein stability in the clinical tissue procurement process.</a> Mol. Cell. Proteomics. 7, 1998-2018 (2008).</li><li>Klymkowsky, M. W., Savagner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial-mesenchymal+transition:+a+cancer+researcher's+conceptual+friend+and+foe.">Epithelial-mesenchymal transition: a cancer researcher's conceptual friend and foe.</a> Am. J. Pathol. 174, 1588-1593 (2009).</li><li>Kurrey, N. K., Jalgaonkar, S. P., Joglekar, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Snail+and+slug+mediate+radioresistance+and+chemoresistance+by+antagonizing+p53-mediated+apoptosis+and+acquiring+a+stem-like+phenotype+in+ovarian+cancer+cells.">Snail and slug mediate radioresistance and chemoresistance by antagonizing p53-mediated apoptosis and acquiring a stem-like phenotype in ovarian cancer cells.</a> Stem. Cells. 27, 2059-2068 (2009).</li><li>Creighton, C. J., Li, X., Landis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Residual+breast+cancers+after+conventional+therapy+display+mesenchymal+as+well+as+tumor-initiating+features.">Residual breast cancers after conventional therapy display mesenchymal as well as tumor-initiating features.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 13820-13825 (2009).</li><li>Aitken, S. J., Thomas, J. S., Langdon, S. P., Harrison, D. J., Faratian, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+changes+in+ER,+PR+and+HER2+expression+in+primary+breast+cancer+and+paired+nodal+metastases.">Quantitative analysis of changes in ER, PR and HER2 expression in primary breast cancer and paired nodal metastases.</a> Ann. Oncol. 21, 1254-1261 (2010).</li><li>Sayagues, J. M., Abad, M. M., Melchor, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratumoural+cytogenetic+heterogeneity+of+sporadic+colorectal+carcinomas+suggests+several+pathways+to+liver+metastasis.">Intratumoural cytogenetic heterogeneity of sporadic colorectal carcinomas suggests several pathways to liver metastasis.</a> J. Pathol. 221, 308-319 (2010).</li></ol>

JC, MG, CJ, och CS är anställda av HistoRx, Inc.

Metoden beskrivs här tillåter kvantifiering av molekylära heterogenitet i standard formalinfixerade, paraffininbäddade histologisk delar av tumörvävnad. Metoden medger ett värde som ska tilldelas graden av heterogenitet i en vävnad avsnitt, så att denna sedan kan beaktas som en variabel i biomarkör utveckling och analys. I allmänhet är det bättre att vävnaden biomarkörer är homogena med avseende på uttryck, så att analysen är mindre känslig för urvalsfel eller partiskhet, kan det under vissa omständigheter vara användbart att kvantifiera heterogenitet som en parameter. Till exempel som visas i belysande exempel för ER och HER2, gemensamma biomarkörer uppvisar betydande heterogenitet uttryck och det är för närvarande okänt om detta är en oberoende prognostisk eller prediktiv faktor med avseende på kliniska resultat eller svar på terapi, respektive. På samma sätt som bilden visar, kan terapi sig ändra dynamisktkonstituerande populationer av celler, och därmed mätning av målet anrikning kan vara användbara i att vägleda behandlingen beslut. Dock är den teknik begränsas av samma faktorer som begränsar traditionella histopatologiska eller biomarkör (t.ex. immunhistokemiska) analyser. Resultatet är beroende på typ, storlek och kvaliteten på vävnaden som analyseras, och därför en enda vävnad paragraf får inte vara representativ för hela tumören. I själva verket kan Simpsons index i onödan påverkade av storleken på vävnad (antal bilder fångade och Aqua poäng uppmätts). Immunogenicitet av epitoper som mäts kan vara föremål för okontrollerbar pre-analytiska faktorer som artifactually förändrar sitt uttryck över vävnaden avsnittet (som kall ischemi tid, eller längden till upptagning, och kant artefakt). Detta är särskilt ett problem för fosfor-epitoper, som är notoriskt instabilt 14, 15. Därför tekniken kan vara bättre lämpadetill resektion exemplar snarare än små biopsier, och utförs på flera avsnitt i stället för bara en. Ytterst kan 3D avbildningstekniker ger en möjlighet att bättre kvantifiera denna parameter. Tekniken som presenteras kan också begränsas av biologiska faktorer, såsom variation i uttryck av Cytokeratin maskering epitop. Detta kan vara särskilt angeläget i dessa cancerformer, bland annat äggstockscancer och bröstcancer, som genomgår epitelceller till mesenkymala övergång (EMT) eller anrikas för icke-epitelceller komponenter eller stamceller 16, vilket nyligen visats förekomma vid kemoterapi- behandlad äggstockscancer in vitro-17 och i bröstcancer patienter med svar på behandlingen 18. Denna begränsning kan övervinnas med hjälp av alternativa maskering antikroppar (eller cocktails av antikroppar), som Cytokeratin plus vimentin, som uppregleras i EMT 16. Dessutom, eftersom andra delar av vävnad (MICroenvironment), såsom fibroblaster eller vaskulär endotelcellerna också allt oftare måltavla för biologiska behandlingsmetoder, kan tekniken också utvidgas till att göra mål dessa komponenter med specifika masker för fack intresse, såsom PECAM / CD31 att färga för vaskulära endotelceller . Även anpassning av Simpsons index har använts som ett mått på heterogenitet i det nuvarande protokollet på grund av dess enkelhet, skulle andra åtgärder av heterogenitet användas, såsom enkla mätningar av central tendens (medelvärde, varians, median, etc). Dessutom kunde Simpsons indexberäkningen modifieras för att bättre passa ett visst test befolkning. Användningen av Z-score transformationer ger poäng att vara mer tillämpliga för flera markörer eftersom heterogenitet är baserad på avvikelser kring medelvärdet för en datamängd. Däremot kan den totala sortimentet av scoring vara begränsat i denna typ av omvandling. Vissa konstruktioner kan vara bättre lämpadeatt helt enkelt bin själva AQUA poäng för alla prover av en viss markör set. Valet av antal lådor och cutoffs är också en begränsning i de värden som kan orsaka och kan optimeras för alternativa experimentell design. Vi har använt ER och HER2 i den aktuella studien som kandidat biomarkörer, eftersom de redan används i kliniken, hjälpa till att besvara relevanta kliniska frågeställningar med avseende på effektiviteten av riktade behandlingar, och är kända för att uppvisa betydande olikheter och förändring i grundskolan och fjärran sjukdom 19. Dock fortfarande den optimala markör för heterogenitet som skall fastställas. Andra möjligheter kan omfatta cytogenetisk markörer för clonality, såsom de som tidigare använts i interfas FISH studier 20. Den metod som kräver ytterligare validering i stora, väl kommenterad kliniska kohorter eller kliniska prövningar i syfte att ytterligare fastställa relevansen av denna parameter i cancer biologi.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagensets namn </td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> ScanScope FL </td><td> Aperio </td><td> ScanScope FL </td><td> Används som utrustas från leverantör </td></tr><tr><td> Spectrum </td><td> Aperio </td><td> Spectrum </td><td> Konfiguration och katalog siffrorna varierar på hur lokala institutioner som inrättats deras databas och IT-struktur. </td></tr><tr><td> AQUAnalysis, i samband med AQUAjustment </td><td> HistoRx </td><td> V2.3 </td><td> Den AQUAjustment paket tillåter AQUAnalysis att använda bilder som lagrats i Spectrum. </td></tr><tr><td> HER2 </td><td> Dako </td><td> A0485 </td><td> 1 på 400 utspädning </td></tr><tr><td> mus-anti-pan Cytokeratin </td><td> Dako </td><td> M3515 </td><td> 1 av 50 utspädning </td></tr><tr><td> Antibody Diluent </td><td> Dako </td&gt; <td> S0809 </td><td></td></tr><tr><td> Envision get-kanin HRP </td><td> Dako </td><td> K4003 </td><td></td></tr><tr><td> Protein-block </td><td> Dako </td><td> X0909 </td><td></td></tr><tr><td> Get anti-mus Alexa555 </td><td> Invitrogen </td><td> A21422 </td><td></td></tr><tr><td> DAPI monteringsmedium </td><td> Invitrogen </td><td> P36931 </td><td></td></tr><tr><td> Cy5 Tyramide </td><td> HistoRx </td><td> AQ-EMR1-00001 </td><td></td></tr><tr><td> Sequenza immunfärgning Center </td><td> Thermo Scientific Shandon </td><td> 73300001 </td><td> Används här för bordsskop immunofluorescens färgning </td></tr></tbody></table>

heterogeneity mapping of protein expression in tumors using quantitative immunofluorescence

Morfologiska heterogenitet inom en enskild tumör är väl erkänd av histopathologists vid kirurgiska praktiken. Även om detta ofta sker i form av områden med tydliga differentiering till erkänd histologiska subtyper, eller olika patologiska klass, ofta finns det mer subtila skillnader i fenotyp som trotsar korrekt klassificering (figur 1). I slutändan, eftersom morfologi dikteras av den underliggande molekylära fenotyp, områden med synliga skillnader kommer sannolikt att åtföljas av skillnader i uttrycket av proteiner som orkestrera cellulär funktion och beteende, och därför utseende. Betydelsen av synliga och osynliga (molekylära) heterogenitet för prognosen är okänd, men senare tyder på att, åtminstone på genetisk nivå, finns heterogenitet i den primära tumören 1,2, och några av dessa sub-kloner ge upphov till metastaser ( och därför dödlig) sjukdom. Dessutom är vissa proteinermätt som biomarkörer för att de är målen för terapi (t.ex. ER-och HER2 för tamoxifen och trastuzumab (Herceptin), respektive). Om dessa proteiner visa rörliga uttryck inom en tumör då terapeutisk Åtgärderna kan också variera. Den utbredda histopatologiska scoring system för immunohistokemi ignorera heller, eller numeriskt homogenisera kvantifiering av proteinuttryck. Även i destruktiva metoder, där tumören proverna homogeniseras (såsom profilering av genuttryck), kan kvantitativ information belysas, men geografisk information går förlorad. Genetisk heterogenitet kartläggning metoder i pankreascancer har förlitat sig antingen på generering av en enda cellsuspensionen 3, eller på macrodissection 4. En färsk studie har använt kvantprickar för att kartlägga morfologiska och molekylära heterogenitet i prostatacancer vävnad 5, som ger bevis på principen att morfologi och molekylära kartläggning är genomförbart, men faller sHort kvantifiera heterogenitet. Eftersom immunohistokemi är i bästa fall bara är semi-kvantitativa och föremål för intra-och inter-observatör bias, känsligare och kvantitativa metoder krävs för att exakt kartlägga och kvantifiera vävnad heterogenitet på plats. Vi har utvecklat och tillämpat en experimentella och statistiska metoder för att systematiskt kvantifiera heterogenitet proteinuttryck i hela vävnadssnitt av tumörer, baserat på Automated kvantitativ analys (Aqua) System 6. Vävnadssnitt är märkta med specifika antikroppar riktade mot cytokeratins och mål av intresse, kopplad till fluoroforen-märkta sekundära antikroppar. Diabilder är avbildas med en hel-bild fluorescens skanner. Bilderna är uppdelade i hundratals till tusentals kakel, och varje kakel tilldelas sedan en AQUA poäng vilket är ett mått av protein koncentration inom epitelceller (tumör) del av vävnaden. Heatmaps genereras för att representera vävnad uttryck av proteiner och en heterogenitet poäng tilldelas, med hjälp av ett statistiskt mått av heterogenitet som ursprungligen användes i ekologi, baserat på Simpsons index för biologisk mångfald 7. Hittills har inga försök att systematiskt kartlägga och kvantifiera detta variabilitet i takt med protein uttryck i histologiska preparat. Här illustrerar vi den första användningen av metoden tillämpas på ER och HER2 biomarkör uttryck i äggstockscancer. Med denna metod banar väg för analys av heterogenitet som en oberoende variabel i studier av biomarkör uttryck inom den överbryggande studier för att fastställa betydelsen av heterogenitet i prognos och prediktion av respons på behandlingen.

Watch this Scientific Journal Video about Heterogeneity Mapping of Protein Expression in Tumors using Quantitative Immunofluorescence at JoVE.com

Heterogeneity Mapping of Protein Expression in Tumors using Quantitative Immunofluorescence

Här beskriver vi en metod för att kvantifiera molekylära heterogenitet i histologiska avsnitt av tumörvävnad med hjälp av kvantitativa immunofluorescens, bildanalys och ett statistiskt mått av heterogenitet. Metoden är avsedd för användning i kliniska biomarkörer utveckling och analys.

Heterogenitet Kartläggning av Protein Expression i tumörer med hjälp av kvantitativa Immunofluorescens

Morphologic heterogeneity within an individual tumor is well-recognized by histopathologists in surgical practice. While this often takes the form of ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

Fastställande och spridning av mänskliga Retinoblastom Tumörer i Immune deficienta möss

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Utvärdering av nanopartiklar Upptag i tumörer i realtid med hjälp Intravital Imaging

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR)

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR qPCR

MikroRNA Detektion av prostatatumörer genom kvantitativ realtids-PCR (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process ...

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

Identifiering av<em&gt; Törnrosa</em&gt; Transposoninsättningar i solida tumörer med Linker-medierad PCR

Genomic, proteomic, transcriptomic, and epigenomic analyses of human tumors indicate that there are thousands of anomalies within each cancer genome ...

In vitro Organoid Culture of Primary Mouse Colon Tumors

In vitro Organoid Culture of Primary Mouse Colon Tumors

In vitro organoid Kultur av primära tumörer musändtarm

Several  human and murine colon cancer cell lines have been established, physiologic  integrity of colon tumors such as multiple cell layers, basal-apical ...

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

In Vivo Optisk avbildning av hjärntumörer och Artrit med fluorescerande SAPC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent ...

Coordinate Mapping of Hyolaryngeal Mechanics in Swallowing

Samordna Kartläggning av Hyolaryngeal Mechanics att svälja

Characterizing hyolaryngeal movement is important to dysphagia research. Prior methods require multiple measurements to obtain one kinematic measurement ...

Quantitative Mass Spectrometric Profiling of Cancer-cell Proteomes Derived From Liquid and Solid Tumors

Kvantitativ Masspektrometrisk Profilering av cancer-cell proteom Derived From Liquid och solida tumörer

In-depth analyses of cancer cell proteomes are needed to elucidate oncogenic pathomechanisms, as well as to identify potential drug targets and diagnostic ...

Clinicopathological Analysis of miRNA Expression in Breast Cancer Tissues by Using miRNA In Situ Hybridization

Clinicopathological Analysis of miRNA Expression in Breast Cancer Tissues by Using miRNA In Situ Hybridization

Klinisk-patologisk analys av miRNA uttryck i bröstcancer vävnader med hjälp av miRNA<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering

In this article, we describe a detailed protocol for miRNA detection in breast cancer tissue using in situ hybridization with a digoxigenin-labelled LNA ...

Quantitative Mapping of Specific Ventilation in the Human Lung using Proton Magnetic Resonance Imaging and Oxygen as a Contrast Agent

Kvantitativ kart läggning av specifik ventilation i Human lung med Proton Magnetic resonanstomografi och syre som kontrast medel

Specific ventilation imaging (SVI) is a functional magnetic resonance imaging technique capable of quantifying specific ventilation &#8213; the ratio of ...