Name: multiplex detection of bacteria in complex clinical and environmental samples using oligonucleotide-coupled fluorescent microspheres
Uploaded: 2011-10-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multiplex Detection of Bacteria in Complex Clinical and Environmental Samples using Oligonucleotide-coupled Fluorescent Microspheres at JoVE.com

Мы благодарим Альберто Северини и Ванесса Goleski за помощь в развитии анализа и критических комментариев к этой рукописи. Эта работа была профинансирована Агентством общественного здравоохранения Канады и Промышленная программа содействия исследованиям (National Research Council Канады). Дополнительная поддержка была получена из Университета Фонда Публикации Саскачеван.

Этот метод был использован в исследованиях сообщается в Dumonceaux и соавт. J. Clin. 47. Microbiol, 4067-4077, DOI: 10.1128/jcm.00112-09 (2009). Схема изображением общей процедуры представлен на рисунке 1. 1. Бусы связи Это описывает методы, которые будут использоваться д...

<ol>
	<li>Hale, L. P., Swidsinski, A., Mendling, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria+associated+with+bacterial+vaginosis.">Bacteria associated with bacterial vaginosis.</a> N. Engl. J. Med. 354, 202-203 (2006).</li><li>Hay, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+in+the+littoral+zone:+lactobacilli+losing+the+plot.">Life in the littoral zone: lactobacilli losing the plot.</a> Sex. Transm. Infect. 81, 100-102 (2005).</li><li>Morris, M., Nicoll, A., Simms, I., Wilson, J., Catchpole, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+vaginosis:+a+public+health+review.">Bacterial vaginosis: a public health review.</a> Brit. J. Obstet. Gynecol. 108, 439-450 (2001).</li><li>Myer, L., Kuhn, L., Stein, Z. A., Wright, T. C., Denny, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravaginal+practices,+bacterial+vaginosis,+and+women's+susceptibility+to+HIV+infection:+epidemiological+evidence+and+biological+mechanisms.">Intravaginal practices, bacterial vaginosis, and women's susceptibility to HIV infection: epidemiological evidence and biological mechanisms.</a> Lancet. Infect. Dis. 5, 786-794 (2005).</li><li>Wilson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Managing+recurrent+bacterial+vaginosis.">Managing recurrent bacterial vaginosis.</a> Sex. Transm. Infect. 80, 8-11 (2004).</li><li>Nugent, R. P., Krohn, M. A., Hillier, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliability+of+diagnosing+bacterial+vaginosis+is+improved+by+a+standardized+method+of+gram+stain+interpretation.">Reliability of diagnosing bacterial vaginosis is improved by a standardized method of gram stain interpretation.</a> J. Clin. Microbiol. 29, 297-301 (1991).</li><li>Ison, C. A., Hay, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+simplified+grading+of+Gram+stained+vaginal+smears+for+use+in+genitourinary+medicine+clinics.">Validation of a simplified grading of Gram stained vaginal smears for use in genitourinary medicine clinics.</a> Sex. Transm. Infect. 78, 413-415 (2002).</li><li>Money, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+laboratory+diagnosis+of+bacterial+vaginosis.">The laboratory diagnosis of bacterial vaginosis.</a> Can. J. Infect. Dis. Med. Microbiol. 16, 77-79 (2005).</li><li>Schellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrosequencing+of+the+chaperonin-60+universal+target+as+a+tool+for+determining+microbial+community+composition.">Pyrosequencing of the chaperonin-60 universal target as a tool for determining microbial community composition.</a> Appl. Environ. Microbiol. 75, 2889-2898 (2009).</li><li>Spear, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+diversity+of+the+vaginal+microbiota+in+HIV-infected+and+HIV-uninfected+women+with+or+without+bacterial+vaginosis.">Comparison of the diversity of the vaginal microbiota in HIV-infected and HIV-uninfected women with or without bacterial vaginosis.</a> J. Infect. Dis. 198, 1131-1140 (2008).</li><li>Brotman, R. M., Ravel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ready+or+not:+the+molecular+diagnosis+of+bacterial+vaginosis.">Ready or not: the molecular diagnosis of bacterial vaginosis.</a> Clin. Infect. Dis. 47, 44-46 (2008).</li><li>Fredricks, D. N., Fiedler, T. L., Marrazzo, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+identification+of+bacteria+associated+with+bacterial+vaginosis.">Molecular identification of bacteria associated with bacterial vaginosis.</a> N. Engl. J. Med. 353, 1899-1911 (2005).</li><li>Dumonceaux, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+detection+of+bacteria+associated+with+normal+microbiota+and+with+bacterial+vaginosis+in+vaginal+swabs+by+use+of+oligonucleotide-coupled+fluorescent+microspheres.">Multiplex detection of bacteria associated with normal microbiota and with bacterial vaginosis in vaginal swabs by use of oligonucleotide-coupled fluorescent microspheres.</a> J. Clin. Microbiol. 47, 4067-4077 (2009).</li><li>Molenkamp, R., van der Ham, A., Schinkel, J., Beld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+of+five+different+DNA+targets+by+real-time+Taqman+PCR+using+the+Roche+LightCycler480:+Application+in+viral+molecular+diagnostics.">Simultaneous detection of five different DNA targets by real-time Taqman PCR using the Roche LightCycler480: Application in viral molecular diagnostics.</a> J. Virol. Meth. 141, 205-211 (2007).</li><li>Nikiforov, T. T., Rendle, R. B., Kotewicz, M. L., Rogers, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+phosphorothioate+primers+and+exonuclease+hydrolysis+for+the+preparation+of+single-stranded+PCR+products+and+their+detection+by+solid-phase+hybridization.">The use of phosphorothioate primers and exonuclease hydrolysis for the preparation of single-stranded PCR products and their detection by solid-phase hybridization.</a> PCR. Methods. Appl. 3, 285-291 (1994).</li><li>Hill, J. E., Penny, S. L., Crowell, K. G., Goh, S. H., Hemmingsen, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cpnDB:+A+Chaperonin+Sequence+Database.">cpnDB: A Chaperonin Sequence Database.</a> Genome. Res. 14, 1669-1675 (2004).</li><li>Bradshaw, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+association+of+Atopobium+vaginae+and+Gardnerella+vaginalis+with+bacterial+vaginosis+and+recurrence+after+oral+metronidazole+therapy.">The association of Atopobium vaginae and Gardnerella vaginalis with bacterial vaginosis and recurrence after oral metronidazole therapy.</a> J. Infect. Dis. 194, 828-836 (2006).</li><li>Dumonceaux, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enumeration+of+specific+bacterial+populations+in+complex+intestinal+communities+using+quantitative+PCR+based+on+the+chaperonin-60+target.">Enumeration of specific bacterial populations in complex intestinal communities using quantitative PCR based on the chaperonin-60 target.</a> J. Microbiol. Meth. 64, 46-62 (2006).</li></ol>

Специфику генерации сигнала имеет решающее значение, вы должны быть уверены, что сигнал, наблюдаемый действительно отражает обнаружения ампликона генерируется из этого организма. Программное обеспечение таких как PrimerPlex (Премьер Biosoft) может помочь разработать зондов, которые будут ск?...

<table border="1"><tbody><tr><td> Олигонуклеотидов имя </td><td> Компания </td><td> Последовательность 1 </td></tr><tr><td> H279BP </td><td rowspan="3"> Invitrogen, IDT, или другие </td><td> Биотин-OEFO GAIIIIGCIGGIGAYGGIACIACIAC </td></tr><tr><td> H280 </td><td> YKIYKITCICCRAAICCIGGIGCYTT </td></tr><tr><td> H1612BP </td><td> Биотин-OEFO GAIIIIGCIGGYGACGGYACSACSAC </td></tr><tr><td> H1613 </td><td></td><td> CGRCGRTCRCCGAAGCCSGGIGCCTT </td></tr><tr><td colspan="3"> 1O, фосфоротиоатные-C, E, фосфоротиоатные-G, F, фосфоротиоатные-, я, инозин, Y, C или T, R, или G, K, T и G, S, C и G. </td></tr></tbody></table> Таблица 1. Последовательности модифицированных олигонуклеотидов для универсального cpn60 ПЦР. <table border="1"><tbody><tr><td> Название реагента</td><td> Компания </td><td> Номер по каталогу </td><td> Комментарии </td></tr><tr><td> 1-этил-3-(3-dimethylamiopropyl) карбодиимида HCl (EDC) </td><td> Прокалывать </td><td> 22980 </td><td></td></tr><tr><td> Флуоресцентные бисера полистирола: MicroPlex микросфер (Luminex), или Bio-Plex COOH Бусы (Bio-Rad) </td><td> Luminex или Bio-Rad </td><td> Bio-Rad: 171-506xxx где ххх соответствует шарик идентификатор </td><td> Магнитные гранулы становятся доступными для олигонуклеотида связи и может предложить определенные преимущества. Не было осуждено этих авторов. </td></tr><tr><td> Захват олигонуклеотидов (5 &#39;аминокислот С12 модифицированный) </td><td> Invitrogen, IDT, или другие </td><td> различный </td><td> Обессоленная уровня чистоты является приемлемым. Последовательности захвата зонда используется для характеристики мазки из влагалища, которые представлены в рукописи, на которых этот протокол основан 13. </td></tr><tr><td> T7экзонуклеазная </td><td> New England Biolabs </td><td> M0263S </td><td></td></tr><tr><td> Стрептавидин-R-фикоэритрин (SA-PE) </td><td> Invitrogen </td><td> S-866 </td><td> Будьте осторожны, чтобы получить высокую чистоту SA-PE, это номер по каталогу рекомендуется </td></tr><tr><td> Гильзы 96-ПЦР пластины </td><td> Рыболов </td><td> CS006509 </td><td> вписывается в оба 96-луночного амплификаторе и Биоплексы машины </td></tr><tr><td> Гильза уплотнения мат </td><td> Рыболов </td><td> CS006555 </td><td> Может быть повторно использованы; промыть мыльной водой, хорошо промыть, и сухой </td></tr><tr><td> 5M ТЦМВ </td><td> Сигма </td><td> T3411 </td><td></td></tr><tr><td> Bio-Plex или Luminex инструмент </td><td> Bio-Rad или Luminex </td><td> Bio-Rad: 171-000201 </td><td></td></tr><tr><td> PrimerPlex программного обеспечения для проектирования зонд </td><td> Премьер Biosoft </td><td> www.premierbiosoft.com </td><td> Предлагаемые для Luminex зонд-де-знак, хотя и другие программные платформы могут быть использованы </td></tr></tbody></table> Таблица 2. Конкретные реактивов и оборудования. <table border="1"><tbody><tr><td> компонент </td><td> мкл / анализ </td><td> μl/100 анализов </td><td> Конечная концентрация </td></tr><tr><td> 10x ПЦР буфер (Invitrogen) </td><td> 5 </td><td> 500 </td><td> 1x </td></tr><tr><td> 50 мМ MgCl 2 (Invitrogen) </td><td> 2,5 </td><td> 250 </td><td> 2,5 мМ </td></tr><tr><td> 10 мМ дНТФ </td><td> 1 </td><td> 100 </td><td> 0,2 мМ каждого </td></tr><tr><td> H279BP, 25 мкМ </td><td> 0,25 </td><td> 25 </td><td> 375 нМ </td></tr><tr><td> H1612BP, 25 мкМ </td><td> 0,75 </td><td> 75 </td><td> 125 нМ </td></tr><tr><td> H280, 25 мкМ </td><td> 0,25 </td><td> 25 </td><td> 375 нМ </td></tr><tr><td> H1613,25 мкМ </td><td> 0,75 </td><td> 75 </td><td> 125 нМ </td></tr><tr><td> Воды </td><td> 34 </td><td> 3400 </td><td> --- </td></tr><tr><td> Итого </td><td> 44,5 </td><td> 4450 </td><td></td></tr></tbody></table> Таблица 3. Предлагаемые смеси для ПЦР с модифицированными cpn60 UT праймеров (табл. 1). Анализ настроен на 5 мкл ДНК-матрицы и 0,5 мкл (2.5U) из Taq ДНК-полимеразы (Invitrogen). Обычно большие объемы готовы (например, достаточном для 100 анализов) и хранили при температуре -20 ° C.

multiplex detection of bacteria in complex clinical and environmental samples using oligonucleotide-coupled fluorescent microspheres

Бактериальный вагиноз (БВ) является периодическим полимикробная синдром, который характеризуется изменением в &quot;нормальной&quot; микрофлоры из Lactobacillus доминируют в микробиоты доминируют числа видов бактерий, в том числе Gardnerella влагалищной, Atopobium влагалища и другие 1-3. Это условие связано с целым рядом негативных последствий для здоровья, включая ВИЧ приобретение 4, и это может быть трудно управлять клинически 5. Кроме того, диагноз БВ опирается на использование Грам пятна тампоном влагалищных мазков, которые забили на различные численные критерии 6,7. Хотя эта диагностическая простой, недорогой и хорошо подходит для ограниченных ресурсов, он может страдать от проблем, связанных с субъективной интерпретации и это не дает подробный профиль состав вагинальной микрофлоры 8. Последние глубокие усилия секвенирования показали, богатой, разнообразной микрофлоры вагинального счеткие различия между образцов, взятых у людей, которые с диагнозом БВ по сравнению с теми лицами, которые считаются нормальными 9,10, что привело к выявлению ряда потенциальных мишеней для молекулярной диагностики BV 11,12. Эти исследования предоставили массу полезной информации, но в глубине секвенирования еще не практичен, как метод диагностики в клинической практике. Мы недавно описанный метод для быстрого профилирования вагинальной микрофлоры в мультиплексе формате с использованием олигонуклеотидных связью люминесцентные бусины с обнаружением на платформе Luminex 13. Этот метод, как и текущие Граму основе методов, является быстрым и простым, но добавляет дополнительные преимущества использования молекулярного знания, вытекающие из исследования в последовательности зонда дизайна. Этот метод, следовательно, обеспечивает путь к профилю основных микроорганизмов, которые присутствуют в вагинальных мазка, который может быть использован для диагностики БВ с высокой специфичностью и чувствительностью макетared к Граму, обеспечивая при этом дополнительную информацию о наличии видов и изобилие в полуколичественного и быстрым способом. Этот мультиплекс метод может быть расширен за пределы диапазона текущей количественной ПЦР для отдельных организмов, которые в настоящее время ограничивается 5 или 6 различных анализов в одном образце 14. Важно отметить, что метод не ограничивается обнаружение бактерий в мазках вагинального и может быть легко адаптирована к быстро профиля практически любого микробного сообщества, представляющих интерес. Например, недавно мы начали применять эту методологию для разработки диагностических инструментов для использования в очистных сооружениях.

Watch this Scientific Journal Video about Multiplex Detection of Bacteria in Complex Clinical and Environmental Samples using Oligonucleotide-coupled Fluorescent Microspheres at JoVE.com

Multiplex Detection of Bacteria in Complex Clinical and Environmental Samples using Oligonucleotide-coupled Fluorescent Microspheres

Мы описываем мультиплекс метод обнаружения микроорганизмов в образце с использованием олигонуклеотидных связью флуоресцентные бусы. Ампликона из всех организмов, в пределах образца гибридизации с панели зонда связью бисером. Luminex или Bio-Plex инструмент используется для запроса каждая бусинка для бортовых и гибридизации типа сигнала.

Мультиплекс Обнаружение бактерий в сложных клинических и экологических пробах с использованием олигонуклеотидных связью Флуоресцентные Микросферы

Bacterial vaginosis (BV) is a recurring polymicrobial syndrome that is characterized by a change in the "normal" microbiota from Lactobacillus-dominated ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

Использование Пан-Вирусные Microarray анализ (Virochip), чтобы экран клинических образцов для вирусных патогенов

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

Use of Fluorescent Immuno-Chemistry for the detection of Edwardsiella ictaluri in channel catfish (I. punctatus) samples

Use of Fluorescent Immuno-Chemistry for the detection of Edwardsiella ictaluri in channel catfish I. punctatus samples

Использование флуоресцентных Иммуно-химия для обнаружения Edwardsiella ictaluri В канале сома ( I. punctatus) Образцов

While Edwardsiella ictaluri is a major pathogen of channel catfish Ictalurus punctatus and has been discovered nearly 
three decades ago 1,2, so far, to ...

Determining the Phagocytic Activity of Clinical Antibody Samples

Определение фагоцитарной активности Клинические образцы антител

Antibody-driven phagocytosis is induced via the engagement of Fc receptors on professional phagocytes, and can contribute to both clearance as well as ...

Detection of Bacteria Using Fluorogenic DNAzymes

Обнаружение бактерий с помощью флуорогенных DNAzymes

Outbreaks linked to food-borne and hospital-acquired pathogens account for millions of deaths and hospitalizations as well as colossal economic losses ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

Быстрое выявление грамотрицательных бактерий из крови культуральной жидкости Использование MALDI-TOF масс-спектрометрии

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

В Ситу обнаружения Аутореактивных CD4 Т-клеток в мозг и сердце Использование главного комплекса гистосовместимости Dextramers комплекс класса II

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin ...

In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA

In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA

В Ситу обнаружения бактерий внутри парафин тканей с использованием дигоксина меченных ДНК зонд таргетинга 16S рРНК

The presence of bacteria within the pocket epithelium and underlying connective tissue in gingival biopsies from patients with periodontitis has been ...

A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis

A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis

Быстрой стратегия для выделения новых Faustoviruses из проб окружающей среды Использование<em&gt; Vermamoeba vermiformis</em

The isolation of giant viruses is of great interest in this new era of virology, especially since these giant viruses are related to protists. Giant ...

Developing a Salivary Antibody Multiplex Immunoassay to Measure Human Exposure to Environmental Pathogens

Разработка слюнных антитела Multiplex иммуноанализа для измерения воздействия на человека окружающей среды патогенам

The etiology and impacts of human exposure to environmental pathogens are of major concern worldwide and, thus, the ability to assess exposure and ...

Laboratory Techniques Used to Maintain and Differentiate Biotypes of Vibrio cholerae Clinical and Environmental Isolates

Laboratory Techniques Used to Maintain and Differentiate Biotypes of Vibrio cholerae Clinical and Environmental Isolates

Лабораторные методы, используемые для поддержания и дифференциации биотипов<em&gt; Vibrio cholerae</em&gt; Клинические и экологические изоляты

The aquatic Gram-negative bacterium Vibrio cholerae is the etiological agent of the infectious gastrointestinal disease cholera. Due to the global ...