Name: multiplex detection of bacteria in complex clinical and environmental samples using oligonucleotide-coupled fluorescent microspheres
Uploaded: 2011-10-23T14:00:00
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Wir danken Alberto Severini und Vanessa Goleski um Hilfe bei der Assay-Entwicklung und kritische Kommentare zu diesem Manuskript. Diese Arbeit wurde von der Public Health Agency of Kanada und der Industrial Research Assistance Program (National Research Council in Kanada) finanziert. Zusätzliche Unterstützung wurde von der University of Saskatchewan Publication Fund erhalten.

Diese Methode wurde in der Forschung in Dumonceaux et al verwendet. J. Clin. . Microbiol 47, 4067-4077, doi: 10.1128/jcm.00112-09 (2009). Eine schematische Darstellung des gesamten Verfahrens ist in Abbildung 1 dargestellt. 1. Bead-Kopplung Dies beschreibt die Methoden zur Kopplung Oligonukleotid-Sonden für Polystyrol Luminex-Beads (siehe Tabelle 2) verwendet werden. Volumes sind etwas für die Evaluierung neuer Fängersonden ...

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	<li>Hale, L. P., Swidsinski, A., Mendling, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria+associated+with+bacterial+vaginosis.">Bacteria associated with bacterial vaginosis.</a> N. Engl. J. Med. 354, 202-203 (2006).</li><li>Hay, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+in+the+littoral+zone:+lactobacilli+losing+the+plot.">Life in the littoral zone: lactobacilli losing the plot.</a> Sex. Transm. Infect. 81, 100-102 (2005).</li><li>Morris, M., Nicoll, A., Simms, I., Wilson, J., Catchpole, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+vaginosis:+a+public+health+review.">Bacterial vaginosis: a public health review.</a> Brit. J. Obstet. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliability+of+diagnosing+bacterial+vaginosis+is+improved+by+a+standardized+method+of+gram+stain+interpretation.">Reliability of diagnosing bacterial vaginosis is improved by a standardized method of gram stain interpretation.</a> J. Clin. Microbiol. 29, 297-301 (1991).</li><li>Ison, C. A., Hay, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+simplified+grading+of+Gram+stained+vaginal+smears+for+use+in+genitourinary+medicine+clinics.">Validation of a simplified grading of Gram stained vaginal smears for use in genitourinary medicine clinics.</a> Sex. Transm. Infect. 78, 413-415 (2002).</li><li>Money, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+laboratory+diagnosis+of+bacterial+vaginosis.">The laboratory diagnosis of bacterial vaginosis.</a> Can. J. Infect. Dis. Med. Microbiol. 16, 77-79 (2005).</li><li>Schellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrosequencing+of+the+chaperonin-60+universal+target+as+a+tool+for+determining+microbial+community+composition.">Pyrosequencing of the chaperonin-60 universal target as a tool for determining microbial community composition.</a> Appl. Environ. Microbiol. 75, 2889-2898 (2009).</li><li>Spear, G. 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Microbiol. 47, 4067-4077 (2009).</li><li>Molenkamp, R., van der Ham, A., Schinkel, J., Beld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+of+five+different+DNA+targets+by+real-time+Taqman+PCR+using+the+Roche+LightCycler480:+Application+in+viral+molecular+diagnostics.">Simultaneous detection of five different DNA targets by real-time Taqman PCR using the Roche LightCycler480: Application in viral molecular diagnostics.</a> J. Virol. Meth. 141, 205-211 (2007).</li><li>Nikiforov, T. T., Rendle, R. B., Kotewicz, M. L., Rogers, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+phosphorothioate+primers+and+exonuclease+hydrolysis+for+the+preparation+of+single-stranded+PCR+products+and+their+detection+by+solid-phase+hybridization.">The use of phosphorothioate primers and exonuclease hydrolysis for the preparation of single-stranded PCR products and their detection by solid-phase hybridization.</a> PCR. Methods. Appl. 3, 285-291 (1994).</li><li>Hill, J. E., Penny, S. L., Crowell, K. G., Goh, S. H., Hemmingsen, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cpnDB:+A+Chaperonin+Sequence+Database.">cpnDB: A Chaperonin Sequence Database.</a> Genome. Res. 14, 1669-1675 (2004).</li><li>Bradshaw, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+association+of+Atopobium+vaginae+and+Gardnerella+vaginalis+with+bacterial+vaginosis+and+recurrence+after+oral+metronidazole+therapy.">The association of Atopobium vaginae and Gardnerella vaginalis with bacterial vaginosis and recurrence after oral metronidazole therapy.</a> J. Infect. Dis. 194, 828-836 (2006).</li><li>Dumonceaux, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enumeration+of+specific+bacterial+populations+in+complex+intestinal+communities+using+quantitative+PCR+based+on+the+chaperonin-60+target.">Enumeration of specific bacterial populations in complex intestinal communities using quantitative PCR based on the chaperonin-60 target.</a> J. Microbiol. Meth. 64, 46-62 (2006).</li></ol>

Die Spezifität des Signals Generation von entscheidender Bedeutung ist, Sie müssen sicher sein, dass das Signal beobachtet reflektiert wirklich den Nachweis von Amplikon aus diesem Organismus erzeugt. Software wie PrimerPlex (Premier Biosoft) kann helfen, Sonden, die effizient hybridisieren Design, aber sie kann oder auch nicht, um Nicht-Zielarten cross-Hybridisierung. Als universelle PCR-Primer verwendet werden, wie in diesem Protokoll beschrieben, ist es wichtig zu bedenken, dass das Amplifikat generiert alle Organi...

<table border="1"><tbody><tr><td> Oligonukleotid-Namen </td><td> Firma </td><td> Sequenz 1 </td></tr><tr><td> H279BP </td><td rowspan="3"> Invitrogen, IDT, oder andere </td><td> Biotin-OEFO GAIIIIGCIGGIGAYGGIACIACIAC </td></tr><tr><td> H280 </td><td> YKIYKITCICCRAAICCIGGIGCYTT </td></tr><tr><td> H1612BP </td><td> Biotin-OEFO GAIIIIGCIGGYGACGGYACSACSAC </td></tr><tr><td> H1613 </td><td></td><td> CGRCGRTCRCCGAAGCCSGGIGCCTT </td></tr><tr><td colspan="3"> 1O, Phosphorothioat-C, E, Phosphorothioat-G, F, Phosphorothioat-A; I, Inosin, Y, C oder T; R, A oder G, K, T oder G, S, C oder G. </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Sequenzen der Oligonucleotide für den universellen cpn60 PCR. <table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes</td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> 1-Ethyl-3-(3-dimethylamiopropyl) carbodiimid HCl (EDC) </td><td> Durchstechen </td><td> 22980 </td><td></td></tr><tr><td> Fluoreszierende Polystyrol-Kügelchen: MICROPLEX Microspheres (Luminex) oder Bio-Plex COOH Perle (Bio-Rad) </td><td> Luminex oder Bio-Rad </td><td> Bio-Rad: 171-506xxx wobei xxx entspricht der Raupe Kennung </td><td> Magnetic Beads sind immer für Oligonukleotid-Kopplung zur Verfügung und kann gewisse Vorteile bieten. Haben Sie nicht von diesen Autoren versucht worden. </td></tr><tr><td> Fänger-Oligonukleotide (5 &#39;Amino C12 modifiziert) </td><td> Invitrogen, IDT, oder andere </td><td> verschiedene </td><td> Entsalzt Reinheitsgrad ist akzeptabel. Sequenzen der Fängersonden zur Vaginaltupfer charakterisieren, sind in dem Manuskript, an dem dieses Protokoll 13 basiert zur Verfügung gestellt. </td></tr><tr><td> T7Exonuklease </td><td> New England Biolabs </td><td> M0263S </td><td></td></tr><tr><td> Streptavidin-R-Phycoerythrin (SA-PE) </td><td> Invitrogen </td><td> S-866 </td><td> Achten Sie darauf, hohe Reinheit SA-PE zu erhalten; diesem Katalog-Nummer wird empfohlen </td></tr><tr><td> Schutzrohr 96-Well-PCR-Platten </td><td> Fischer </td><td> CS006509 </td><td> passen in beiden 96-well Thermocycler und BioPlex Maschine </td></tr><tr><td> Schutzrohr Dichtmatte </td><td> Fischer </td><td> CS006555 </td><td> Kann wieder verwendet werden; abwaschen mit Seifenwasser, gut spülen und trocknen </td></tr><tr><td> 5M TMAC </td><td> Sigma </td><td> T3411 </td><td></td></tr><tr><td> Bio-Plex oder Luminex-Gerät </td><td> Bio-Rad oder Luminex </td><td> Bio-Rad: 171-000201 </td><td></td></tr><tr><td> PrimerPlex Software für Design der Sonde </td><td> Premier Biosoft </td><td> www.premierbiosoft.com </td><td> Empfohlen für Luminex-Sonde deZeichen, obwohl auch andere Software-Plattformen verwendet werden kann </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Reagenzien und Geräten. <table border="1"><tbody><tr><td> Komponente </td><td> ul / Test </td><td> μl/100 Assays </td><td> Endkonzentration </td></tr><tr><td> 10x PCR-Puffer (Invitrogen) </td><td> 5 </td><td> 500 </td><td> 1x </td></tr><tr><td> 50 mM MgCl 2 (Invitrogen) </td><td> 2,5 </td><td> 250 </td><td> 2,5 mM </td></tr><tr><td> 10 mM dNTP </td><td> 1 </td><td> 100 </td><td> 0,2 mM jedes </td></tr><tr><td> H279BP, 25 uM </td><td> 0,25 </td><td> 25 </td><td> 375 nm </td></tr><tr><td> H1612BP, 25 uM </td><td> 0,75 </td><td> 75 </td><td> 125 nM </td></tr><tr><td> H280, 25 uM </td><td> 0,25 </td><td> 25 </td><td> 375 nm </td></tr><tr><td> H1613,25 uM </td><td> 0,75 </td><td> 75 </td><td> 125 nM </td></tr><tr><td> Wasser </td><td> 34 </td><td> 3400 </td><td> --- </td></tr><tr><td> Totals </td><td> 44,5 </td><td> 4450 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 3. Empfohlene Mischungen für die PCR mit modifizierten cpn60 UT Primer (Tabelle 1). Der Test ist bis zum 5 ul der Template-DNA und 0,5 ul (2,5 U) Taq DNA Polymerase (Invitrogen) gesetzt. Normalerweise großen Mengen hergestellt werden (z. B. ausreichend für 100 Tests) und bei -20 ° C.

multiplex detection of bacteria in complex clinical and environmental samples using oligonucleotide-coupled fluorescent microspheres

Bakterielle Vaginose (BV) ist ein immer wiederkehrendes polymikrobiellen Syndrom, das durch einen Wechsel in die &quot;normale&quot; Mikroflora von einer Mikroflora durch eine Reihe von Bakterienarten, darunter Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae dominiert Lactobacillus-dominiert, und andere 1-3 charakterisiert ist. Dieser Zustand ist mit einer Reihe von negativen gesundheitlichen Folgen, einschließlich HIV Erwerb 4 zugeordnet, und es kann schwierig sein, klinisch 5 zu verwalten. Darüber hinaus hat Diagnose der BV über die Verwendung der Gramfärbung von vaginalen Abstrich Abstriche, die auf verschiedenen numerischen Kriterien 6,7 erzielt wird, sind verlassen. Während diese Diagnose ist einfach, kostengünstig und gut geeignet, um mit beschränkten Ressourcen, kann er von Problemen im Zusammenhang mit subjektiven Interpretationen und es gibt nicht ein detailliertes Profil der Zusammensetzung der vaginalen Mikroflora 8 leiden. Aktuelle deep sequencing Bemühungen haben eine reiche, vielfältige vaginale Mikroflora mit der geoffenbartendeutliche Unterschiede zwischen den Proben von Personen, die mit BV im Vergleich zu denjenigen Personen, die als normal 9,10 sind, die bei der Identifizierung einer Reihe von potenziellen Zielen für die molekulare Diagnostik der BV 11,12 geführt hat diagnostiziert werden übernommen. Diese Studien haben eine Fülle von nützlichen Informationen zur Verfügung gestellt, aber tief-Sequenzierung ist noch nicht praktisch wie ein diagnostisches Verfahren in einer klinischen Umgebung. Wir haben vor kurzem ein Verfahren zur schnellen Profilierung der vaginalen Mikroflora in einem Multiplex-Format Verwendung von Oligonukleotid-gekoppelte fluoreszierende Kügelchen mit Erkennung auf einem Luminex-Plattform 13 beschrieben. Diese Methode, wie aktuelle Gramfärbung-basierte Methoden, ist eine schnelle und einfache, aber fügt den zusätzlichen Vorteil der Nutzung molekularer Erkenntnisse aus der Sequenzierung Studien in Sonde Design. Diese Methode bietet daher eine Möglichkeit, die wichtigsten Mikroorganismen, die in einer vaginalen Abstrich, mit dem BV mit hoher Spezifität und Sensitivität comp diagnostizieren können, werden ProfileARED auf Gram-Färbung, während die Bereitstellung zusätzlicher Informationen über die Arten Präsenz und Fülle in einem semi-quantitative und schnelle Weise. Das Multiplex-Verfahren ist erweiterbar und über den Bereich der aktuellen quantitative PCR-Assays für bestimmte Organismen, die derzeit auf 5 oder 6 verschiedene Tests in einer einzigen Probe 14 ist begrenzt. Wichtig ist, dass das Verfahren nicht auf den Nachweis von Bakterien in Vaginaltupfer begrenzt und kann leicht angepasst werden, um schnell Profil nahezu jede mikrobielle Gemeinschaft von Interesse. Zum Beispiel haben wir vor kurzem damit begonnen, diese Methode auf die Entwicklung von Diagnose-Tools gelten für den Einsatz in Kläranlagen.

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Multiplex Detection of Bacteria in Complex Clinical and Environmental Samples using Oligonucleotide-coupled Fluorescent Microspheres

Wir beschreiben ein Multiplex-Verfahren für den Nachweis von Mikroorganismen in einer Probe mit Oligonukleotid-gekoppelte fluoreszierende Kügelchen. Amplicon aus allen Organismen in einer Probe ist es, ein Gremium von Sonde-gekoppelten Beads hybridisiert. Ein Luminex oder Bio-Plex Gerät wird verwendet, um jede Perle für Perle Art und Hybridisierungssignal Abfrage.

Multiplex Nachweis von Bakterien in komplexen Clinical and Environmental Proben mit Oligonukleotid-gekoppelten Fluoreszenz-Mikrosphären

Bacterial vaginosis (BV) is a recurring polymicrobial syndrome that is characterized by a change in the "normal" microbiota from Lactobacillus-dominated ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

Mit einem Pan-Viral Microarray-Assay (Virochip) zur klinischen Proben, die für virale Erreger Bildschirm

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Use of Fluorescent Immuno-Chemistry for the detection of Edwardsiella ictaluri in channel catfish (I. punctatus) samples

Use of Fluorescent Immuno-Chemistry for the detection of Edwardsiella ictaluri in channel catfish I. punctatus samples

Verwendung von fluoreszierenden Immuno-Chemie für den Nachweis von Edwardsiella ictaluri In Kanal Wels ( I. punctatus) Proben

While Edwardsiella ictaluri is a major pathogen of channel catfish Ictalurus punctatus and has been discovered nearly 
three decades ago 1,2, so far, to ...

Determining the Phagocytic Activity of Clinical Antibody Samples

Die Bestimmung der Phagozytoseaktivität of Clinical Antikörper Proben

Antibody-driven phagocytosis is induced via the engagement of Fc receptors on professional phagocytes, and can contribute to both clearance as well as ...

Detection of Bacteria Using Fluorogenic DNAzymes

Nachweis von Bakterien mit fluorogenen DNAzyme

Outbreaks linked to food-borne and hospital-acquired pathogens account for millions of deaths and hospitalizations as well as colossal economic losses ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

Schnelle Identifizierung von Gram-negativen Bakterien aus Blutkulturbrühe unter Verwendung von MALDI-TOF-Massenspektrometrie

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

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In-situ-Nachweis autoreaktiver CD4-T-Zellen in Gehirn und Herz Mit Haupthistokompatibilitätskomplex Klasse II Dextramers

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin ...

In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA

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In-situ-Nachweis von Bakterien in Paraffin eingebetteten Geweben Unter Verwendung eines Digoxin-markierte DNA-Sonde Targeting 16S rRNA

The presence of bacteria within the pocket epithelium and underlying connective tissue in gingival biopsies from patients with periodontitis has been ...

A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis

A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis

Eine schnelle Strategie für die Isolierung neuer Faustoviruses von Umweltproben unter Verwendung von<em&gt; Vermamoeba vermiformis</em

The isolation of giant viruses is of great interest in this new era of virology, especially since these giant viruses are related to protists. Giant ...

Developing a Salivary Antibody Multiplex Immunoassay to Measure Human Exposure to Environmental Pathogens

eine Speichel- Antikörper Multiplex-Immunoassay Entwicklung der Humanexposition Umwelt Pathogens zu messen

The etiology and impacts of human exposure to environmental pathogens are of major concern worldwide and, thus, the ability to assess exposure and ...

Magnetic Stirrer Method for the Detection of Trichinella Larvae in Muscle Samples

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Magnetrührers Verfahren zum Nachweis von<em&gt; Trichinella</em&gt; Larvae in Muskelproben

Trichinellosis is a debilitating disease in humans and is caused by the consumption of raw or undercooked meat of animals infected with the nematode ...