Name: multiplex detection of bacteria in complex clinical and environmental samples using oligonucleotide-coupled fluorescent microspheres
Uploaded: 2011-10-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multiplex Detection of Bacteria in Complex Clinical and Environmental Samples using Oligonucleotide-coupled Fluorescent Microspheres at JoVE.com

אנו מודים אלברטו Severini וונסה Goleski לעזרה בפיתוח assay והערות קריטי על כתב היד הזה. עבודה זו מומנה על ידי הסוכנות לבריאות הציבור של קנדה תעשייתי מחקר סיוע התוכנית (המועצה הלאומית למחקר של קנדה). תמיכה נוספת התקבלה מאוניברסיטת הקרן פרסום ססקצ&#39;ואן.

שיטה זו שימשה במחקר דיווחו Dumonceaux et al. J. Clin. . Microbiol 47, 4067-4077, doi: 10.1128/jcm.00112-09 (2009). תרשים סכמטי המתאר את הליך הכולל מוצג באיור 1. 1. ביד צימוד זה מתאר את שיטות ל...

<ol>
	<li>Hale, L. P., Swidsinski, A., Mendling, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria+associated+with+bacterial+vaginosis.">Bacteria associated with bacterial vaginosis.</a> N. Engl. J. Med. 354, 202-203 (2006).</li><li>Hay, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+in+the+littoral+zone:+lactobacilli+losing+the+plot.">Life in the littoral zone: lactobacilli losing the plot.</a> Sex. Transm. Infect. 81, 100-102 (2005).</li><li>Morris, M., Nicoll, A., Simms, I., Wilson, J., Catchpole, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+vaginosis:+a+public+health+review.">Bacterial vaginosis: a public health review.</a> Brit. J. Obstet. Gynecol. 108, 439-450 (2001).</li><li>Myer, L., Kuhn, L., Stein, Z. A., Wright, T. C., Denny, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravaginal+practices,+bacterial+vaginosis,+and+women's+susceptibility+to+HIV+infection:+epidemiological+evidence+and+biological+mechanisms.">Intravaginal practices, bacterial vaginosis, and women's susceptibility to HIV infection: epidemiological evidence and biological mechanisms.</a> Lancet. Infect. Dis. 5, 786-794 (2005).</li><li>Wilson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Managing+recurrent+bacterial+vaginosis.">Managing recurrent bacterial vaginosis.</a> Sex. Transm. Infect. 80, 8-11 (2004).</li><li>Nugent, R. P., Krohn, M. A., Hillier, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliability+of+diagnosing+bacterial+vaginosis+is+improved+by+a+standardized+method+of+gram+stain+interpretation.">Reliability of diagnosing bacterial vaginosis is improved by a standardized method of gram stain interpretation.</a> J. Clin. Microbiol. 29, 297-301 (1991).</li><li>Ison, C. A., Hay, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+simplified+grading+of+Gram+stained+vaginal+smears+for+use+in+genitourinary+medicine+clinics.">Validation of a simplified grading of Gram stained vaginal smears for use in genitourinary medicine clinics.</a> Sex. Transm. Infect. 78, 413-415 (2002).</li><li>Money, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+laboratory+diagnosis+of+bacterial+vaginosis.">The laboratory diagnosis of bacterial vaginosis.</a> Can. J. Infect. Dis. Med. Microbiol. 16, 77-79 (2005).</li><li>Schellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrosequencing+of+the+chaperonin-60+universal+target+as+a+tool+for+determining+microbial+community+composition.">Pyrosequencing of the chaperonin-60 universal target as a tool for determining microbial community composition.</a> Appl. Environ. Microbiol. 75, 2889-2898 (2009).</li><li>Spear, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+diversity+of+the+vaginal+microbiota+in+HIV-infected+and+HIV-uninfected+women+with+or+without+bacterial+vaginosis.">Comparison of the diversity of the vaginal microbiota in HIV-infected and HIV-uninfected women with or without bacterial vaginosis.</a> J. Infect. Dis. 198, 1131-1140 (2008).</li><li>Brotman, R. M., Ravel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ready+or+not:+the+molecular+diagnosis+of+bacterial+vaginosis.">Ready or not: the molecular diagnosis of bacterial vaginosis.</a> Clin. Infect. Dis. 47, 44-46 (2008).</li><li>Fredricks, D. N., Fiedler, T. L., Marrazzo, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+identification+of+bacteria+associated+with+bacterial+vaginosis.">Molecular identification of bacteria associated with bacterial vaginosis.</a> N. Engl. J. Med. 353, 1899-1911 (2005).</li><li>Dumonceaux, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+detection+of+bacteria+associated+with+normal+microbiota+and+with+bacterial+vaginosis+in+vaginal+swabs+by+use+of+oligonucleotide-coupled+fluorescent+microspheres.">Multiplex detection of bacteria associated with normal microbiota and with bacterial vaginosis in vaginal swabs by use of oligonucleotide-coupled fluorescent microspheres.</a> J. Clin. Microbiol. 47, 4067-4077 (2009).</li><li>Molenkamp, R., van der Ham, A., Schinkel, J., Beld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+of+five+different+DNA+targets+by+real-time+Taqman+PCR+using+the+Roche+LightCycler480:+Application+in+viral+molecular+diagnostics.">Simultaneous detection of five different DNA targets by real-time Taqman PCR using the Roche LightCycler480: Application in viral molecular diagnostics.</a> J. Virol. Meth. 141, 205-211 (2007).</li><li>Nikiforov, T. T., Rendle, R. B., Kotewicz, M. L., Rogers, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+phosphorothioate+primers+and+exonuclease+hydrolysis+for+the+preparation+of+single-stranded+PCR+products+and+their+detection+by+solid-phase+hybridization.">The use of phosphorothioate primers and exonuclease hydrolysis for the preparation of single-stranded PCR products and their detection by solid-phase hybridization.</a> PCR. Methods. Appl. 3, 285-291 (1994).</li><li>Hill, J. E., Penny, S. L., Crowell, K. G., Goh, S. H., Hemmingsen, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cpnDB:+A+Chaperonin+Sequence+Database.">cpnDB: A Chaperonin Sequence Database.</a> Genome. Res. 14, 1669-1675 (2004).</li><li>Bradshaw, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+association+of+Atopobium+vaginae+and+Gardnerella+vaginalis+with+bacterial+vaginosis+and+recurrence+after+oral+metronidazole+therapy.">The association of Atopobium vaginae and Gardnerella vaginalis with bacterial vaginosis and recurrence after oral metronidazole therapy.</a> J. Infect. Dis. 194, 828-836 (2006).</li><li>Dumonceaux, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enumeration+of+specific+bacterial+populations+in+complex+intestinal+communities+using+quantitative+PCR+based+on+the+chaperonin-60+target.">Enumeration of specific bacterial populations in complex intestinal communities using quantitative PCR based on the chaperonin-60 target.</a> J. Microbiol. Meth. 64, 46-62 (2006).</li></ol>

סגוליות של הדור אות היא בעלת חשיבות מכרעת, אתה חייב להיות בטוח כי האות שנצפה באמת משקף את הזיהוי של amplicon שנוצר אורגניזם הזה. תוכנות כגון PrimerPlex (פרמייר Biosoft) יכול לעזור לתכנן בדיקות אשר להכליא ביעילות, אבל הם עשויה או לא עשויה לחצות להכליא ליעד הלא מינים. כאשר אוניברסלי p...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> Oligonucleotide שם </td><td> חברה </td><td> רצף 1 </td></tr><tr><td> H279BP </td><td rowspan="3"> Invitrogen, IDT, או אחרים </td><td> ביוטין-OEFO GAIIIIGCIGGIGAYGGIACIACIAC </td></tr><tr><td> H280 </td><td> YKIYKITCICCRAAICCIGGIGCYTT </td></tr><tr><td> H1612BP </td><td> ביוטין-OEFO GAIIIIGCIGGYGACGGYACSACSAC </td></tr><tr><td> H1613 </td><td></td><td> CGRCGRTCRCCGAAGCCSGGIGCCTT </td></tr><tr><td colspan="3"> 1o, phosphorothioate-C, E, phosphorothioate-G, F, phosphorothioate-A; אני, inosine; Y, C או T, R, A או G, K, G או T, S, C או G. </td></tr></tbody></table> טבלה 1. רצפים של oligonucleotides שונה עבור אוניברסלי cpn60 PCR. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב</td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> 1-אתיל-3-(3-dimethylamiopropyl) carbodiimide HCl (EDC) </td><td> לנקב </td><td> 22980 </td><td></td></tr><tr><td> קלקר חרוזים פלורסנט: MicroPlex microspheres (Luminex), או Bio-Plex COOH ביד (Bio-Rad) </td><td> Luminex או Bio-Rad </td><td> Bio-Rad: 171-506xxx כאשר xxx מקביל מזהה חרוז </td><td> חרוזים מגנטיים הופכים זמינים עבור צימוד oligonucleotide ועשויים להציע יתרונות מסוימים. לא נוסו על ידי המחברים האלה. </td></tr><tr><td> לכידת oligonucleotides (C12 אמינו 5 &quot;שונה) </td><td> Invitrogen, IDT, או אחרים </td><td> שונים </td><td> רמת טוהר Desalted מקובל. רצפים של בדיקות ללכוד להשתמש לאפיין למשטח מהנרתיק ניתנים כתב היד שבו פרוטוקול זה מבוסס 13. </td></tr><tr><td> T7exonuclease </td><td> ניו אינגלנד Biolabs </td><td> M0263S </td><td></td></tr><tr><td> Streptavidin-R-phycoerythrin (SA-PE) </td><td> Invitrogen </td><td> S-866 </td><td> היזהר להשיג טוהר גבוהה SA-PE, זה מספר קטלוג מומלץ </td></tr><tr><td> Thermowell 96 גם צלחות PCR </td><td> דיג </td><td> CS006509 </td><td> להשתלב thermocycler הן 96-היטב מכונת BioPlex </td></tr><tr><td> Thermowell איטום מחצלת </td><td> דיג </td><td> CS006555 </td><td> ניתן שימוש חוזר, לשטוף עם מים וסבון, לשטוף היטב, יבש </td></tr><tr><td> 5M TMAC </td><td> סיגמא </td><td> T3411 </td><td></td></tr><tr><td> Bio-Plex או מכשיר Luminex </td><td> Bio-Rad או Luminex </td><td> Bio-Rad: 171-000201 </td><td></td></tr><tr><td> PrimerPlex תוכנה לעיצוב בדיקה </td><td> פרמייר Biosoft </td><td> www.premierbiosoft.com </td><td> הצעות עבור Luminex בדיקה דהסימן, למרות פלטפורמות תוכנה אחרים עשויים לשמש </td></tr></tbody></table> טבלה 2. ריאגנטים ספציפיים וציוד. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> רכיב </td><td> μl / assay </td><td> מבחני μl/100 </td><td> הריכוז הסופי </td></tr><tr><td> 10x PCR חיץ (Invitrogen) </td><td> 5 </td><td> 500 </td><td> 1x </td></tr><tr><td> 50 מ&quot;מ MgCl 2 (Invitrogen) </td><td> 2.5 </td><td> 250 </td><td> 2.5 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> 10 mM dNTP </td><td> 1 </td><td> 100 </td><td> 0.2 מ&quot;מ כל אחד </td></tr><tr><td> H279BP, 25 מיקרומטר </td><td> 0.25 </td><td> 25 </td><td> 375 nM </td></tr><tr><td> H1612BP, 25 מיקרומטר </td><td> 0.75 </td><td> 75 </td><td> 125 nM </td></tr><tr><td> H280, 25 מיקרומטר </td><td> 0.25 </td><td> 25 </td><td> 375 nM </td></tr><tr><td> H1613,25 מיקרומטר </td><td> 0.75 </td><td> 75 </td><td> 125 nM </td></tr><tr><td> מים </td><td> 34 </td><td> 3400 </td><td> --- </td></tr><tr><td> סכומים </td><td> 44.5 </td><td> 4450 </td><td></td></tr></tbody></table> לוח 3. מוצעים תערובות עבור PCR עם שונה cpn60 UT primers (טבלה 1). Assay היא להגדיר עבור μl 5 של ה-DNA תבנית 0.5 μl (2.5U) של ה-DNA פולימראז תקי (Invitrogen). בדרך כלל כמויות גדולות מוכנים (די למשל עבור 100 מבחני) ומאוחסנים ב -20 ° C.

multiplex detection of bacteria in complex clinical and environmental samples using oligonucleotide-coupled fluorescent microspheres

וגינוזיס בקטריאלי (BV) היא תסמונת polymicrobial חוזרת מאופיין בשינוי החיידקים &quot;נורמלי&quot; של לקטובצילוס הנשלטת על החיידקים הנשלט על ידי מספר מינים חיידקי, כולל vaginalis Gardnerella, Atopobium vaginae ועוד 1-3. מצב זה קשור עם מגוון של תוצאות בריאותיות שליליות, כולל איידס רכישת 4, וזה יכול להיות קשה לנהל קלינית 5. יתר על כן, האבחנה של BV הסתמכה על השימוש גראם כתמים של מריחות משטח וגינאלי, כי הם ציונים מספריים על קריטריונים שונים 6,7. בעוד אבחון זה הוא פשוט, לא יקר, מתאים גם משאב מוגבל הגדרות, זה יכול סובלים מבעיות הקשורות פרשנויות סובייקטיביות זה לא נותן פרופיל מפורט של הרכב החיידקים הנרתיק 8. מאמצים אחרונים רצף עמוק חשפו החיידקים עשיר, מגוון עם הנרתיקהבדלים ברורים בין דגימות שנלקחו מאנשים אשר מאובחנים עם BV לעומת אותם אנשים שנחשבים 9,10 נורמלי, אשר הביאה לזיהוי של מספר יעדים פוטנציאליים לאבחון מולקולרי של BV 11,12. מחקרים אלו סיפקו שפע של מידע שימושי, אבל רצף עמוק עדיין לא מעשית כשיטת אבחון בסביבה קלינית. תיארנו לאחרונה שיטה מהירה לאפיון החיידקים בנרתיק במתכונת זמנית באמצעות oligonucleotide מצמידים חרוזי ניאון עם זיהוי על פלטפורמה Luminex 13. שיטה זו, כמו כתם הנוכחי מבוסס שיטות סבתא, היא מהירה ופשוטה אבל מוסיפה את יתרון נוסף של ניצול הידע המולקולרי הנובעים רצף לימודי עיצוב בדיקה. שיטה זו ולכן מספק דרך הפרופיל מיקרואורגניזמים העיקריים נמצאים מקלון הנרתיק שניתן להשתמש בהם כדי לאבחן BV עם סגוליות גבוהה comp רגישותared כדי גראם כתם תוך מתן מידע נוסף על נוכחות מינים ושפע באופן חצי כמותי ומהיר. שיטה זו זמנית ניתן להרחבה גם מעבר לטווח של PCR כמותי מבחני הנוכחי של אורגניזמים מסוימים, אשר כרגע מוגבל ל 5 או 6 מבחני שונים יחיד מדגם 14. חשוב לציין כי השיטה אינה מוגבלת לזיהוי דגימות של חיידקים בנרתיק ניתן להתאים בקלות במהירות פרופיל כמעט כל הקהילה מיקרוביאלי של עניין. לדוגמה, יש לנו לאחרונה החל ליישם מתודולוגיה לפיתוח של כלי אבחון לשימוש בצמחים וטיפול בשפכים.

Watch this Scientific Journal Video about Multiplex Detection of Bacteria in Complex Clinical and Environmental Samples using Oligonucleotide-coupled Fluorescent Microspheres at JoVE.com

Multiplex Detection of Bacteria in Complex Clinical and Environmental Samples using Oligonucleotide-coupled Fluorescent Microspheres

אנו מתארים שיטה זמנית לצורך זיהוי של מיקרואורגניזמים בתוך מדגם באמצעות חרוזי ניאון oligonucleotide מצמידים. Amplicon מכל האורגניזמים בתוך מדגם הוא הכלאה בפני פאנל של בדיקה, בשילוב חרוזים. מכשיר Luminex או Bio-Plex משמש עבור כל שאילתת חרוז חרוז סוג האות הכלאה.

Multiplex זיהוי של חיידקים דוגמאות מורכבות קלינית הסביבה באמצעות oligonucleotide מצמידים פלורסנט microspheres

Bacterial vaginosis (BV) is a recurring polymicrobial syndrome that is characterized by a change in the "normal" microbiota from Lactobacillus-dominated ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

באמצעות assay הפאן ויראלי microarray (Virochip) אל מסך דוגמאות קליניות עבור פתוגנים ויראליים

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

Use of Fluorescent Immuno-Chemistry for the detection of Edwardsiella ictaluri in channel catfish (I. punctatus) samples

Use of Fluorescent Immuno-Chemistry for the detection of Edwardsiella ictaluri in channel catfish I. punctatus samples

השימוש פלורסנט חיסונית-לכימיה לצורך זיהוי של Edwardsiella ictaluri ב שפמנון ערוץ ( א punctatus) דגימות

While Edwardsiella ictaluri is a major pathogen of channel catfish Ictalurus punctatus and has been discovered nearly 
three decades ago 1,2, so far, to ...

Determining the Phagocytic Activity of Clinical Antibody Samples

קביעת פעילות Phagocytic דוגמאות של נוגדן קלינית

Antibody-driven phagocytosis is induced via the engagement of Fc receptors on professional phagocytes, and can contribute to both clearance as well as ...

Detection of Bacteria Using Fluorogenic DNAzymes

זיהוי של חיידקים באמצעות DNAzymes Fluorogenic

Outbreaks linked to food-borne and hospital-acquired pathogens account for millions of deaths and hospitalizations as well as colossal economic losses ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

זיהוי מהיר של חיידקים גראם שליליים מהדם תרבות מרק שימוש MALDI-TOF המוני ספקטרומטריית

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

באתרו איתור של תאים אוטוריאקטיבים T מסוג CD4 במוח ולב באמצעות מחלקה מורכבת השני Dextramers סרן histocompatibility

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin ...

In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA

In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA

באתרו איתור של חיידקים בתוך רקמות מוטבעות-פרפין באמצעות DNA בדיקה שכותרת Digoxin מיקוד 16S rRNA

The presence of bacteria within the pocket epithelium and underlying connective tissue in gingival biopsies from patients with periodontitis has been ...

A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis

A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis

אסטרטגית ראפיד עבור הבידוד של ניו Faustoviruses ממדגמים סביבת שימוש<em&gt; Vermiformis Vermamoeba</em

The isolation of giant viruses is of great interest in this new era of virology, especially since these giant viruses are related to protists. Giant ...

Developing a Salivary Antibody Multiplex Immunoassay to Measure Human Exposure to Environmental Pathogens

פיתוח Immunoassay רוק נוגדן Multiplex כדי לאמוד את חשיפת אדם לפתוגנים הסביבה

The etiology and impacts of human exposure to environmental pathogens are of major concern worldwide and, thus, the ability to assess exposure and ...

Magnetic Stirrer Method for the Detection of Trichinella Larvae in Muscle Samples

Magnetic Stirrer Method for the Detection of Trichinella Larvae in Muscle Samples

סטירר שיטה מגנטית לצורך זיהוי של<em&gt; Trichinella</em&gt; זחלים בדגימות שריר

Trichinellosis is a debilitating disease in humans and is caused by the consumption of raw or undercooked meat of animals infected with the nematode ...