Name: multiplex detection of bacteria in complex clinical and environmental samples using oligonucleotide-coupled fluorescent microspheres
Uploaded: 2011-10-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multiplex Detection of Bacteria in Complex Clinical and Environmental Samples using Oligonucleotide-coupled Fluorescent Microspheres at JoVE.com

Vi takker Alberto Severini og Vanessa Goleski for hjelp med analysen utvikling og kritiske kommentarer til dette manuskriptet. Dette arbeidet ble finansiert av Public Health Agency of Canada og Industrial Research Assistance Program (National Research Council of Canada). Ekstra støtte ble hentet fra University of Saskatchewan Publication fondet.

Denne metoden ble brukt i forskning rapportert i Dumonceaux et al. J. Clin. . Microbiol 47, 4067-4077, doi: 10.1128/jcm.00112-09 (2009). En skjematisk diagram som viser den generelle prosedyren er presentert i Figur 1. 1. Bead kobling Dette beskriver metoder som skal benyttes for kopling oligonukleotid prober til polystyren Luminex perler (se tabell 2). Volumene er tilpasset litt for vurdering av nye fange prober på en prøveo...

<ol>
	<li>Hale, L. P., Swidsinski, A., Mendling, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria+associated+with+bacterial+vaginosis.">Bacteria associated with bacterial vaginosis.</a> N. Engl. J. Med. 354, 202-203 (2006).</li><li>Hay, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+in+the+littoral+zone:+lactobacilli+losing+the+plot.">Life in the littoral zone: lactobacilli losing the plot.</a> Sex. Transm. Infect. 81, 100-102 (2005).</li><li>Morris, M., Nicoll, A., Simms, I., Wilson, J., Catchpole, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+vaginosis:+a+public+health+review.">Bacterial vaginosis: a public health review.</a> Brit. J. Obstet. Gynecol. 108, 439-450 (2001).</li><li>Myer, L., Kuhn, L., Stein, Z. A., Wright, T. C., Denny, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravaginal+practices,+bacterial+vaginosis,+and+women's+susceptibility+to+HIV+infection:+epidemiological+evidence+and+biological+mechanisms.">Intravaginal practices, bacterial vaginosis, and women's susceptibility to HIV infection: epidemiological evidence and biological mechanisms.</a> Lancet. Infect. Dis. 5, 786-794 (2005).</li><li>Wilson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Managing+recurrent+bacterial+vaginosis.">Managing recurrent bacterial vaginosis.</a> Sex. Transm. Infect. 80, 8-11 (2004).</li><li>Nugent, R. P., Krohn, M. A., Hillier, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliability+of+diagnosing+bacterial+vaginosis+is+improved+by+a+standardized+method+of+gram+stain+interpretation.">Reliability of diagnosing bacterial vaginosis is improved by a standardized method of gram stain interpretation.</a> J. Clin. Microbiol. 29, 297-301 (1991).</li><li>Ison, C. A., Hay, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+simplified+grading+of+Gram+stained+vaginal+smears+for+use+in+genitourinary+medicine+clinics.">Validation of a simplified grading of Gram stained vaginal smears for use in genitourinary medicine clinics.</a> Sex. Transm. Infect. 78, 413-415 (2002).</li><li>Money, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+laboratory+diagnosis+of+bacterial+vaginosis.">The laboratory diagnosis of bacterial vaginosis.</a> Can. J. Infect. Dis. Med. Microbiol. 16, 77-79 (2005).</li><li>Schellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrosequencing+of+the+chaperonin-60+universal+target+as+a+tool+for+determining+microbial+community+composition.">Pyrosequencing of the chaperonin-60 universal target as a tool for determining microbial community composition.</a> Appl. Environ. Microbiol. 75, 2889-2898 (2009).</li><li>Spear, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+diversity+of+the+vaginal+microbiota+in+HIV-infected+and+HIV-uninfected+women+with+or+without+bacterial+vaginosis.">Comparison of the diversity of the vaginal microbiota in HIV-infected and HIV-uninfected women with or without bacterial vaginosis.</a> J. Infect. Dis. 198, 1131-1140 (2008).</li><li>Brotman, R. M., Ravel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ready+or+not:+the+molecular+diagnosis+of+bacterial+vaginosis.">Ready or not: the molecular diagnosis of bacterial vaginosis.</a> Clin. Infect. Dis. 47, 44-46 (2008).</li><li>Fredricks, D. N., Fiedler, T. L., Marrazzo, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+identification+of+bacteria+associated+with+bacterial+vaginosis.">Molecular identification of bacteria associated with bacterial vaginosis.</a> N. Engl. J. Med. 353, 1899-1911 (2005).</li><li>Dumonceaux, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+detection+of+bacteria+associated+with+normal+microbiota+and+with+bacterial+vaginosis+in+vaginal+swabs+by+use+of+oligonucleotide-coupled+fluorescent+microspheres.">Multiplex detection of bacteria associated with normal microbiota and with bacterial vaginosis in vaginal swabs by use of oligonucleotide-coupled fluorescent microspheres.</a> J. Clin. Microbiol. 47, 4067-4077 (2009).</li><li>Molenkamp, R., van der Ham, A., Schinkel, J., Beld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+of+five+different+DNA+targets+by+real-time+Taqman+PCR+using+the+Roche+LightCycler480:+Application+in+viral+molecular+diagnostics.">Simultaneous detection of five different DNA targets by real-time Taqman PCR using the Roche LightCycler480: Application in viral molecular diagnostics.</a> J. Virol. Meth. 141, 205-211 (2007).</li><li>Nikiforov, T. T., Rendle, R. B., Kotewicz, M. L., Rogers, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+phosphorothioate+primers+and+exonuclease+hydrolysis+for+the+preparation+of+single-stranded+PCR+products+and+their+detection+by+solid-phase+hybridization.">The use of phosphorothioate primers and exonuclease hydrolysis for the preparation of single-stranded PCR products and their detection by solid-phase hybridization.</a> PCR. Methods. Appl. 3, 285-291 (1994).</li><li>Hill, J. E., Penny, S. L., Crowell, K. G., Goh, S. H., Hemmingsen, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cpnDB:+A+Chaperonin+Sequence+Database.">cpnDB: A Chaperonin Sequence Database.</a> Genome. Res. 14, 1669-1675 (2004).</li><li>Bradshaw, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+association+of+Atopobium+vaginae+and+Gardnerella+vaginalis+with+bacterial+vaginosis+and+recurrence+after+oral+metronidazole+therapy.">The association of Atopobium vaginae and Gardnerella vaginalis with bacterial vaginosis and recurrence after oral metronidazole therapy.</a> J. Infect. Dis. 194, 828-836 (2006).</li><li>Dumonceaux, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enumeration+of+specific+bacterial+populations+in+complex+intestinal+communities+using+quantitative+PCR+based+on+the+chaperonin-60+target.">Enumeration of specific bacterial populations in complex intestinal communities using quantitative PCR based on the chaperonin-60 target.</a> J. Microbiol. Meth. 64, 46-62 (2006).</li></ol>

Spesifisiteten av signal generasjon er av avgjørende betydning, og du må være trygg på at signalet observert virkelig reflekterer påvisning av amplicon generert fra den organisme. Programvare som PrimerPlex (Premier Biosoft) kan bidra til å utforme sonder som skal hybridize effektivt, men de kan eller ikke kan kryss-hybridize til non-target arter. Når universell PCR primere brukes som beskrevet i denne protokollen, er det viktig å huske på at amplicon genererte representerer alle organismer til stede i prøven....

<table border="1"><tbody><tr><td> Oligonukleotid navn </td><td> Firma </td><td> Sekvens 1 </td></tr><tr><td> H279BP </td><td rowspan="3"> Invitrogen, IDT, eller andre </td><td> Biotin-OEFO GAIIIIGCIGGIGAYGGIACIACIAC </td></tr><tr><td> H280 </td><td> YKIYKITCICCRAAICCIGGIGCYTT </td></tr><tr><td> H1612BP </td><td> Biotin-OEFO GAIIIIGCIGGYGACGGYACSACSAC </td></tr><tr><td> H1613 </td><td></td><td> CGRCGRTCRCCGAAGCCSGGIGCCTT </td></tr><tr><td colspan="3"> 1o, phosphorothioate-C, E, phosphorothioate-G, F, phosphorothioate-A, jeg, inosine, Y, C eller T, R, A og G, K, T eller G, S, C eller G. </td></tr></tbody></table> Tabell 1. Sekvenser av modifiserte oligonukleotider for universell cpn60 PCR. <table border="1"><tbody><tr><td> Navn på reagens</td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> 1-Ethyl-3-(3-dimethylamiopropyl) carbodiimide HCl (EDC) </td><td> Pierce </td><td> 22980 </td><td></td></tr><tr><td> Fluorescent polystyren perler: Microplex Mikrokuler (Luminex), eller Bio-Plex COOH Bead (Bio-Rad) </td><td> Luminex eller Bio-Rad </td><td> Bio-Rad: 171-506xxx der xxx tilsvarer perlen identifikator </td><td> Magnetiske kuler blir tilgjengelig for oligonukleotid kobling og kan gi visse fordeler. Har ikke prøvd disse forfatterne. </td></tr><tr><td> Capture oligonukleotider (5 &#39;amino C12 modifisert) </td><td> Invitrogen, IDT, eller andre </td><td> ulike </td><td> Utvannet renhet nivået er akseptabelt. Sekvenser av fangst prober som brukes for å karakterisere vaginal Swabs er gitt i manuskriptet som denne protokollen er basert 13. </td></tr><tr><td> T7exonuclease </td><td> New England Biolabs </td><td> M0263S </td><td></td></tr><tr><td> Streptavidin-R-phycoerythrin (SA-PE) </td><td> Invitrogen </td><td> S-866 </td><td> Vær forsiktig med å oppnå høy renhetsgrad SA-PE, dette katalognummer anbefales </td></tr><tr><td> Termolommen 96 også PCR plater </td><td> Fisher </td><td> CS006509 </td><td> passe inn i både 96-godt thermocycler og BioPlex maskin </td></tr><tr><td> Termolomme forsegling matte </td><td> Fisher </td><td> CS006555 </td><td> Kan gjenbrukes, vask med såpevann, skyll godt og tørk </td></tr><tr><td> 5M TMAC </td><td> Sigma </td><td> T3411 </td><td></td></tr><tr><td> Bio-Plex eller Luminex instrument </td><td> Bio-Rad eller Luminex </td><td> Bio-Rad: 171-000201 </td><td></td></tr><tr><td> PrimerPlex programvare for probe utforming </td><td> Premier Biosoft </td><td> www.premierbiosoft.com </td><td> Forslag for Luminex probe deundertegne, selv om andre software plattformer kan brukes </td></tr></tbody></table> Tabell 2. Spesifikke reagenser og utstyr. <table border="1"><tbody><tr><td> komponent </td><td> mL / analysen </td><td> μl/100 assays </td><td> endelig konsentrasjon </td></tr><tr><td> 10x PCR buffer (Invitrogen) </td><td> 5 </td><td> 500 </td><td> 1x </td></tr><tr><td> 50 mM MgCl 2 (Invitrogen) </td><td> 2.5 </td><td> 250 </td><td> 2,5 mm </td></tr><tr><td> 10 mm dNTP </td><td> 1 </td><td> 100 </td><td> 0,2 mM hver </td></tr><tr><td> H279BP, 25 mM </td><td> 0,25 </td><td> 25 </td><td> 375 nM </td></tr><tr><td> H1612BP, 25 mM </td><td> 0,75 </td><td> 75 </td><td> 125 nM </td></tr><tr><td> H280, 25 mM </td><td> 0,25 </td><td> 25 </td><td> 375 nM </td></tr><tr><td> H1613,25 mM </td><td> 0,75 </td><td> 75 </td><td> 125 nM </td></tr><tr><td> Vann </td><td> 34 </td><td> 3400 </td><td> --- </td></tr><tr><td> Totals </td><td> 44,5 </td><td> 4450 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabell 3. Forslag til blandinger for PCR med modifiserte cpn60 UT grunning (Tabell 1). Analysen er satt opp for 5 mL av mal DNA og 0,5 mL (2.5U) av Taq DNA polymerase (Invitrogen). Normalt store volumer er forberedt på (f.eks tilstrekkelig for 100 analyser) og lagret ved -20 ° C.

multiplex detection of bacteria in complex clinical and environmental samples using oligonucleotide-coupled fluorescent microspheres

Bakteriell vaginose (BV) er et tilbakevendende polymikrobielle syndrom som er karakterisert ved en endring i &quot;normal&quot; microbiota fra Lactobacillus-dominert til et microbiota dominert av en rekke av bakterielle arter, inkludert Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae og andre 1-3. Denne tilstanden er forbundet med en rekke negative helseutfall, deriblant HIV anskaffelse 4, og det kan være vanskelig å håndtere klinisk 5. Videre har diagnosen BV stolt på bruk av Gram flekker av vaginal vattpinne utstryk som er scoret på ulike numeriske kriterier 6,7. Selv om dette diagnostiske er enkel, billig og godt egnet til ressurs-begrensede innstillinger, kan det lider av problemer knyttet til subjektive tolkninger og det gir ikke en detaljert profil av sammensetningen av vaginal microbiota 8. Nyere dype sekvensering innsats har avdekket en rik og mangfoldig vaginal microbiota medklare forskjeller mellom prøver tatt fra personer som er diagnostisert med BV i forhold til de individer som anses normal 9,10, noe som har resultert i identifisering av en rekke potensielle mål for molekylær diagnostikk av BV 11,12. Disse studiene har gitt et vell av nyttig informasjon, men dypt sekvensering er ennå ikke praktisk som en diagnostisk metode i en klinisk setting. Vi har nylig beskrevet en metode for raskt profilering vaginal microbiota i en multiplex format ved hjelp oligonukleotid-coupled fluoriserende perler med deteksjon på en Luminex plattform 13. Denne metoden, som nåværende Gram stain-baserte metoder, er rask og enkel, men legger den ekstra fordelen av å utnytte molekylær kunnskap oppstår fra sekvensering studier i probe design. Denne metoden gir derfor en måte å profilere viktige mikroorganismer som er tilstede i en vaginal vattpinne som kan brukes til å diagnostisere BV med høy spesifisitet og sensitivitet compared til Gram stain samtidig som det gir ytterligere informasjon om artene tilstedeværelse og overflod i en semi-kvantitativ og rask måte. Denne multiplex metoden kan utvides godt utover rekkevidden til dagens kvantitative PCR-analyser for aktuelle organismer, som er foreløpig begrenset til 5 eller 6 forskjellige analyser i en enkelt prøve 14. Viktigere, er metoden ikke begrenset til påvisning av bakterier i skjeden vattpinner og kan enkelt tilpasses raskt profilen nesten alle mikrobielle samfunn av interesse. For eksempel har vi nylig begynt å bruke denne metodikken til utvikling av diagnostiske verktøy for bruk i avløpsrenseanlegg.

Watch this Scientific Journal Video about Multiplex Detection of Bacteria in Complex Clinical and Environmental Samples using Oligonucleotide-coupled Fluorescent Microspheres at JoVE.com

Multiplex Detection of Bacteria in Complex Clinical and Environmental Samples using Oligonucleotide-coupled Fluorescent Microspheres

Vi beskriver en multiplex metode for påvisning av mikroorganismer i en prøve med oligonukleotid-kombinert fluoriserende perler. Amplicon fra alle organismer innen en prøve er hybridisert til et panel av probe-koblet perler. En Luminex eller Bio-Plex instrumentet brukes til å spørre hver perle for perle type og hybridisering signal.

Multiplex Påvisning av bakterier i Complex Clinical and Environmental Prøver å bruke oligonukleotid-coupled Fluorescent Mikrokuler

Bacterial vaginosis (BV) is a recurring polymicrobial syndrome that is characterized by a change in the "normal" microbiota from Lactobacillus-dominated ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

Use of Fluorescent Immuno-Chemistry for the detection of Edwardsiella ictaluri in channel catfish (I. punctatus) samples

Use of Fluorescent Immuno-Chemistry for the detection of Edwardsiella ictaluri in channel catfish I. punctatus samples

While Edwardsiella ictaluri is a major pathogen of channel catfish Ictalurus punctatus and has been discovered nearly 
three decades ago 1,2, so far, to ...

Determining the Phagocytic Activity of Clinical Antibody Samples

Bestemme phagocytic Activity of Clinical antistoff prøver

Antibody-driven phagocytosis is induced via the engagement of Fc receptors on professional phagocytes, and can contribute to both clearance as well as ...

Detection of Bacteria Using Fluorogenic DNAzymes

Påvisning av bakterier Bruke Fluorogenic DNAzymes

Outbreaks linked to food-borne and hospital-acquired pathogens account for millions of deaths and hospitalizations as well as colossal economic losses ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

Rapid Identifikasjon av gramnegative bakterier fra blodkultur buljong Bruke MALDI-TOF massespektrometri

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

In Situ Påvisning av autoreaktive CD4 T-celler i hjernen og hjertet Bruke store histocompatibility komplekse klasse II Dextramers

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin ...

In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA

In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA

In Situ påvisning av bakterier innenfor parafininnleiret Vev Bruke en digoksin-merket DNA Probe målretting 16S rRNA

The presence of bacteria within the pocket epithelium and underlying connective tissue in gingival biopsies from patients with periodontitis has been ...

A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis

A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis

En rask strategi for isolering av nye Faustoviruses fra miljøprøver ved hjelp<em&gt; Vermamoeba vermiformis</em

The isolation of giant viruses is of great interest in this new era of virology, especially since these giant viruses are related to protists. Giant ...

Developing a Salivary Antibody Multiplex Immunoassay to Measure Human Exposure to Environmental Pathogens

Utvikling av en spytt antistoff Multiplex Immunoassay å måle menneskelig eksponering for miljø patogener

The etiology and impacts of human exposure to environmental pathogens are of major concern worldwide and, thus, the ability to assess exposure and ...

Laboratory Techniques Used to Maintain and Differentiate Biotypes of Vibrio cholerae Clinical and Environmental Isolates

Laboratory Techniques Used to Maintain and Differentiate Biotypes of Vibrio cholerae Clinical and Environmental Isolates

Laboratorieteknikker brukes til å opprettholde og skille biotyper av<em&gt; Vibrio cholerae</em&gt; Kliniske og miljømessige isolater

The aquatic Gram-negative bacterium Vibrio cholerae is the etiological agent of the infectious gastrointestinal disease cholera. Due to the global ...