Name: multiplex detection of bacteria in complex clinical and environmental samples using oligonucleotide-coupled fluorescent microspheres
Uploaded: 2011-10-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multiplex Detection of Bacteria in Complex Clinical and Environmental Samples using Oligonucleotide-coupled Fluorescent Microspheres at JoVE.com

Vi tackar Alberto Severini och Vanessa Goleski för hjälp med analys utveckling och kritiska synpunkter på detta manuskript. Detta arbete har finansierats av Public Health Agency of Canada och Industrial Research Assistance Program (National Research Council of Canada). Ytterligare stöd erhölls från University of Saskatchewan Publikation fonden.

Denna metod användes i forskningen redovisas i Dumonceaux et al. J. Clin. . Microbiol 47, 4067-4077, doi: 10.1128/jcm.00112-09 (2009). En schematisk bild som visar hela förfarandet presenteras i Figur 1. 1. Bead koppling Detta beskriver de metoder som skall användas för koppling oligonukleotid prober till polystyren Luminex pärlor (se tabell 2). Volymerna är anpassade något för utvärdering av nya fångar sonder på fö...

<ol>
	<li>Hale, L. P., Swidsinski, A., Mendling, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria+associated+with+bacterial+vaginosis.">Bacteria associated with bacterial vaginosis.</a> N. Engl. J. Med. 354, 202-203 (2006).</li><li>Hay, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+in+the+littoral+zone:+lactobacilli+losing+the+plot.">Life in the littoral zone: lactobacilli losing the plot.</a> Sex. Transm. Infect. 81, 100-102 (2005).</li><li>Morris, M., Nicoll, A., Simms, I., Wilson, J., Catchpole, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+vaginosis:+a+public+health+review.">Bacterial vaginosis: a public health review.</a> Brit. J. Obstet. Gynecol. 108, 439-450 (2001).</li><li>Myer, L., Kuhn, L., Stein, Z. A., Wright, T. C., Denny, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravaginal+practices,+bacterial+vaginosis,+and+women's+susceptibility+to+HIV+infection:+epidemiological+evidence+and+biological+mechanisms.">Intravaginal practices, bacterial vaginosis, and women's susceptibility to HIV infection: epidemiological evidence and biological mechanisms.</a> Lancet. Infect. Dis. 5, 786-794 (2005).</li><li>Wilson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Managing+recurrent+bacterial+vaginosis.">Managing recurrent bacterial vaginosis.</a> Sex. Transm. Infect. 80, 8-11 (2004).</li><li>Nugent, R. P., Krohn, M. A., Hillier, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliability+of+diagnosing+bacterial+vaginosis+is+improved+by+a+standardized+method+of+gram+stain+interpretation.">Reliability of diagnosing bacterial vaginosis is improved by a standardized method of gram stain interpretation.</a> J. Clin. Microbiol. 29, 297-301 (1991).</li><li>Ison, C. A., Hay, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+simplified+grading+of+Gram+stained+vaginal+smears+for+use+in+genitourinary+medicine+clinics.">Validation of a simplified grading of Gram stained vaginal smears for use in genitourinary medicine clinics.</a> Sex. Transm. Infect. 78, 413-415 (2002).</li><li>Money, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+laboratory+diagnosis+of+bacterial+vaginosis.">The laboratory diagnosis of bacterial vaginosis.</a> Can. J. Infect. Dis. Med. Microbiol. 16, 77-79 (2005).</li><li>Schellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrosequencing+of+the+chaperonin-60+universal+target+as+a+tool+for+determining+microbial+community+composition.">Pyrosequencing of the chaperonin-60 universal target as a tool for determining microbial community composition.</a> Appl. Environ. Microbiol. 75, 2889-2898 (2009).</li><li>Spear, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+diversity+of+the+vaginal+microbiota+in+HIV-infected+and+HIV-uninfected+women+with+or+without+bacterial+vaginosis.">Comparison of the diversity of the vaginal microbiota in HIV-infected and HIV-uninfected women with or without bacterial vaginosis.</a> J. Infect. Dis. 198, 1131-1140 (2008).</li><li>Brotman, R. M., Ravel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ready+or+not:+the+molecular+diagnosis+of+bacterial+vaginosis.">Ready or not: the molecular diagnosis of bacterial vaginosis.</a> Clin. Infect. Dis. 47, 44-46 (2008).</li><li>Fredricks, D. N., Fiedler, T. L., Marrazzo, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+identification+of+bacteria+associated+with+bacterial+vaginosis.">Molecular identification of bacteria associated with bacterial vaginosis.</a> N. Engl. J. Med. 353, 1899-1911 (2005).</li><li>Dumonceaux, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+detection+of+bacteria+associated+with+normal+microbiota+and+with+bacterial+vaginosis+in+vaginal+swabs+by+use+of+oligonucleotide-coupled+fluorescent+microspheres.">Multiplex detection of bacteria associated with normal microbiota and with bacterial vaginosis in vaginal swabs by use of oligonucleotide-coupled fluorescent microspheres.</a> J. Clin. Microbiol. 47, 4067-4077 (2009).</li><li>Molenkamp, R., van der Ham, A., Schinkel, J., Beld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+of+five+different+DNA+targets+by+real-time+Taqman+PCR+using+the+Roche+LightCycler480:+Application+in+viral+molecular+diagnostics.">Simultaneous detection of five different DNA targets by real-time Taqman PCR using the Roche LightCycler480: Application in viral molecular diagnostics.</a> J. Virol. Meth. 141, 205-211 (2007).</li><li>Nikiforov, T. T., Rendle, R. B., Kotewicz, M. L., Rogers, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+phosphorothioate+primers+and+exonuclease+hydrolysis+for+the+preparation+of+single-stranded+PCR+products+and+their+detection+by+solid-phase+hybridization.">The use of phosphorothioate primers and exonuclease hydrolysis for the preparation of single-stranded PCR products and their detection by solid-phase hybridization.</a> PCR. Methods. Appl. 3, 285-291 (1994).</li><li>Hill, J. E., Penny, S. L., Crowell, K. G., Goh, S. H., Hemmingsen, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cpnDB:+A+Chaperonin+Sequence+Database.">cpnDB: A Chaperonin Sequence Database.</a> Genome. Res. 14, 1669-1675 (2004).</li><li>Bradshaw, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+association+of+Atopobium+vaginae+and+Gardnerella+vaginalis+with+bacterial+vaginosis+and+recurrence+after+oral+metronidazole+therapy.">The association of Atopobium vaginae and Gardnerella vaginalis with bacterial vaginosis and recurrence after oral metronidazole therapy.</a> J. Infect. Dis. 194, 828-836 (2006).</li><li>Dumonceaux, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enumeration+of+specific+bacterial+populations+in+complex+intestinal+communities+using+quantitative+PCR+based+on+the+chaperonin-60+target.">Enumeration of specific bacterial populations in complex intestinal communities using quantitative PCR based on the chaperonin-60 target.</a> J. Microbiol. Meth. 64, 46-62 (2006).</li></ol>

Specificiteten av signal generation är av avgörande betydelse, du måste vara säker på att signalen observeras verkligen återspeglar upptäckt av amplicon genereras från den skadegöraren. Program som PrimerPlex (Premier Biosoft) kan hjälpa till att utforma sonder som kommer hybridisera effektivt, men de kan eller inte kan över hybridiseras till icke-målarter. När samhällsomfattande PCR används som beskrivs i detta protokoll är det viktigt att hålla i minnet att amplicon genererade representerar alla de or...

<table border="1"><tbody><tr><td> Oligonukleotid namn </td><td> Företag </td><td> Sekvens 1 </td></tr><tr><td> H279BP </td><td rowspan="3"> Invitrogen, IDT, eller andra </td><td> Biotin-OEFO GAIIIIGCIGGIGAYGGIACIACIAC </td></tr><tr><td> H280 </td><td> YKIYKITCICCRAAICCIGGIGCYTT </td></tr><tr><td> H1612BP </td><td> Biotin-OEFO GAIIIIGCIGGYGACGGYACSACSAC </td></tr><tr><td> H1613 </td><td></td><td> CGRCGRTCRCCGAAGCCSGGIGCCTT </td></tr><tr><td colspan="3"> 1O, phosphorothioate-C, E, phosphorothioate-G, F, phosphorothioate-A, jag, inosin, Y, C eller T, R, A eller G, K, T eller G, S, C eller G. </td></tr></tbody></table> Tabell 1. Sekvenser av den modifierade oligonukleotider för allmän cpn60 PCR. <table border="1"><tbody><tr><td> Reagensets namn</td><td> Företag </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentarer </td></tr><tr><td> 1-Ethyl-3-(3-dimethylamiopropyl) carbodiimide HCl (EDC) </td><td> Pierce </td><td> 22.980 </td><td></td></tr><tr><td> Fluorescerande polystyren pärlor: MicroPlex Mikrosfärer (Luminex) eller Bio-Plex COOH Bead (Bio-Rad) </td><td> Luminex eller Bio-Rad </td><td> Bio-Rad: 171-506xxx där xxx motsvarar pärla identifierare </td><td> Magnetiska kulor blir tillgängliga för oligonukleotid koppling och kan erbjuda vissa fördelar. Har inte provat av dessa författare. </td></tr><tr><td> Capture oligonukleotider (5 &#39;amino C12 modifierad) </td><td> Invitrogen, IDT, eller andra </td><td> olika </td><td> Desalted renhetsgrad är acceptabelt. Sekvenser av tillfångatagandet prober används för att karakterisera vaginala kompresser finns i manuskriptet som detta protokoll bygger 13. </td></tr><tr><td> T7exonuclease </td><td> New England Biolabs </td><td> M0263S </td><td></td></tr><tr><td> Streptavidin-R-fykoerytrin (SA-PE) </td><td> Invitrogen </td><td> S-866 </td><td> Var noga med att få hög renhet SA-PE, detta katalognummer rekommenderas </td></tr><tr><td> Dykrör 96 och PCR-plattor </td><td> Fisher </td><td> CS006509 </td><td> passar in i både 96-brunnars termocykler och BioPlex maskin </td></tr><tr><td> Dykrör tätning matta </td><td> Fisher </td><td> CS006555 </td><td> Kan återanvändas, tvätta med tvål och vatten, skölj väl och torka </td></tr><tr><td> 5M TMAC </td><td> Sigma </td><td> T3411 </td><td></td></tr><tr><td> Bio-Plex eller Luminex instrument </td><td> Bio-Rad eller Luminex </td><td> Bio-Rad: 171-000201 </td><td></td></tr><tr><td> PrimerPlex programvara för givare utformning </td><td> Premier Biosoft </td><td> www.premierbiosoft.com </td><td> Föreslås för Luminex sond detecken, även om andra plattformar kan användas </td></tr></tbody></table> Tabell 2. Specifika reagenser och utrustning. <table border="1"><tbody><tr><td> komponent </td><td> l / analys </td><td> μl/100 analyser </td><td> slutlig koncentration </td></tr><tr><td> 10x PCR-buffert (Invitrogen) </td><td> 5 </td><td> 500 </td><td> 1x </td></tr><tr><td> 50 mM MgCl 2 (Invitrogen) </td><td> 2,5 </td><td> 250 </td><td> 2,5 mm </td></tr><tr><td> 10 mM dNTP </td><td> 1 </td><td> 100 </td><td> 0,2 mm vardera </td></tr><tr><td> H279BP, 25 mikroM </td><td> 0,25 </td><td> 25 </td><td> 375 nm </td></tr><tr><td> H1612BP, 25 mikroM </td><td> 0,75 </td><td> 75 </td><td> 125 nM </td></tr><tr><td> H280, 25 mikroM </td><td> 0,25 </td><td> 25 </td><td> 375 nm </td></tr><tr><td> H1613,25 mikroM </td><td> 0,75 </td><td> 75 </td><td> 125 nM </td></tr><tr><td> Vatten </td><td> 34 </td><td> 3400 </td><td> --- </td></tr><tr><td> Totals </td><td> 44,5 </td><td> 4450 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabell 3. Föreslagna blandningar för PCR med modifierad cpn60 UT primers (tabell 1). Analysen är inställd för 5 ìl mall DNA och 0,5 l (2.5U) av Taq DNA-polymeras (Invitrogen). Normalt stora volymer är beredda (t.ex. räcker till 100 analyser) och förvaras vid -20 ° C.

multiplex detection of bacteria in complex clinical and environmental samples using oligonucleotide-coupled fluorescent microspheres

Bakteriell vaginos (BV) är ett återkommande polymikrobiella syndrom som kännetecknas av en förändring i den &quot;normala&quot; mikroorganismer från Lactobacillus dominerade till en mikroorganismer som domineras av ett antal bakteriearter, inklusive Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae och andra 1-3. Detta tillstånd är förenat med en rad negativa hälsoeffekter, inklusive hiv förvärv 4, och det kan vara svårt att hantera kliniskt 5. Dessutom har diagnosen BV förlitat sig på användning av Gram fläckar av vaginal provstickan fläckar som är skårade på olika numeriska kriterier 6,7. Även om denna diagnos är enkel, billig och väl lämpad för begränsade resurser inställningar kan man drabbas av problem relaterade till subjektiva tolkningar och det inte ge en detaljerad profil av sammansättningen av vaginala mikroorganismer 8. Nyligen djupa sekvensering ansträngningar har avslöjat ett rikt, mångsidigt vaginal mikrobiota medtydliga skillnader mellan prover från personer som diagnostiseras med BV jämfört med de individer som anses normalt 9,10, vilket har resulterat i att identifiera ett antal potentiella mål för molekylär diagnostik av BV 11,12. Dessa studier har gett en mängd användbar information, men djupt sekvensering är ännu inte praktiskt som en diagnostisk metod i en klinisk miljö. Vi har nyligen beskrivit en metod för att snabbt profilering underlivet mikroorganismer i en multiplex format med oligonukleotid-kopplade fluorescerande pärlor med upptäckt på en Luminex plattform 13. Denna metod, precis som nuvarande gramfärgning-baserade metoder, är snabb och enkel men lägger till ytterligare en fördel att utnyttja molekylära kunskap som sekvensering studier i sond design. Denna metod ger därför ett sätt att profilera de stora mikroorganismer som finns i en vaginal pinnen som kan användas för att diagnostisera BV med hög specificitet och sensitivitet compared att gramfärgning samtidigt som den ger ytterligare information om arter närvaro och överflöd i en semikvantitativ och snabbt sätt. Denna multiplex metod är utbyggbart långt utöver utbudet av nuvarande kvantitativa PCR-analyser för vissa organismer, som för närvarande är begränsad till 5 eller 6 olika tester på ett enda prov 14. Viktigt är metoden inte begränsad till att upptäcka bakterier i slidan kompresser och kan lätt anpassas för att snabbt profilen nästan alla mikrobiella av intresse. Till exempel har vi nyligen börjat tillämpa denna metod för utveckling av diagnostiska verktyg för användning i avloppsreningsverk.

Watch this Scientific Journal Video about Multiplex Detection of Bacteria in Complex Clinical and Environmental Samples using Oligonucleotide-coupled Fluorescent Microspheres at JoVE.com

Multiplex Detection of Bacteria in Complex Clinical and Environmental Samples using Oligonucleotide-coupled Fluorescent Microspheres

Vi beskriver en multiplex metod för detektion av mikroorganismer i ett prov med hjälp oligonukleotid-kopplade fluorescerande pärlor. Amplicon från alla organismer i ett prov är hybridiseras till en panel bestående av sond-kopplade pärlor. En Luminex eller Bio-Plex instrument används för att fråga varje pärla för bead typ och hybridisering signal.

Multiplex detektion av bakterier i komplex klinisk och miljöprover med Oligonucleotide-kopplad fluorescerande mikrosfärer

Bacterial vaginosis (BV) is a recurring polymicrobial syndrome that is characterized by a change in the "normal" microbiota from Lactobacillus-dominated ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

Med hjälp av en Pan-Viral microarray analys (Virochip) till skärm kliniska prover för virala patogener

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

Use of Fluorescent Immuno-Chemistry for the detection of Edwardsiella ictaluri in channel catfish (I. punctatus) samples

Use of Fluorescent Immuno-Chemistry for the detection of Edwardsiella ictaluri in channel catfish I. punctatus samples

Användning av fluorescerande Immuno-kemi för upptäckt av Edwardsiella ictaluri I kanal havskatt ( I. punctatus) Prover

While Edwardsiella ictaluri is a major pathogen of channel catfish Ictalurus punctatus and has been discovered nearly 
three decades ago 1,2, so far, to ...

Determining the Phagocytic Activity of Clinical Antibody Samples

Fastställande av fagocyterande förmåga för klinisk Antibody prover

Antibody-driven phagocytosis is induced via the engagement of Fc receptors on professional phagocytes, and can contribute to both clearance as well as ...

Detection of Bacteria Using Fluorogenic DNAzymes

Detektering av bakterier med användning Fluorogena DNAzymes

Outbreaks linked to food-borne and hospital-acquired pathogens account for millions of deaths and hospitalizations as well as colossal economic losses ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

Snabb identifiering av gramnegativa bakterier från Blood Culture Broth Använda MALDI-TOF masspektrometri

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

In Situ Upptäckt av autoreaktiva CD4 T-celler i hjärna och hjärta Använda MHC klass II Dextramers

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin ...

In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA

In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA

In Situ Upptäckt av bakterier inom paraffininbäddade vävnader med hjälp av en Digoxin-märkt DNA-sond Inriktning 16S rRNA

The presence of bacteria within the pocket epithelium and underlying connective tissue in gingival biopsies from patients with periodontitis has been ...

A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis

A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis

En snabb strategi för isolering av nya Faustoviruses från miljöprover Använda<em&gt; Vermamoeba vermiformis</em

The isolation of giant viruses is of great interest in this new era of virology, especially since these giant viruses are related to protists. Giant ...

Developing a Salivary Antibody Multiplex Immunoassay to Measure Human Exposure to Environmental Pathogens

Utveckla en spott Antibody Multiplex immun att mäta människors exponering för miljö Pathogens

The etiology and impacts of human exposure to environmental pathogens are of major concern worldwide and, thus, the ability to assess exposure and ...

Laboratory Techniques Used to Maintain and Differentiate Biotypes of Vibrio cholerae Clinical and Environmental Isolates

Laboratory Techniques Used to Maintain and Differentiate Biotypes of Vibrio cholerae Clinical and Environmental Isolates

Laboratoriemetoder som används för att upprätthålla och differentiera biotyper av<em&gt; Vibrio cholerae</em&gt; Kliniska och miljömässiga isoleringar

The aquatic Gram-negative bacterium Vibrio cholerae is the etiological agent of the infectious gastrointestinal disease cholera. Due to the global ...