Name: multiplex detection of bacteria in complex clinical and environmental samples using oligonucleotide-coupled fluorescent microspheres
Uploaded: 2011-10-23T14:00:00
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Ringraziamo Alberto Severini e Vanessa Goleski per facilitare lo sviluppo di analisi e commenti critici su questo manoscritto. Questo lavoro è stato finanziato dall&#39;Agenzia di sanità pubblica del Canada e degli Industrial Research Assistance Program (National Research Council of Canada). Ulteriore supporto è stato ottenuto presso l&#39;Università di Saskatchewan Fondo di pubblicazione.

Questo metodo è stato utilizzato nella ricerca riportata in Dumonceaux et al. J. Clin. . Microbiol 47, 4067-4077, doi: 10.1128/jcm.00112-09 (2009). Un diagramma schematico raffigurante la procedura generale è presentato nella figura 1. 1. Perlina di accoppiamento Questo descrive i metodi da utilizzare per l&#39;accoppiamento sonde oligonucleotidiche al polistirolo perle di Luminex (vedi tabella 2). I volumi sono leggermente a...

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	<li>Hale, L. P., Swidsinski, A., Mendling, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria+associated+with+bacterial+vaginosis.">Bacteria associated with bacterial vaginosis.</a> N. Engl. J. Med. 354, 202-203 (2006).</li><li>Hay, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+in+the+littoral+zone:+lactobacilli+losing+the+plot.">Life in the littoral zone: lactobacilli losing the plot.</a> Sex. Transm. Infect. 81, 100-102 (2005).</li><li>Morris, M., Nicoll, A., Simms, I., Wilson, J., Catchpole, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+vaginosis:+a+public+health+review.">Bacterial vaginosis: a public health review.</a> Brit. J. Obstet. Gynecol. 108, 439-450 (2001).</li><li>Myer, L., Kuhn, L., Stein, Z. A., Wright, T. C., Denny, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravaginal+practices,+bacterial+vaginosis,+and+women's+susceptibility+to+HIV+infection:+epidemiological+evidence+and+biological+mechanisms.">Intravaginal practices, bacterial vaginosis, and women's susceptibility to HIV infection: epidemiological evidence and biological mechanisms.</a> Lancet. Infect. Dis. 5, 786-794 (2005).</li><li>Wilson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Managing+recurrent+bacterial+vaginosis.">Managing recurrent bacterial vaginosis.</a> Sex. Transm. Infect. 80, 8-11 (2004).</li><li>Nugent, R. P., Krohn, M. A., Hillier, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliability+of+diagnosing+bacterial+vaginosis+is+improved+by+a+standardized+method+of+gram+stain+interpretation.">Reliability of diagnosing bacterial vaginosis is improved by a standardized method of gram stain interpretation.</a> J. Clin. Microbiol. 29, 297-301 (1991).</li><li>Ison, C. A., Hay, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+simplified+grading+of+Gram+stained+vaginal+smears+for+use+in+genitourinary+medicine+clinics.">Validation of a simplified grading of Gram stained vaginal smears for use in genitourinary medicine clinics.</a> Sex. Transm. Infect. 78, 413-415 (2002).</li><li>Money, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+laboratory+diagnosis+of+bacterial+vaginosis.">The laboratory diagnosis of bacterial vaginosis.</a> Can. J. Infect. Dis. Med. Microbiol. 16, 77-79 (2005).</li><li>Schellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrosequencing+of+the+chaperonin-60+universal+target+as+a+tool+for+determining+microbial+community+composition.">Pyrosequencing of the chaperonin-60 universal target as a tool for determining microbial community composition.</a> Appl. Environ. Microbiol. 75, 2889-2898 (2009).</li><li>Spear, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+diversity+of+the+vaginal+microbiota+in+HIV-infected+and+HIV-uninfected+women+with+or+without+bacterial+vaginosis.">Comparison of the diversity of the vaginal microbiota in HIV-infected and HIV-uninfected women with or without bacterial vaginosis.</a> J. Infect. Dis. 198, 1131-1140 (2008).</li><li>Brotman, R. M., Ravel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ready+or+not:+the+molecular+diagnosis+of+bacterial+vaginosis.">Ready or not: the molecular diagnosis of bacterial vaginosis.</a> Clin. Infect. Dis. 47, 44-46 (2008).</li><li>Fredricks, D. N., Fiedler, T. L., Marrazzo, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+identification+of+bacteria+associated+with+bacterial+vaginosis.">Molecular identification of bacteria associated with bacterial vaginosis.</a> N. Engl. J. Med. 353, 1899-1911 (2005).</li><li>Dumonceaux, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+detection+of+bacteria+associated+with+normal+microbiota+and+with+bacterial+vaginosis+in+vaginal+swabs+by+use+of+oligonucleotide-coupled+fluorescent+microspheres.">Multiplex detection of bacteria associated with normal microbiota and with bacterial vaginosis in vaginal swabs by use of oligonucleotide-coupled fluorescent microspheres.</a> J. Clin. Microbiol. 47, 4067-4077 (2009).</li><li>Molenkamp, R., van der Ham, A., Schinkel, J., Beld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+of+five+different+DNA+targets+by+real-time+Taqman+PCR+using+the+Roche+LightCycler480:+Application+in+viral+molecular+diagnostics.">Simultaneous detection of five different DNA targets by real-time Taqman PCR using the Roche LightCycler480: Application in viral molecular diagnostics.</a> J. Virol. Meth. 141, 205-211 (2007).</li><li>Nikiforov, T. T., Rendle, R. B., Kotewicz, M. L., Rogers, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+phosphorothioate+primers+and+exonuclease+hydrolysis+for+the+preparation+of+single-stranded+PCR+products+and+their+detection+by+solid-phase+hybridization.">The use of phosphorothioate primers and exonuclease hydrolysis for the preparation of single-stranded PCR products and their detection by solid-phase hybridization.</a> PCR. Methods. Appl. 3, 285-291 (1994).</li><li>Hill, J. E., Penny, S. L., Crowell, K. G., Goh, S. H., Hemmingsen, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cpnDB:+A+Chaperonin+Sequence+Database.">cpnDB: A Chaperonin Sequence Database.</a> Genome. Res. 14, 1669-1675 (2004).</li><li>Bradshaw, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+association+of+Atopobium+vaginae+and+Gardnerella+vaginalis+with+bacterial+vaginosis+and+recurrence+after+oral+metronidazole+therapy.">The association of Atopobium vaginae and Gardnerella vaginalis with bacterial vaginosis and recurrence after oral metronidazole therapy.</a> J. Infect. Dis. 194, 828-836 (2006).</li><li>Dumonceaux, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enumeration+of+specific+bacterial+populations+in+complex+intestinal+communities+using+quantitative+PCR+based+on+the+chaperonin-60+target.">Enumeration of specific bacterial populations in complex intestinal communities using quantitative PCR based on the chaperonin-60 target.</a> J. Microbiol. Meth. 64, 46-62 (2006).</li></ol>

La specificità di generazione del segnale è di importanza critica, si deve essere sicuri che il segnale osservato rispecchia in pieno la rilevazione degli ampliconi generati da tale organismo. Software come PrimerPlex (Premier Biosoft) può aiutare a progettare delle sonde che ibridano in modo efficiente, ma può o non può cross-ibridare a specie non bersaglio. Quando universale primer PCR sono utilizzati come descritto in questo protocollo, è importante tenere a mente che l&#39;ha generato amplicone rappresenta tut...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome oligonucleotide </td><td> Azienda </td><td> Sequenza 1 </td></tr><tr><td> H279BP </td><td rowspan="3"> Invitrogen, IDT, o altri </td><td> Biotina-OEFO GAIIIIGCIGGIGAYGGIACIACIAC </td></tr><tr><td> H280 </td><td> YKIYKITCICCRAAICCIGGIGCYTT </td></tr><tr><td> H1612BP </td><td> Biotina-OEFO GAIIIIGCIGGYGACGGYACSACSAC </td></tr><tr><td> H1613 </td><td></td><td> CGRCGRTCRCCGAAGCCSGGIGCCTT </td></tr><tr><td colspan="3"> 1O, fosforotioato-C, E, fosforotioato-G, F, fosforotioato-A, io, inosina, Y, C o T, R, A o G, K, T, G, S, C o G. </td></tr></tbody></table> Sequenze Tabella 1. Dei oligonucleotidi modificati per universale cpn60 PCR. <table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente</td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> 1-etil-3-(3-dimethylamiopropyl) carbodiimmide HCl (EDC) </td><td> Perforare </td><td> 22980 </td><td></td></tr><tr><td> Perline fluorescenti di polistirene: Microplex Microsfere (Luminex), o Bio-Plex COOH Bead (Bio-Rad) </td><td> Luminex o Bio-Rad </td><td> Bio-Rad: 171-506xxx dove xxx corrisponde al tallone identificatore </td><td> Biglie magnetiche sono sempre disponibili per l&#39;accoppiamento oligonucleotidi e può offrire alcuni vantaggi. Non sono stati provati da questi autori. </td></tr><tr><td> Oligonucleotidi di cattura (5 &#39;amino C12 modificata) </td><td> Invitrogen, IDT, o altri </td><td> varie </td><td> Livello di purezza dissalate è accettabile. Sequenze delle sonde di cattura utilizzati per caratterizzare i tamponi vaginali sono forniti nel manoscritto su cui si basa questo protocollo 13. </td></tr><tr><td> T7esonucleasi </td><td> New England Biolabs </td><td> M0263S </td><td></td></tr><tr><td> Streptavidina-R-ficoeritrina (SA-PE) </td><td> Invitrogen </td><td> S-866 </td><td> Fare attenzione ad ottenere elevata purezza SA-PE, questo numero di catalogo è consigliato </td></tr><tr><td> Pozzetto 96 pozzetti PCR </td><td> Pescatore </td><td> CS006509 </td><td> rientrano in entrambe le termociclatore a 96 pozzetti e la macchina Bioplex </td></tr><tr><td> Pozzetto di tenuta tappeto </td><td> Pescatore </td><td> CS006555 </td><td> Possono essere riutilizzati; lavare con acqua e sapone, lavare bene e asciugare </td></tr><tr><td> TMAC 5M </td><td> Sigma </td><td> T3411 </td><td></td></tr><tr><td> Bio-Plex o strumento Luminex </td><td> Bio-Rad o Luminex </td><td> Bio-Rad: 171-000201 </td><td></td></tr><tr><td> Software per la progettazione PrimerPlex sonda </td><td> Premier Biosoft </td><td> www.premierbiosoft.com </td><td> Consigliato per Luminex sonda desegno, anche se piattaforme software possono essere utilizzati altri </td></tr></tbody></table> Tabella 2. Reagenti e attrezzature specifiche. <table border="1"><tbody><tr><td> componente </td><td> microlitri / saggio </td><td> saggi μl/100 </td><td> concentrazione finale </td></tr><tr><td> 10x PCR buffer (Invitrogen) </td><td> 5 </td><td> 500 </td><td> 1x </td></tr><tr><td> 50 mM MgCl 2 (Invitrogen) </td><td> 2,5 </td><td> 250 </td><td> 2,5 mM </td></tr><tr><td> 10 mM dNTP </td><td> 1 </td><td> 100 </td><td> 0,2 mm ciascuna </td></tr><tr><td> H279BP, 25 mM </td><td> 0,25 </td><td> 25 </td><td> 375 nm </td></tr><tr><td> H1612BP, 25 mM </td><td> 0,75 </td><td> 75 </td><td> 125 Nm </td></tr><tr><td> H280, 25 mM </td><td> 0,25 </td><td> 25 </td><td> 375 nm </td></tr><tr><td> H1613,25 mM </td><td> 0,75 </td><td> 75 </td><td> 125 Nm </td></tr><tr><td> Acqua </td><td> 34 </td><td> 3400 </td><td> --- </td></tr><tr><td> Totali </td><td> 44,5 </td><td> 4450 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabella 3. Consigliati miscele per PCR con primer modificato cpn60 UT (Tabella 1). Il test è costituito da 5 ml di DNA stampo e 0,5 microlitri (2,5 U) di Taq DNA polimerasi (Invitrogen). Normalmente grandi volumi sono preparati (ad esempio, sufficiente per 100 test) e conservati a -20 ° C.

multiplex detection of bacteria in complex clinical and environmental samples using oligonucleotide-coupled fluorescent microspheres

Vaginosi batterica (BV) è una sindrome polimicrobica ricorrente che è caratterizzata da un cambiamento nel microbiota &quot;normale&quot; da Lactobacillus dominato ad un microbiota dominato da un numero di specie batteriche, tra cui Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae, e altri 1-3. Questa condizione è associata a una serie di esiti negativi per la salute, compreso l&#39;HIV acquisizione 4, e può essere difficile da gestire clinicamente 5. Inoltre, la diagnosi di BV ha invocato l&#39;uso della colorazione di Gram di strisci tampone vaginale che sono incise su vari criteri numerici 6,7. Anche se questa diagnosi è semplice, economico e adatto a risorse limitate, può soffrire di problemi legati ad interpretazioni soggettive e non dà un profilo dettagliato della composizione del microbiota vaginale 8. I recenti sforzi di sequenziamento profondo hanno rivelato una ricca e diversificata flora batterica vaginale, conchiare differenze tra campioni prelevati da individui che sono diagnosticati con BV rispetto a quegli individui che sono considerati normali 9,10, che ha portato alla identificazione di un numero di potenziali bersagli per la diagnosi molecolare di BV 11,12. Questi studi hanno fornito una grande quantità di informazioni utili, ma sequenziamento profondo non è ancora pratico come metodo diagnostico in ambito clinico. Abbiamo recentemente descritto un metodo rapido per il profiling del microbiota vaginale in un formato multiplex con oligonucleotidi accoppiati perline fluorescenti con rilevamento su una piattaforma Luminex 13. Questo metodo, come la corrente colorazione di Gram metodi basati, è rapido e semplice, ma aggiunge l&#39;ulteriore vantaggio di sfruttare le conoscenze molecolari derivanti da studi di sequenziamento nella progettazione della sonda. Questo metodo fornisce quindi un modo per profilo i microrganismi più importanti che sono presenti in un tampone vaginale che può essere utilizzato per diagnosticare BV con elevata specificità e sensibilità compared a macchia Gram fornendo ulteriori informazioni sulla presenza e abbondanza delle specie in modo semi-quantitativo e rapida. Questo metodo multiplex è espandibile ben oltre la portata della corrente analisi PCR quantitativa per gli organismi particolari, che attualmente è limitato a 5 o 6 test differenti in un singolo campione 14. È importante sottolineare che il metodo non si limita alla rilevazione di batteri nei tamponi vaginali e può essere facilmente adattato al profilo rapidamente quasi tutte le comunità microbica di interesse. Per esempio, abbiamo recentemente iniziato ad applicare questa metodologia per lo sviluppo di strumenti diagnostici per l&#39;impiego in impianti di trattamento delle acque reflue.

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Multiplex Detection of Bacteria in Complex Clinical and Environmental Samples using Oligonucleotide-coupled Fluorescent Microspheres

Descriviamo un metodo multiplex per la rilevazione di microrganismi in un campione con oligonucleotide ad accoppiamento perline fluorescenti. Amplificato da tutti gli organismi in un campione è ibridato ad un pannello di sonda-perline accoppiate. Uno strumento Luminex o Bio-Plex è usato per interrogare ogni perla per il tipo di perline e segnale di ibridazione.

Rilevazione multiplex di batteri in campioni clinici complessi ed Ambientali con oligonucleotidi accoppiati microsfere fluorescenti

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