Name: multiplex detection of bacteria in complex clinical and environmental samples using oligonucleotide-coupled fluorescent microspheres
Uploaded: 2011-10-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multiplex Detection of Bacteria in Complex Clinical and Environmental Samples using Oligonucleotide-coupled Fluorescent Microspheres at JoVE.com

Alberto Severini ve Vanessa Goleski tahlil geliştirme ve bu yazının üzerine eleştirel yorumlar yardım için teşekkür ederim. Bu çalışma, Kanada Halk Sağlığı Ajansı ve Endüstriyel Araştırma Destek Programı (Kanada Ulusal Araştırma Konseyi) tarafından finanse edildi. Saskatchewan Üniversitesi Yayın Fonu Ek destek elde edildi.

Bu yöntem Dumonceaux ark bildirilen araştırma kullanılmıştır. J. Clin. Microbiol 47, 4067-4077, DOI: 10.1128/jcm.00112-09 (2009). Genel prosedürü anlatan şematik diyagramı Şekil 1&#39;de sunulmaktadır. 1. Boncuk kaplin (Bkz. Tablo 2) polistiren LUMINEX boncuk oligonükleotid problar kaplin için kullanılacak yöntemler açıklanmıştır. Hacimler yeni yakalama probları bir deneme olarak değerlendirilme...

<ol>
	<li>Hale, L. P., Swidsinski, A., Mendling, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria+associated+with+bacterial+vaginosis.">Bacteria associated with bacterial vaginosis.</a> N. Engl. J. Med. 354, 202-203 (2006).</li><li>Hay, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+in+the+littoral+zone:+lactobacilli+losing+the+plot.">Life in the littoral zone: lactobacilli losing the plot.</a> Sex. Transm. Infect. 81, 100-102 (2005).</li><li>Morris, M., Nicoll, A., Simms, I., Wilson, J., Catchpole, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+vaginosis:+a+public+health+review.">Bacterial vaginosis: a public health review.</a> Brit. J. Obstet. Gynecol. 108, 439-450 (2001).</li><li>Myer, L., Kuhn, L., Stein, Z. A., Wright, T. C., Denny, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravaginal+practices,+bacterial+vaginosis,+and+women's+susceptibility+to+HIV+infection:+epidemiological+evidence+and+biological+mechanisms.">Intravaginal practices, bacterial vaginosis, and women's susceptibility to HIV infection: epidemiological evidence and biological mechanisms.</a> Lancet. Infect. Dis. 5, 786-794 (2005).</li><li>Wilson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Managing+recurrent+bacterial+vaginosis.">Managing recurrent bacterial vaginosis.</a> Sex. Transm. Infect. 80, 8-11 (2004).</li><li>Nugent, R. P., Krohn, M. A., Hillier, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliability+of+diagnosing+bacterial+vaginosis+is+improved+by+a+standardized+method+of+gram+stain+interpretation.">Reliability of diagnosing bacterial vaginosis is improved by a standardized method of gram stain interpretation.</a> J. Clin. Microbiol. 29, 297-301 (1991).</li><li>Ison, C. A., Hay, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+simplified+grading+of+Gram+stained+vaginal+smears+for+use+in+genitourinary+medicine+clinics.">Validation of a simplified grading of Gram stained vaginal smears for use in genitourinary medicine clinics.</a> Sex. Transm. Infect. 78, 413-415 (2002).</li><li>Money, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+laboratory+diagnosis+of+bacterial+vaginosis.">The laboratory diagnosis of bacterial vaginosis.</a> Can. J. Infect. Dis. Med. Microbiol. 16, 77-79 (2005).</li><li>Schellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrosequencing+of+the+chaperonin-60+universal+target+as+a+tool+for+determining+microbial+community+composition.">Pyrosequencing of the chaperonin-60 universal target as a tool for determining microbial community composition.</a> Appl. Environ. Microbiol. 75, 2889-2898 (2009).</li><li>Spear, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+diversity+of+the+vaginal+microbiota+in+HIV-infected+and+HIV-uninfected+women+with+or+without+bacterial+vaginosis.">Comparison of the diversity of the vaginal microbiota in HIV-infected and HIV-uninfected women with or without bacterial vaginosis.</a> J. Infect. Dis. 198, 1131-1140 (2008).</li><li>Brotman, R. M., Ravel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ready+or+not:+the+molecular+diagnosis+of+bacterial+vaginosis.">Ready or not: the molecular diagnosis of bacterial vaginosis.</a> Clin. Infect. Dis. 47, 44-46 (2008).</li><li>Fredricks, D. N., Fiedler, T. L., Marrazzo, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+identification+of+bacteria+associated+with+bacterial+vaginosis.">Molecular identification of bacteria associated with bacterial vaginosis.</a> N. Engl. J. Med. 353, 1899-1911 (2005).</li><li>Dumonceaux, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+detection+of+bacteria+associated+with+normal+microbiota+and+with+bacterial+vaginosis+in+vaginal+swabs+by+use+of+oligonucleotide-coupled+fluorescent+microspheres.">Multiplex detection of bacteria associated with normal microbiota and with bacterial vaginosis in vaginal swabs by use of oligonucleotide-coupled fluorescent microspheres.</a> J. Clin. Microbiol. 47, 4067-4077 (2009).</li><li>Molenkamp, R., van der Ham, A., Schinkel, J., Beld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+of+five+different+DNA+targets+by+real-time+Taqman+PCR+using+the+Roche+LightCycler480:+Application+in+viral+molecular+diagnostics.">Simultaneous detection of five different DNA targets by real-time Taqman PCR using the Roche LightCycler480: Application in viral molecular diagnostics.</a> J. Virol. Meth. 141, 205-211 (2007).</li><li>Nikiforov, T. T., Rendle, R. B., Kotewicz, M. L., Rogers, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+phosphorothioate+primers+and+exonuclease+hydrolysis+for+the+preparation+of+single-stranded+PCR+products+and+their+detection+by+solid-phase+hybridization.">The use of phosphorothioate primers and exonuclease hydrolysis for the preparation of single-stranded PCR products and their detection by solid-phase hybridization.</a> PCR. Methods. Appl. 3, 285-291 (1994).</li><li>Hill, J. E., Penny, S. L., Crowell, K. G., Goh, S. H., Hemmingsen, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cpnDB:+A+Chaperonin+Sequence+Database.">cpnDB: A Chaperonin Sequence Database.</a> Genome. Res. 14, 1669-1675 (2004).</li><li>Bradshaw, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+association+of+Atopobium+vaginae+and+Gardnerella+vaginalis+with+bacterial+vaginosis+and+recurrence+after+oral+metronidazole+therapy.">The association of Atopobium vaginae and Gardnerella vaginalis with bacterial vaginosis and recurrence after oral metronidazole therapy.</a> J. Infect. Dis. 194, 828-836 (2006).</li><li>Dumonceaux, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enumeration+of+specific+bacterial+populations+in+complex+intestinal+communities+using+quantitative+PCR+based+on+the+chaperonin-60+target.">Enumeration of specific bacterial populations in complex intestinal communities using quantitative PCR based on the chaperonin-60 target.</a> J. Microbiol. Meth. 64, 46-62 (2006).</li></ol>

Özgüllük sinyal nesil kritik öneme sahiptir; sinyal gerçekten, o organizmanın elde Amplikon tespiti yansıtan gözlenen emin olmak gerekir. Yazılım PrimerPlex (Premier Biosoft) gibi verimli bir melezleşme olan problar tasarım için yardımcı olabilir, ancak kendilerinin veya hedef olmayan türler çapraz melezleşme değil olabilir. Bu protokol evrensel PCR primerleri açıklandığı gibi kullanıldığı zaman, üretilen Amplikon örnek mevcut organizmaların tümünü temsil ettiğini akılda tutmak öneml...

<table border="1"><tbody><tr><td> Oligonükleotid adı </td><td> Şirket </td><td> Sıra 1 </td></tr><tr><td> H279BP </td><td rowspan="3"> Invitrogen, IDT, ya da diğer </td><td> Biotin-OEFO GAIIIIGCIGGIGAYGGIACIACIAC </td></tr><tr><td> H280 </td><td> YKIYKITCICCRAAICCIGGIGCYTT </td></tr><tr><td> H1612BP </td><td> Biotin-OEFO GAIIIIGCIGGYGACGGYACSACSAC </td></tr><tr><td> H1613 </td><td></td><td> CGRCGRTCRCCGAAGCCSGGIGCCTT </td></tr><tr><td colspan="3"> 1O, phosphorothioate-C, E, phosphorothioate-G, F, phosphorothioate-A, I, inozin Y, C veya T, R, A ya da G, K, T, G, S, C veya G. </td></tr></tbody></table> Evrensel cpn60 PCR için modifiye oligonükleotidler Tablo 1: Diziler. <table border="1"><tbody><tr><td> Reaktifi Adı</td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> 1-Etil-3-(3-dimethylamiopropyl) carbodiimide HCl (EDC) </td><td> Delmek </td><td> 22980 </td><td></td></tr><tr><td> Floresan polistiren boncuklar: MicroPlex Mikroküreler (LUMINEX), ya da Bio-Plex COOH Boncuk (Bio-Rad) </td><td> LUMINEX veya Bio-Rad </td><td> Bio-Rad: 171-506xxx xxx boncuk tanımlayıcı tekabül </td><td> Manyetik boncuk oligonükleotid bağlamak için kullanılabilir hale geliyor ve bazı avantajlar sunabilir. Bu yazarlar tarafından denenmiş değil. </td></tr><tr><td> Yakalama oligonükleotidler (5 &#39;amino C12 modifiye) </td><td> Invitrogen, IDT, ya da diğer </td><td> çeşitli </td><td> Desalted saflık derecesi kabul edilir. Vajinal bezlerden karakterize etmek için kullanılan yakalama probları dizileri, bu protokolü 13 dayandığı el yazması sağlanır . </td></tr><tr><td> T7eksonükleaz </td><td> New England Biolabs </td><td> M0263S </td><td></td></tr><tr><td> Streptavidin-R-fikoeritrin (SA-PE) </td><td> Invitrogen </td><td> S-866 </td><td> Yüksek saflıkta SA-PE elde etmek için dikkatli olun; bu katalog numarası önerilir. </td></tr><tr><td> Termo 96 PCR plakaları </td><td> Balıkçı </td><td> CS006509 </td><td> 96-iyi PCR ve Bioplex makine sığacak </td></tr><tr><td> Termo sızdırmazlık mat </td><td> Balıkçı </td><td> CS006555 </td><td> Yeniden kullanılabilir; sabunlu su ile yıkayın, iyice durulayın ve kuru </td></tr><tr><td> 5M TMAC </td><td> Sigma </td><td> T3411 </td><td></td></tr><tr><td> Bio-Plex veya LUMINEX aracı </td><td> Bio-Rad veya LUMINEX </td><td> Bio-Rad: 171-000201 </td><td></td></tr><tr><td> Prob tasarım PrimerPlex yazılımı </td><td> Premier Biosoft </td><td> www.premierbiosoft.com </td><td> LUMINEX prob de için önerilendiğer yazılım platformlarında kullanılan olsa da, işaret </td></tr></tbody></table> Tablo 2. Belirli reaktifler ve ekipmanları. <table border="1"><tbody><tr><td> bileşen </td><td> ul / tahlil </td><td> μl/100 deneyleri </td><td> nihai konsantrasyonu </td></tr><tr><td> 10x PCR buffer (Invitrogen) </td><td> 5 </td><td> 500 </td><td> 1x </td></tr><tr><td> 50 mM MgCl 2 (Invitrogen) </td><td> 2,5 </td><td> 250 </td><td> 2.5 mM </td></tr><tr><td> 10 mM dNTP </td><td> 1 </td><td> 100 </td><td> Her biri 0.2 mM </td></tr><tr><td> H279BP, 25 mcM </td><td> 0,25 </td><td> 25 </td><td> 375 nM </td></tr><tr><td> H1612BP, 25 mcM </td><td> 0,75 </td><td> 75 </td><td> 125 nM </td></tr><tr><td> H280, 25 mcM </td><td> 0,25 </td><td> 25 </td><td> 375 nM </td></tr><tr><td> H1613,25 mcM </td><td> 0,75 </td><td> 75 </td><td> 125 nM </td></tr><tr><td> Su </td><td> 34 </td><td> 3400 </td><td> --- </td></tr><tr><td> Toplamları </td><td> 44,5 </td><td> 4450 </td><td></td></tr></tbody></table> Tablo 3: Önerilen modifiye cpn60 UT primerleri ile PCR (Tablo 1) karışımları. Testi DNA ve Taq DNA polimeraz (Invitrogen) 0.5 ul (2.5U) 5 ul için ayarlanır. Normalde büyük miktarlarda hazırlanır (örneğin 100 deneyleri için yeterli) ve -20 ° C&#39;de saklanır

multiplex detection of bacteria in complex clinical and environmental samples using oligonucleotide-coupled fluorescent microspheres

Bakteriyel vajinozis (BV), &quot;normal&quot; Mikrobiyota Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae de dahil olmak üzere çok sayıda bakteri türlerinin hakim olduğu bir Mikrobiyota Lactobacillus-egemen, ve diğerleri 1-3 bir değişiklik ile karakterize tekrarlayan polimikrobiyal bir sendromdur. Bu durum, HIV satın alma 4 de dahil olmak üzere, olumsuz sağlık sonuçları, bir dizi ile ilişkili olup, klinik olarak 5 yönetmek için zor olabilir. Ayrıca, BV tanısı, çeşitli sayısal kriterleri 6,7 puan vajinal sürüntü smear Gram boyama güvendi . Bu tanı, basit, ucuz ve kaynak sınırlı ayarları iyi uygun olmasına rağmen, sübjektif ve vajinal Mikrobiyota 8 kompozisyon ayrıntılı bir profilini vermez sorunları muzdarip olabilir. Yeni derin sıralama çabaları ile zengin, çeşitli vajinal Mikrobiyota ortaya koymuşturbir dizi BV 11,12 moleküler tanı için potansiyel hedefler belirlenmesi sonuçlandı Normal 9,10 olarak bireylere kıyasla BV tanısı kişilerden alınan örnekler arasında belirgin farklılıklar. Bu çalışmalar yararlı bilgiler bir zenginlik var, ama derin sıralama henüz klinik bir ortamda bir tanı yöntemi olarak pratik değildir. Biz son zamanlarda hızla LUMINEX platformu 13 algılama oligonükleotid çiftli florasan boncuklar kullanılarak, çok katlı bir biçimi vajinal Mikrobiyota profil için bir yöntem tanımlanmıştır. Bu yöntem, mevcut Gram boyama tabanlı yöntemler gibi basit ve hızlı ama prob tasarım çalışmaları sıralama kaynaklanan moleküler bilgi sömürmek için ek bir avantaj katıyor. Bu yöntem, bu nedenle, BV, spesifite ve duyarlılığı yüksek comp ile teşhis etmek için kullanılabilecek bir vajinal sürüntü bulunan önemli mikroorganizmalar profil bir yol sağlaryarı-kantitatif ve hızlı bir şekilde türlerin varlığı ve bolluk hakkında ek bilgi sağlarken Gram boyama ared. Bu çoklama yöntemi, şu anda tek bir örnek 14 5 veya 6 farklı deneyleri ile sınırlı belirli organizmalar için geçerli kantitatif PCR testleri aralığının dışında genişletilebilir. Önemlisi, bu yöntem vajinal bezlerden bakteri tespit sınırlı değil ve hızla ilgi hemen hemen her mikrobik bir topluluk profil kolayca adapte edilebilir. Örneğin, son zamanlarda, atıksu arıtma tesislerinde kullanım için tanı araçları geliştirme metodolojisini uygulamak için başladı.

Watch this Scientific Journal Video about Multiplex Detection of Bacteria in Complex Clinical and Environmental Samples using Oligonucleotide-coupled Fluorescent Microspheres at JoVE.com

Multiplex Detection of Bacteria in Complex Clinical and Environmental Samples using Oligonucleotide-coupled Fluorescent Microspheres

Oligonükleotid çiftli florasan boncuklar kullanarak bir örnek içinde mikroorganizmaların tespiti için çoklama yöntemi açıklar. Bir örnek içindeki tüm organizmalar Amplikon bir panel prob-çiftli boncuk melezleşmiştir. LUMINEX veya Bio-Plex enstrüman, boncuk, boncuk türü ve hibridizasyon sinyali için her bir sorgu için kullanılır.

Oligonükleotid çiftli Floresan Mikroküreler kullanarak Kompleksi Klinik ve Çevre Örneklerinde Bakterilerin Multiplex Algılama

Bacterial vaginosis (BV) is a recurring polymicrobial syndrome that is characterized by a change in the "normal" microbiota from Lactobacillus-dominated ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

Viral Patojenler Klinik Örnekler Ekranına bir Pan-Viral Mikroarray Testi (Virochip)

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

Use of Fluorescent Immuno-Chemistry for the detection of Edwardsiella ictaluri in channel catfish (I. punctatus) samples

Use of Fluorescent Immuno-Chemistry for the detection of Edwardsiella ictaluri in channel catfish I. punctatus samples

Floresan immuno-Kimya tespiti için kullanılması Edwardsiella ictaluri Kanal kedibalığı ( I. punctatus) Örnekleri

While Edwardsiella ictaluri is a major pathogen of channel catfish Ictalurus punctatus and has been discovered nearly 
three decades ago 1,2, so far, to ...

Determining the Phagocytic Activity of Clinical Antibody Samples

Klinik Antikor Örnekleri fagositik Aktivitesi Belirlenmesi

Antibody-driven phagocytosis is induced via the engagement of Fc receptors on professional phagocytes, and can contribute to both clearance as well as ...

Detection of Bacteria Using Fluorogenic DNAzymes

Flourogenik DNAzymes kullanarak Bakterilerin Tespiti

Outbreaks linked to food-borne and hospital-acquired pathogens account for millions of deaths and hospitalizations as well as colossal economic losses ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

MALDI-TOF kütle spektrometrisi kullanılarak kan kültür besi yerinden, Gram negatif bakterilerin hızlı belirlenmesi

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

Majör Histo-uyum Kompleks sınıf II Dextramers kullanarak Beyin ve Heart reaktif CD4 T hücrelerinin in situ tespiti

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin ...

In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA

In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA

16S rRNA Hedefleme Digoksin-etiketli DNA probu kullanılarak Parafine gömülmüş dokular içinde Bakterilerin in situ tespiti

The presence of bacteria within the pocket epithelium and underlying connective tissue in gingival biopsies from patients with periodontitis has been ...

A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis

A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis

Kullanımı Çevre Örneklerinde Yeni Faustoviruses İzolasyonunda bir Hızlı Stratejisi<em&gt; Vermamoeba vermiformis</em

The isolation of giant viruses is of great interest in this new era of virology, especially since these giant viruses are related to protists. Giant ...

Developing a Salivary Antibody Multiplex Immunoassay to Measure Human Exposure to Environmental Pathogens

Bir Tükürük Antikor Multiplex Immuoassay Gelişmekte Çevre Patojenler İnsan Pozlama&#39;yı Tedbir

The etiology and impacts of human exposure to environmental pathogens are of major concern worldwide and, thus, the ability to assess exposure and ...

Magnetic Stirrer Method for the Detection of Trichinella Larvae in Muscle Samples

Magnetic Stirrer Method for the Detection of Trichinella Larvae in Muscle Samples

Tespiti için Manyetik Karıştırıcı Yöntemi<em&gt; Trichinella</emKas Samples&gt; Larva

Trichinellosis is a debilitating disease in humans and is caused by the consumption of raw or undercooked meat of animals infected with the nematode ...