Name: production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors
Uploaded: 2011-11-27T14:00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors at JoVE.com

انظر الشكل 1 للمزيد من التوضيح يلخص بروتوكول التالية. ملاحظة السلامة : جميع المواد التي تم في اتصال مع الجسيمات الفيروسية تجميعها يجب تطهيرها بمحلول مطهر Virkon أو مناسبة أخرى. 1. إعداد مخزونات DNA البلازميد (~ 2 أيام) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مطلوبة البلازميدات التالية : 1 <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> pRV1 -- تحتوي على معدل رسملة AAV2 ومتواليات </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> pH21 -- تحتوي على معدل رسملة AAV1 ومتواليات </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> pFdelta6 -- اتش مساعد في البلازميد </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> AAV البلازميد التي تحتوي على شريط كاسيت التعبير المؤتلف يحيط بها إشارات AAV2 التعبئة والتغليف (يكرر محطة المقلوب ، نظام الإسناد الأرضي) </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حين ينبغي أن تزرع في pFdelta6 Stbl2 الخلايا المختصة لمنع حذف جزئية ، يمكن أن تنمو وpRV1 pH21 DH5alpha في الخلايا المختصة. يمكن زراعتها في البلازميدات AAV Stbl2 الخلايا إذا الحذف جزئية تحدث في الخلايا DH5alpha. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">وينبغي أن الحمض النووي بلازميد تكون ذات جودة عالية وخالية من الملوثات الحمض النووي الريبي. ويمكن فحص البلازميدات لسلامة استخدام هضم التالية : <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> pRV1 -- هضم XbaI مع اعطاء عصابات من 7.5 كيلو بايت و 3.8 كيلوبايت </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> pH21 -- هضم EcoRI مع اعطاء عصابات 4.5 كيلوبايت ، 2.8 كيلو بايت و 0.2 كيلوبايت </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> pFdelta6 -- هضم HindIII مع اعطاء عصابات 5.5 كيلوبايت ، 3 كيلو و 3 كيلو بايت ، كيلوبايت 2.3 و 1.5 كيلوبايت </li></ul></li></ol> 2. إعداد الإنسان خلايا الكلى 293 (Hek293) الجنينية لترنسفكأيشن (2 -- 3 أيام) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة two 80 ٪ متموجة 150 سم 2 من القوارير Hek293 الخلايا إلى خمسة أطباق بقطر 15 سم نونك زراعة الأنسجة. وينبغي أن تكون خلايا 70-80 ٪ متموجة قبل ترنسفكأيشن (حوالي 48 ساعة بعد الطلاء). الثقافة في خلايا النسر Dulbecco القياسية لتعديل المتوسطة (DMEM) مع انخفاض الجلوكوز تحتوي على 10 ٪ الجنين مصل العجل ويو 100 / البنسلين مل / 100 الستربتوميسين ميكروغرام / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل 3 ساعات ترنسفكأيشن إزالة DMEM واستبدالها مع Iscove&#39;ق تعديل Dulbecco المتوسطة في (IMDM) التي تحتوي على 5 ٪ الجنين العجل المصل. </li></ol> 3. ترنسفكأيشن من البلازميدات الفيروسي (~ 1 ساعة لترنسفكأيشن و 3 أيام للحضانة) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد ما يلي لدفعة واحدة (5 × الطول الأنسجة لوحات الثقافة 15) من الفيروس : <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 62.5 ميكروغرام AAV البلازميد </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 125 ميكروغرام pFdelta6 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 31.25 ميكروغرام pRV1 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 31.25 ميكروغرام pH21 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1650 م 2.5 ميكروليتر CaCl 2 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 12 مل درهم 2 O </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في تصفية الطبقة الأنسجة 2 غطاء الثقافة العقيمة ترنسفكأيشن الخليط في أنبوب 50 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بينما vortexing الحل ، بسرعة إضافة 13 مل من HEPES × 2 مخزنة المالحة (7.05 درجة الحموضة). استبدال غطاء أنبوب 50 مل والاستمرار في دوامة لمدة 15 ثانية. ترك الوقوف لمدة 1 دقيقة 45 ثانية ، وينبغي أن يعجل غرامة أبيض النموذج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة بلطف 5 مل من محلول ترنسفكأيشن إلى كل طبق 15 سم زراعة الأنسجة. لوحات دوامة لخلط والعودة إلى الحاضنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 16 ساعة بعد إزالة ترنسفكأيشن IMDM المتوسطة واستبدالها مع DMEM. </li></ol> 4. Lysing من الخلايا وحصاد rAAVs (2 ساعة) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 72 ساعة ترنسفكأيشن ، وإزالة وسائل الاعلام من لوحات ونبذ ثقافة الخلية. وينبغي معاملة جميع النفايات بمحلول مطهر Virkon أو مناسبة أخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل بلطف الخلايا في الفوسفات مخزنة المالحة الدافئة 1X (PBS ، درجة الحموضة 7.4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 25 مل PBS الحار كل لوحة وإزالة الخلايا برفق مع مكشطة الخلية. جمع نظام التعليق في 50 مل من الأنابيب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا بيليه في 800 x ج لمدة 10 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل وطاف بيليه resuspend في 150 مم كلوريد الصوديوم ، و 20 ملي تريس درجة الحموضة 8.0 ، استخدام 10 مل لكل لوحة زراعة الأنسجة. انقسام في أنابيب 50 two مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اعداد جديدة من حل deoxycholate الصوديوم 10 ٪ في DH 2 O. إضافة 1.25 مل من هذا إلى كل أنبوب لتركيز النهائي من 0.5 ٪. إضافة benzonase nuclease إلى تركيز النهائي من 50 وحدة لكل مل. مزيج أنبوب دقيق. </li><lط&gt; احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الحطام الخلوية بواسطة الطرد المركزي في 3000 x ج لمدة 15 دقيقة. نقل إلى أنبوب جديد 50 مل ، وضمان تمت إزالة جميع الأنقاض الخلية لمنع تجميد الأعمدة الهيبارين (راجع الخطوة 5). في هذه المرحلة ، يمكن تخزين العينات في -20 درجة مئوية قبل متابعة العمل. لقد كنا تخزين العينات لعدة أسابيع في -20 درجة مئوية دون أي تخفيض في نقل العدوى. </li></ol> 5. الهيبارين تنقية عمود rAAVs (2 -- 3 ساعات) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أعمدة الإعداد الهيبارين HiTrap باستخدام مضخة تمعجية بحيث تتدفق من خلال حلول العمود في 1 مل في الدقيقة للخطوات 5،2-5،4. فمن المهم لضمان تقديم أي فقاعات الهواء في العمود الهيبارين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يوازن العمود مع 10 مل كلوريد الصوديوم 150 ملم ، 20 ملم تريس ، ودرجة الحموضة 8.0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق حل 50 مل الفيروس إلى العمود والسماح لتدفق من خلال. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل العمود مع 20 مل من كلوريد الصوديوم 100 ملم ، 20 ملم تريس ، ودرجة الحموضة 8.0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام حقنة 5 مل تستمر لغسل ث العمودإيث 1 مل كلوريد الصوديوم 200 ملي ، 20 ملي تريس ، ودرجة الحموضة 8.0 ، تليها 1 مل كلوريد الصوديوم 300 ملم ، 20 ملم تريس ، ودرجة الحموضة 8.0. تجاهل التدفق من خلال. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5 مل باستخدام الحقن ورقيقة أزل الضغط على الفيروس من خلال تطبيق العمود : <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1.5 مل كلوريد الصوديوم 400 ملم ، 20 ملم تريس ، ودرجة الحموضة 8.0 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 3.0 مل 450 مم كلوريد الصوديوم ، و 20 ملي تريس ، ودرجة الحموضة 8.0 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1.5 مل كلوريد الصوديوم 500 ملم ، 20 ملم تريس ، ودرجة الحموضة 8.0 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع هذه الطرد المركزي في أنبوب 15 مل. </li></ul></li></ol> 6. تركيز والترشيح العقيمة rAAVs (1 ساعة) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تركيز النواقل باستخدام Amicon فائقة 4 وحدات الطرد المركزي تصفية مع قطع 100،000 الوزن الجزيئي. تحميل 4 مل من شطافة في العمود المكثف والطرد المركزي في 2000 x ج لمدة 2 دقيقة (في درجة حرارة الغرفة). تجاهل flowthrough والمكثف مع الحل تحديث الفيروس المتبقية وكرر الطرد المركزي. وينبغي أن يتركز على حجم ما يقرب من 250 ميكرولتر. إذا كان حجم تتركز أكثر بكثير من ذلك ، تجاهل ر تدفقhrough وتواصل أجهزة الطرد المركزي في أحد الخطوات حتى اللحظة حجم ما يقرب من 250 ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 250 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لفيروس عن الحجم النهائي من 500 ميكروليتر وإزالته من مكثف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصفية ناقلات خلال 13 ملم قطرها 0.2 ميكرون تصفية المحاقن. وينبغي aliquoted ناقلات وتخزينها على -80 درجة مئوية حتى المطلوبة. </li></ol> 7. Titering المخزونات الفيروسية (3 أيام) هذا يتطلب أن مروج نشط في الخلايا Hek293 يقود مراسل الجين أو الجينات منتج للكشف immunocytochemically. عندما المنتجة للناقل غير متوافق مع Hek293 الخلايا يمكن أن تستخدم خطوط الخلايا الأخرى أو ثقافات الخلية الأولية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 18 - L - بولي يسين coverslips الزجاج المطلي أو 18 بئرا من الشرائح غرفة نونك التي بذر Hek293 الخلايا بحيث أنها ما بين 40 -- 50 ٪ متموجة. لمعايرة من لجنة المساواة العرقية التي تعتمد على استخدام rAAVs Hek293 الخلايا التي ستابلي عن لجنة المساواة العرقية recombinase 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصيب كل بئر مع د التسلسليilutions من ناقلات AAV (الشكل 2A). استخدام 3 آبار في التخفيف. نضيف بشكل روتيني الفيروس مباشرة إلى كل بئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 72 ساعة الإصلاح Hek293 الخلايا من خلال إضافة حجم مساو من بارافورمالدهيد 4 ٪ (PFA) والمتوسطة (إعطاء تركيز النهائي من PFA 2 ٪) لمدة عشر دقائق في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلية ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني ، في شطف درهم 2 O وساترة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب عدد الخلايا transduced من الآبار الثلاث التي لديها أعلى عامل التخفيف ، ولكن لا تزال تحتوي على الخلايا المصابة ، والعثور على المتوسط ​​وتتضاعف هذه العوامل التي تعطي لتخفيف عدد الوحدات المعدية لكل ميكروليتر (الشكل 2B). </li></ol> 8. النتائج المتوقعة transduced Hek293 الخلايا مع ترميز الفيروس تظهر خضراء معززة بروتين فلوري (eGFP) في الشكل 2B. نحقق عموما التتر ثابت من حوالي 6 × 6 10 جزيئات معدية للتر الواحد الجزئي. نحن نستخدم بشكل روتيني هذه نواقل inje التجسيميction في الدماغ القوارض الكبار. وهذا يوفر تقنية قوية لمنطقة محددة التعبير الجيني 2. الجمع بين هذه الخلية مع خصوصية المنطقة من نوع التعبير الجيني انتقائية نحن حقن recombinase لجنة المساواة العرقية التي تعتمد على rAAVs في المناطق المستهدفة من لجنة المساواة العرقية ، الفئران المعدلة وراثيا 2. الشكل 2C - E يظهر أمثلة من الحقن التجسيمي من لجنة المساواة العرقية التي تعتمد على الترميز rAAVs eGFP في مناطق مختلفة من الدماغ الفئران المعدلة وراثيا لا أخلاقي parvalbumin - 3 لجنة المساواة العرقية. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/3348/3348fig1.jpg" /> الشكل 1. توضيح تخطيطي لبروتوكول لانتاج rAAV. 1 هي مطلي) Hek293 الخلايا وتنمو ل70-80 التقاء ٪. 2) ومستعدون AAV المساعد البلازميدات وtransfected Hek293 في الخلايا. 3) يتم تغيير متوسطة مرة أخرى إلى 16 ساعة بعد DMEM ترنسفكأيشن ومثقف Hek293 الخلايا لمدة 56 ساعة. 4. تحصد) Hek293 الخلايا وlysed. يتم فصل ناقلات rAAV من حطام خلية جentrifugation. 5) يتم تنقية الجزيئات الفيروسية من خلال أعمدة الهيبارين قبل الاعتقال والتعقيم. 6) تزرع Hek293 الخلايا على 24 لوحات جيدة وتصيب مع التخفيفات التسلسلي للناقلات AAV لتحديد عدد الوحدات المعدية. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/3348/3348fig2.jpg" /> الشكل 2. Titering والتطبيق في الجسم الحي / 2 rAAV1. (أ) من إعداد Hek293 الخلايا لقياس عيار الفيروسية. وtransduced Hek293 الخلايا مع التخفيفات المتسلسلة لrAAVs. C ، والسيطرة المعافين ؛ N ، 1 ميكرولتر من الأسهم فيروسية غير مخفف. (ب) Hek293 الخلايا المصابة مع rAAVs معربا عن eGFP. غير المقيد (م) التعبير eGFP الفيروسية لجنة المساواة العرقية ، معربا عن الخلايا العصبية في المناطق المستهدفة مختلفة من الفئران المعدلة وراثيا ، لجنة المساواة العرقية parvalbumin بعد الحقن التجسيمي من لجنة المساواة العرقية التي تنشط rAAVs. تظهر الصور أمثلة تفاعلية مناعية في GFP الشاحبة المهاد شبكي وكرة (C) ، (D) في التلفيف المسنن و (E) في المنطقة CA1 من الحصين. ج ، ديntate التلفيف ؛ RT ، نواة مهادي شبكي ؛ GP ، الكرة الشاحبة. أشرطة النطاق : B ، 500 ميكرون ، C ، 100 ميكرون ، D ، 100 ميكرون ، E ، و 500 ميكرون.

<ol>
	<li>Klugmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV-mediated+hippocampal+expression+of+short+and+long+Homer+1+proteins+differentially+affect+cognition+and+seizure+activity+in+adult+rats.">AAV-mediated hippocampal expression of short and long Homer 1 proteins differentially affect cognition and seizure activity in adult rats.</a> Molecular and Cellular Neurosciences. 28, 347-360 (2005).</li><li>Murray, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parvalbumin-positive+CA1+interneurons+are+required+for+spatial+working+but+not+for+reference+memory.">Parvalbumin-positive CA1 interneurons are required for spatial working but not for reference memory.</a> Nature Neuroscience. 14, 297-299 (2011).</li><li>Hippenmeyer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+developmental+switch+in+the+response+of+DRG+neurons+to+ETS+transcription+factor+signaling.">A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling.</a> PLoS Biology. 3, e159-e159 (2005).</li><li>Hauck, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+characterization+of+chimeric+recombinant+AAV+vectors.">Generation and characterization of chimeric recombinant AAV vectors.</a> Molecular Therapy. 7, 419-425 (2003).</li><li>Halbert, C. L., Allen, J. M., Miller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+type+6+(AAV6)+vectors+mediate+efficient+transduction+of+airway+epithelial+cells+in+mouse+lungs+compared+to+that+of+AAV2+vectors.">Adeno-associated virus type 6 (AAV6) vectors mediate efficient transduction of airway epithelial cells in mouse lungs compared to that of AAV2 vectors.</a> Journal of Virology. 75, 6615-6615 (2001).</li><li>Blankinship, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transduction+of+skeletal+muscle+using+vectors+based+on+adeno-associated+virus+serotype+6.">Efficient transduction of skeletal muscle using vectors based on adeno-associated virus serotype 6.</a> Molecular Therapy. 10, 671-678 (2004).</li><li>Wu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+amino+acid+changes+can+influence+titer,+heparin+binding,+and+tissue+tropism+in+different+adeno-associated+virus+serotypes.">Single amino acid changes can influence titer, heparin binding, and tissue tropism in different adeno-associated virus serotypes.</a> Journal of Virology. 80, 11393-11397 (2006).</li><li>Dong, J. Y., Fan, P. D., Frizzell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+the+packaging+capacity+of+recombinant+adeno-associated+virus.">Quantitative analysis of the packaging capacity of recombinant adeno-associated virus.</a> Human gene therapy. 7, 2101-2112 (1996).</li><li>Zolotukhin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+purification+of+serotype+1,+2,+and+5+recombinant+adeno-associated+viral+vectors.">Production and purification of serotype 1, 2, and 5 recombinant adeno-associated viral vectors.</a> Methods. 1, 158-167 (2002).</li><li>Burova, E., Loffe, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatographic+purification+of+recombinant+adenoviral+and+adeno-associated+viral+vectors:+methods+and+implications.">Chromatographic purification of recombinant adenoviral and adeno-associated viral vectors: methods and implications.</a> Gene Therapy. 12, 5-17 (2005).</li><li>Zolotukhin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+adeno-associated+virus+purification+using+novel+methods+improves+infectious+titer+and+yield.">Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield.</a> Gene Therapy. 6, 973-985 (1999).</li><li>Bilbao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+gene+expression+from+in+utero+delivery+of+adenoviral-associated+vector+serotype+1.">Patterns of gene expression from in utero delivery of adenoviral-associated vector serotype 1.</a> Human Gene Therapy. 16, 678-684 (2005).</li><li>Pilpel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=reproducible+transduction+of+select+forebrain+regions+by+targeted+recombinant+virus+injection+into+the+neonatal+mouse+brain.">reproducible transduction of select forebrain regions by targeted recombinant virus injection into the neonatal mouse brain.</a> Journal of Neuroscience Methods. 182, 55-63 (2009).</li><li>Mastakov, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+injection+of+rAAV+with+mannitol+enhances+gene+expression+in+the+rat+brain.">Combined injection of rAAV with mannitol enhances gene expression in the rat brain.</a> Molecular Therapy. 3, 225-232 (2001).</li><li>Fu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-complementary+adeno-associated+virus+serotype+2+vector:+global+distribution+and+broad+dispersion+of+AAV-mediated+transgene+expression+in+mouse+brain.">Self-complementary adeno-associated virus serotype 2 vector: global distribution and broad dispersion of AAV-mediated transgene expression in mouse brain.</a> Molecular Therapy. 8, 911-917 (2003).</li><li>Ghosh, A., Yue, Y., Duan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Transgene+Reconstitution+with+Hybrid+Dual+AAV+Vectors+Carrying+the+Minimized+Bridging+Sequences.">Efficient Transgene Reconstitution with Hybrid Dual AAV Vectors Carrying the Minimized Bridging Sequences.</a> Human Gene Therapy. 22, 77-83 (2011).</li><li>McCarty, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-complementary+AAV+vectors;+advances+and+applications.">Self-complementary AAV vectors; advances and applications.</a> Molecular Therapy. 16, 1648-1656 (2008).</li><li>Georgiadis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV-mediated+knockdown+of+peripherin-2+in+vivo+using+miRNA-based+hairpins.">AAV-mediated knockdown of peripherin-2 in vivo using miRNA-based hairpins.</a> Gene Therapy. 17, 486-493 (2010).</li><li>Atasoy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FLEX+switch+targets+Channelrhodopsin-2+to+multiple+cell+types+for+imaging+and+long-range+circuit+mapping.">A FLEX switch targets Channelrhodopsin-2 to multiple cell types for imaging and long-range circuit mapping.</a> The Journal of Neuroscience. 28, 7025-7030 (2008).</li><li>Guggenhuber, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV+Vector-Mediated+Overexpression+of+CB1+Cannabinoid+Receptor+in+Pyramidal+Neurons+of+the+Hippocampus+Protects+against+Seizure-Induced+Excitoxicity.">AAV Vector-Mediated Overexpression of CB1 Cannabinoid Receptor in Pyramidal Neurons of the Hippocampus Protects against Seizure-Induced Excitoxicity.</a> PLoS One. 5, e15707-e15707 (2010).</li><li>Lawlor, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+delivery+and+selective+transduction+of+glial+cells+in+the+mammalian+brain+by+AAV+serotypes+isolated+from+nonhuman+primates.">Efficient gene delivery and selective transduction of glial cells in the mammalian brain by AAV serotypes isolated from nonhuman primates.</a> Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 17, 1692-1702 (2009).</li><li>Chtarto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetracycline-inducible+transgene+expression+mediated+by+a+single+AAV+vector.">Tetracycline-inducible transgene expression mediated by a single AAV vector.</a> Gene Therapy. 10, 84-94 (2003).</li><li>Han, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+humoral+immune+response+to+the+tetracycline+(Tet)+activator+in+rats+injected+intracranially+with+Tet-off+rAAV+vectors.">Lack of humoral immune response to the tetracycline (Tet) activator in rats injected intracranially with Tet-off rAAV vectors.</a> Gene Therapy. 17, 616-625 (2010).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

ناقلات rAAV أصبحت ذات قيمة متزايدة لفي الدراسات المجراة على الحيوانات. هنا ، وقد وصفت لدينا بروتوكول بسيطة وغير مكلفة لrAAVs المنتجة ، والتي قد تسهل تطبيق على نطاق واسع من هذه النواقل مفيدة عن طريق تجنب الاستعانة بمصادر خارجية مكلفة لإنتاج فيروس للشركات. البروتوكول (على أساس مرجعية 1) يصف إنتاج النواقل rAAV1 / 2 التي تحتوي على البروتينات قفيصة خيالية من كلا الوالدين المصليين في نسب متساوية 4. تنقية ناقلات rAAV ملزمة لأعمدة الهيبارين يعتمد على التعبير عن AAV2 البروتينات قفيصة ، ولكن يمكن دمجها مع غيرها من الأنماط المصلية من AAV1 الواردة هنا. بالإضافة إلى ذلك ، تم الإبلاغ عن AAV6 ربط الهيبارين ، على الرغم من تقارب مع انخفاض ، ويحتمل أن يطهر الهيبارين مع الأعمدة باستخدام هذا الإجراء 5،6. وتجدر الإشارة إلى أنه مع ذلك ، أن الأنماط المصلية الأخرى سوف تتطلب تركيزات مختلفة من كلوريد الصوديوم لشطف العمود 5،7 الهيبارين. وقد تبين التغليف الجينوم rAAV أن أمثل بين 4.1 و 4.9 كيلو بايت مع انخفاض حاد في كفاءة التعبئة تصل إلى 5.2 كيلو بايت 8. ويمكن اعتبار هذا الحد التغليف أكبر عيوب النظام rAAV ، وعادة ما يتحقق منذ الخلية نوع معين من التنظيم من قبل رابطة الدول المستقلة التعبير التحوير كبيرة تعمل العناصر التي لا يمكن استيعابها داخل جزيئات AAV الصغيرة. للتغلب على دفعات عيار منخفضة ، مثل تلك الناجمة عن محاولة مجموعة الجينات التي هي قريبة إلى حد التعبئة AAV نحن الجمع بين دفعات منفصلة تتركز الفيروسية إلى 250 ميكروليتر في الدفعة 500 one ميكرولتر ، بدلا من إضافة برنامج تلفزيوني على النحو المبين في الخطوة 6.3. ويمكن تحقيق موثوق الخلية من نوع محدد من الفئران تنبيغ لجنة المساواة العرقية الجمع بين السائق وأشرطة rAAV الشرطي (انظر أدناه) لتجنب تمتد حدود التعبئة والتغليف. من الملاحظة ، في حين أن هذا البروتوكول محاولات لتوفير سهلة المتابعة تعليمات لإنتاج طن عاليةمعبر rAAV ، فإنه يتطلب وجود البروتين قفيصة AAV2 شاردات لتنقية اللوني التي تقارب الهيبارين. يجب تنقيتها من الأنماط المصلية الأخرى AAV2 باستخدام إجراءات بديلة 9. ميزة واحدة من العمود تنقية الهيبارين يعتقد أن انتاج ناقلات AAV التي أكبر معدل العدوى من تلك المنتجة باستخدام التدرج كلوريد السيزيوم 10. ومع ذلك ، هناك أيضا بعض العيوب لهذا الأسلوب. على سبيل المثال ، قد البروتينات الأخرى التي تربط الهيبارين أيضا أن تكون موجودة في المخزون الفيروسية المنقى. في حين يمكن أن تؤثر على النواقل tropism - الهيبارين تنقيته من عيار 10 ناقلات ، نهجنا خصيصا لاستهداف إما 20 أو استثارية الخلايا العصبية المثبطة (الشكل 2) توظف لجنة المساواة العرقية التي يسببها تفعيل التعبير التحوير AAV بوساطة وعيار مستقلة. بديل لتنقية العمود الهيبارين هو استخدام لكثافة iodixanol التدرج ، والتي تنتج أعلى عيار الفيروسية وإعداد أنقى من استخدامكلوريد السيزيوم الانحدار 10. ويمكن أيضا أن تكون هذه الطريقة جنبا إلى جنب مع عمود تنقية الهيبارين لانتاج ناقلات أكبر من 99 ٪ نقية 11. لذلك ، النظر بعناية الاحتياجات التي يتعين اتخاذها من قبل الجماعات الفردية على النحو الذي الفيروسية الأسلوب هو الأفضل لتنقية تطبيقها المصب معينة. المشكلة الأكثر شيوعا المرتبطة بهذا البروتوكول هو عيار الفيروسية منخفضة. ويمكن في تجربتنا هذه عادة أن تعزى إلى انخفاض كفاءة ترنسفكأيشن ، أو شطف من الفيروس من الأعمدة الهيبارين. وينبغي أن تكون جميع المواد ترنسفكأيشن في درجة حرارة الغرفة قبل ترنسفكأيشن ، ويجب أن يتم تنفيذ transfections اختبار للعثور على أفضل الظروف في كل مختبر. طرق أخرى لنقل العدوى ، مثل lipofectamine ، وكفاءة عالية ، ولكن يمكن أن تكون باهظة التكلفة. بالإضافة إلى ذلك ، التركيز ودرجة الحموضة من الحلول العمود شطف الهيبارين هو أمر حاسم لشطف كاملة virions من الأعمدة witho الهيبارينالتحرير الضرر. نقطة أخرى مهمة هي أن الخلايا التعبئة والتغليف يجب أن تلتزم أيضا إلى السطح من الأطباق زراعة الأنسجة. إذا كانت الخلايا فصل في مرحلة ما أثناء إجراء ينصح لإنهاء التجربة وتذويب قارورة جديدة من الخلايا. ويتحقق بسهولة السيطرة المكانية والزمانية التعبير التحوير في القوارض من خلال استهداف تشريحية دقيقة والمرحلة التنموية للحيوان. وقد أظهرت كفاءة نقل الجينات AAV بوساطة 12،13 في الرحم. الكبار في الدماغ ، يمكن تعديلها المنطقة المصابة مع جزيئات rAAV بعد حقن صغيرة جدا من التجسيمي المناطق المستهدفة ، إلى مناطق أكبر من ذلك بكثير ، ليس فقط بسبب التغيرات في عيار الفيروسية ولكن أيضا عن طريق تغيير معالم الحقن. وتشمل هذه حجم وسرعة الحقن وإدراج مانيتول البوليول مع تعليق الفيروس 14. ويمكن أيضا أن تستخدم لمانيتول تعزيز العدوى من مجموعة متنوعة من الأنسجة بعد الحقن rAAV النظامية 15 &lt;/ سوب&gt;. قدرة التعبئة والتغليف من rAAV (حوالي 4.7 كيلوبايت) وربما كان أهم عامل يحد من حيث الجينات التي يمكن التعبير عن هذه النواقل الفيروسية. ومع ذلك ، فقد أظهرت الدراسات الحديثة أنه يمكن التغلب على هذه الجينات جزئيا تقسيم أكبر أو أشرطة التعبير إلى نواقل rAAV منفصلة وإدخال تسلسل سد ، وبدء التعبير الجيني عندما تصيب virions نفس الخلية 16. ويمكن أيضا مستويات التعبير عن الجينات التي تحملها ناقلات rAAV ستتعزز إلى حد كبير باستخدام الذاتي مجانية ناقلات rAAV 17. حقن التجسيمي ناقلات rAAV يوفر السريع ، وطريقة رخيصة وقوية لحمل الجينات في المنطقة بطريقة محددة. ويمكن في تركيبة مع 2 استراتيجيات الجيل الثاني تدخل الحمض النووي الريبي أيضا 18 rAAVs تستعمل لمنطقة محددة الجينات نهدم. ويمكن الجمع بين لجنة المساواة العرقية ، rAAVs مع الفئران المعدلة وراثيا أو خلية من نوع المروجين محددة لتحقيق الدوائر ونوع الخليةمحددة التعبير الجيني ، مما يتيح التلاعب الجيني لقرار مكانية عالية 2،19-21 ، بينما rAAVs مع تركيب نظام مثل تيت ويضيف السيطرة الزمنية على الفيروس بوساطة 22،23 التعبير الجيني ، وهذه الأمثلة توضح إمكانات هائلة اندماجي من هذه النواقل و ويتوقع حدوث زيادة سريعة في rAAV الدراسات المستندة على مدى السنوات القادمة.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم الكاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> مرشحات Amicon الطرد المركزي الترا </td><td> ميليبور </td><td> UFC810024 </td><td> 100000 MWCO </td></tr><tr><td> Benzonase nuclease </td><td> سيغما الدريخ </td><td> E1014 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbeco لتعديل النسر المتوسط ​​(DMEM) </td><td> Invitrogen </td><td> 10567014 </td><td> الملحق مع FCS 10 ٪ والوحدات 10 / مل penicillin/100 الستربتوميسين ميكروغرام / مل </td></tr><tr><td> Hek293 الخلايا </td><td> جمع نوع الثقافة الأميركية </td><td> CRL - 1573 </td><td> استخدامها في مرور أقل من 30 </td></tr><tr><td> HEPES مخزنة المالحة </td><td> سيغما الدريخ </td><td> 51558 </td><td></td></tr><tr><td> HiTrap الهيبارين خرطوشة </td><td> سيغماالدريخ </td><td> 54836 </td><td></td></tr><tr><td> Iscove لتعديل Dulbecco والمتوسطة </td><td> Invitrogen </td><td> 12440-053 </td><td> الملحق مع FCS 5 ٪ </td></tr><tr><td> الصوديوم deoxycholate </td><td> سيغما الدريخ </td><td> D5670 </td><td> حل جديد لجعل كل دفعة </td></tr><tr><td> أطباق 15 سم زراعة الأنسجة </td><td> فيشر العلمية </td><td> 157150 </td><td></td></tr><tr><td> Stbl2 الخلايا المختصة </td><td> Invitrogen </td><td> 10268-019 </td><td></td></tr><tr><td> Virkon الحل </td><td> فيشر العلمية </td><td> NC9821357 </td><td> ترك بين عشية وضحاها لتطهير قبل رميه لاستنزاف </td></tr></tbody></table> الجدول 1. الكواشف المحددة اللازمة لبروتوكول

production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors

في السنوات الأخيرة الغدة المؤتلف المرتبطة النواقل الفيروسية (AAV) أصبحت ذات قيمة متزايدة لفي الدراسات المجراة على الحيوانات ، وهنا أيضا يجري اختباره حاليا في تجارب اكلينيكية على البشر. من النوع البري AAV عضو غير ممرضة للأسرة وparvoviridae بطبيعتها النسخ التي تعاني من نقص. جعلت ملف تنبيغ واسع ، استجابة مناعية منخفضة وكذلك التعبير التحوير قوية ومستمرة مع هذه الناقلة حققت لهم أداة شعبية وتنوعا لفي المختبر والمجراة في توصيل الجينات. rAAVs يمكن بسهولة وبثمن بخس المنتجة في المختبرات ، واستنادا الى البيانات الشخصية للسلامتهم مواتية ، وتعطى عادة لتصنيف السلامة منخفضة. هنا ، نحن تصف طريقة لانتاج وtitering من rAAVs خيالية تحتوي على البروتينات قفيصة كلا AAV1 وAAV2. استخدام هذه الناقلات ما يسمى خيالية يجمع بين فوائد كل من الأنماط المصلية الأبوية مثل الأسهم عيارات عالية (AAV1) وتنقيةالتي تقارب اللوني (AAV2). هذه الأنماط المصلية AAV هي أفضل درس لجميع الأنماط المصلية AAV ، ويكون فرديا نمط العدوى واسعة. ينبغي للناقلات خيالية وصفها هنا لديهم خصائص المعدية وAAV1 AAV2 وبالتالي يمكن توقع أن تصيب مجموعة كبيرة من الأنسجة ، بما في ذلك الخلايا العصبية ، الهيكل العظمي والعضلات والبنكرياس والكلى وغيرها. يعتقد أن الأسلوب أسلوب الموصوفة هنا يستخدم الهيبارين تنقية العمود ، لإعطاء أعلى عيار الفيروسية وإعداد أنظف من وسائل تنقية الفيروسية الأخرى ، مثل الطرد المركزي من خلال التدرج كلوريد السيزيوم. بالإضافة إلى ذلك ، وصف لنا كيف يمكن أن تكون هذه الناقلة بسرعة وسهولة titered لإعطاء قراءة دقيقة لعدد من الجزيئات المعدية المنتجة.

Watch this Scientific Journal Video about Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors at JoVE.com

Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors

الغدة المؤتلف المرتبطة بفيروس (rAAVs) ناقلات أصبحت ذات قيمة متزايدة لل<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; دراسات في الحيوانات. نحن تصف كيف يمكن أن تنتج rAAVs في المختبر ، وكيف يمكن titered هذه النواقل لإعطاء قراءة دقيقة لعدد من الجزيئات المعدية المنتجة.

إنتاج وناقلات Titering الغدة المؤتلف المرتبطة الفيروسية

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently ...

production-and-titering-of-recombinant-adeno-associated-viral-vectors

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Recombinant Retroviral Production and Infection of B Cells

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control of a heterologous expression system to facilitate the analysis of the resulting phenotype. This approach can be used to express a gene that is not normally found in the organism, to express a mutant form of a gene product, or to over-express a dominant-negative form of the gene product. It is particularly useful in the study of the hematopoetic system, where transcriptional regulation is a major control mechanism in the development and differentiation of B cells 1, reviewed in 2-4.
Mouse genetics is a powerful tool for the study of human genes and diseases. A comparative analysis of the mouse and human genome reveals conservation of synteny in over 90% of the genome 5. Also, much of the technology used in mouse models is applicable to the study of human genes, for example, gene disruptions and allelic replacement 6. However, the creation of a transgenic mouse requires a great deal of resources of both a financial and technical nature. Several projects have begun to compile libraries of knock out mouse strains (KOMP, EUCOMM, NorCOMM) or mutagenesis induced strains (RIKEN), which require large-scale efforts and collaboration 7. Therefore, it is desirable to first study the phenotype of a desired gene in a cell culture model of primary cells before progressing to a mouse model. 
Retroviral DNA integrates into the host DNA, preferably within or near transcription units or CpG islands, resulting in stable and heritable expression of the packaged gene of interest while avoiding transcriptional silencing 8 9. The genes are then transcribed under the control of a high efficiency retroviral promoter, resulting in a high efficiency of transcription and protein production. Therefore, retroviral expression can be used with cells that are difficult to transfect, provided the cells are in an active state during mitosis. Because the structural genes of the virus are contained within the packaging cell line, the expression vectors used to clone the gene of interest contain no structural genes of the virus, which both eliminates the possibility of viral revertants and increases the safety of working with viral supernatants as no infectious virions are produced 10. 
Here we present a protocol for recombinant retroviral production and subsequent infection of splenic B cells. After isolation, the cultured splenic cells are stimulated with Th derived lymphokines and anti-CD40, which induces a burst of B cell proliferation and differentiation 11. This protocol is ideal for the study of events occurring late in B cell development and differentiation, as B cells are isolated from the spleen following initial hematopoetic events but prior to antigenic stimulation to induce plasmacytic differentiation.

An efficient system of structure and function analysis of a gene in an ex vivo culture of splenic B-lymphocytes is described. This method takes advantage of recombinant retroviral production in a helper free, ecotrophic packaging cell line. Stable, heritable expression of a gene of interest within primary lymphocytes is achieved leading to generation of surface antibodies on B cells undergoing class switch recombination.

المؤتلف إنتاج فيروسات الرجعية والعدوى من خلايا B

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control ...

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the generation of extreme population diversity that facilitates virus adaptation and evolution. Increasing evidence shows that the intrinsic error rates, and the resulting mutation frequencies, of RNA viruses can be modulated by subtle amino acid changes to the viral polymerase. Although biochemical assays exist for some viral RNA polymerases that permit quantitative measure of incorporation fidelity, here we describe a simple method of measuring mutation frequencies of RNA viruses that has proven to be as accurate as biochemical approaches in identifying fidelity altering mutations. The approach uses conventional virological and sequencing techniques that can be performed in most biology laboratories. Based on our experience with a number of different viruses, we have identified the key steps that must be optimized to increase the likelihood of isolating fidelity variants and generating data of statistical significance. The isolation and characterization of fidelity altering mutations can provide new insights into polymerase structure and function1-3. Furthermore, these fidelity variants can be useful tools in characterizing mechanisms of virus adaptation and evolution4-7.

The present article describes the steps required to isolate and characterize RNA polymerase fidelity variants of RNA viruses and how to use mutation frequency data to confirm fidelity changes in tissue culture.

بمعزل عن المتغيرات الاخلاص للفيروسات الحمض النووي الريبي وتوصيف التردد يتحور الفيروس

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. Several downstream applications require large quantities of pure viral DNA, which is provided by this protocol. These applications include viral genome sequencing, where the removal of host DNA is crucial to optimize data output for viral sequences, and the production of new viral recombinant strains, where co-transfection of purified plasmid and linear viral DNA facilitates recombination.1,2,3 
This procedure utilizes a combination of extractions and density-based centrifugation to isolate purified linear herpesvirus nucleocapsid DNA from infected cells.4,5 The initial purification steps aim to isolate purified viral capsids, which contain and protect the viral DNA during the extractions and centrifugation steps that remove cellular proteins and DNA. Lysis of nucleocapsids then releases viral DNA, and two final phenol-chloroform steps remove remaining proteins. The final DNA captured from solution is highly concentrated and pure, with an average OD260/280 of 1.90. Depending on the quantity of infected cells used, yields of viral DNA range from 150-800 &mu;g or more. The purity of this DNA makes it stable during long-term storage at 4C. This DNA is thus ideally suited for high-throughput sequencing, high fidelity PCR reactions, and transfections. 
Prior to beginning the protocol, it is important to know the average number of cells per dish (e.g. an average of 8 x 106 PK-15 cells in a confluent 15 cm dish), and the titer of the viral stock to be used (e.g. 1 x 108 plaque-forming units per ml). These are necessary to calculate the appropriate multiplicity of infection (MOI) for the protocol.6 For instance, to infect one 15 cm dish of PK-15 cells with the above viral stock, at an MOI of 5, you would use 400 &mu;l of viral stock and dilute it with 3.6 ml of medium (total inoculation volume of 4 ml for one 15 cm plate).
Multiple viral DNA preparations can be prepared at the same time. The number of simultaneous preparations is limited only by the number of tubes held by the ultracentrifuge rotor (one per virus; see step 3.9 below). Here we describe the procedure as though being done for one virus.

We describe the process of isolating high purity herpesvirus nucleocapsid DNA from infected cells. The final DNA captured from solution is of high concentration and purity, making it ideally suited for high-throughput sequencing, high fidelity PCR reactions, and transfections to produce new viral recombinants.

إعداد الحمض النووي الفيروسي من Nucleocapsids

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. ...

Efficient Recombinant Parvovirus Production with the Help of Adenovirus-derived Systems

Rodent parvoviruses (PV) such as rat H-1PV and MVM, are small icosahedral, single stranded, DNA viruses. Their genome includes two promoters P4 and P38 which regulate the expression of non-structural (NS1 and NS2) and capsid proteins (VP1 and VP2) respectively1. They attract high interest as anticancer agents for their oncolytic and oncosuppressive abilities while being non-pathogenic for humans2. NS1 is the major effector of viral cytotoxicity3. In order to further enhance their natural antineoplastic activities, derivatives from these vectors have been generated by replacing the gene encoding for the capsid proteins with a therapeutic transgene (e.g. a cytotoxic polypeptide, cytokine, chemokine, tumour suppressor gene etc.)4. The recombinant parvoviruses (recPVs) vector retains the NS1/2 coding sequences and the PV genome telomeres which are necessary for viral DNA amplification and packaging. Production of recPVs occurs only in the producer cells (generally HEK293T), by co-transfecting the cells with a second vector (pCMV-VP) expressing the gene encoding for the VP proteins (Fig. 1)4. The recPV vectors generated in this way are replication defective. Although recPVs proved to possess enhanced oncotoxic activities with respect to the parental viruses from which they have been generated, their production remains a major challenge and strongly hampers the use of these agents in anti-cancer clinical applications.
We found that introduction of an Ad-5 derived vector containing the E2a, E4(orf6) and the VA RNA genes (e.g. pXX6 plasmid) into HEK293T improved the production of recPVs by more than 10 fold in comparison to other protocols in use. Based on this finding, we have constructed a novel Ad-VP-helper that contains the genomic adenoviral elements necessary to enhance recPVs production as well as the parvovirus VP gene unit5. The use of Ad-VP-helper, allows production of rec-PVs using a protocol that relies entirely on viral infection steps (as opposed to plasmid transfection), making possible the use of cell lines that are difficult to transfect (e.g. NB324K) (Fig. 2). We present a method that greatly improves the amount of recombinant virus produced, reducing both the production time and costs, without affecting the quality of the final product5. In addition, large scale production of recPV (in suspension cells and bioreactors) is now conceivable.

Here we describe a protocol based only on cell infection, which improves the efficiency of recombinant parvovirus production by more than 100 fold in comparison to other protocols in use. This protocol relies on the use of a novel adenovirus 5-based helper containing the parvovirus VP transcription unit (Ad-VP).

كفاءة الإنتاج البارفو المؤتلف مع مساعدة من اتش المستمدة من الأنظمة

Rodent parvoviruses (PV) such as rat H-1PV and MVM, are small icosahedral, single stranded, DNA viruses. Their genome includes two promoters P4 and P38 ...

Engineering and Evolution of Synthetic Adeno-Associated Virus (AAV) Gene Therapy Vectors via DNA Family Shuffling

Adeno-associated viral (AAV) vectors represent some of the most potent and promising vehicles for therapeutic human gene transfer due to a unique combination of beneficial properties1. These include the apathogenicity of the underlying wildtype viruses and the highly advanced methodologies for production of high-titer, high-purity and clinical-grade recombinant vectors2. A further particular advantage of the AAV system over other viruses is the availability of a wealth of naturally occurring serotypes which differ in essential properties yet can all be easily engineered as vectors using a common protocol1,2. Moreover, a number of groups including our own have recently devised strategies to use these natural viruses as templates for the creation of synthetic vectors which either combine the assets of multiple input serotypes, or which enhance the properties of a single isolate. The respective technologies to achieve these goals are either DNA family shuffling3, i.e. fragmentation of various AAV capsid genes followed by their re-assembly based on partial homologies (typically &gt;80% for most AAV serotypes), or peptide display4,5, i.e. insertion of usually seven amino acids into an exposed loop of the viral capsid where the peptide ideally mediates re-targeting to a desired cell type. For maximum success, both methods are applied in a high-throughput fashion whereby the protocols are up-scaled to yield libraries of around one million distinct capsid variants. Each clone is then comprised of a unique combination of numerous parental viruses (DNA shuffling approach) or contains a distinctive peptide within the same viral backbone (peptide display approach). The subsequent final step is iterative selection of such a library on target cells in order to enrich for individual capsids fulfilling most or ideally all requirements of the selection process. The latter preferably combines positive pressure, such as growth on a certain cell type of interest, with negative selection, for instance elimination of all capsids reacting with anti-AAV antibodies. This combination increases chances that synthetic capsids surviving the selection match the needs of the given application in a manner that would probably not have been found in any naturally occurring AAV isolate. Here, we focus on the DNA family shuffling method as the theoretically and experimentally more challenging of the two technologies. We describe and demonstrate all essential steps for the generation and selection of shuffled AAV libraries (Fig. 1), and then discuss the pitfalls and critical aspects of the protocols that one needs to be aware of in order to succeed with molecular AAV evolution.

Engineering and Evolution of Synthetic Adeno-Associated Virus AAV Gene Therapy Vectors via DNA Family Shuffling

We demonstrate the basic technique to molecularly engineer and evolve synthetic Adeno-associated viral (AAV) gene therapy vectors via DNA family shuffling. Moreover, we provide general guidelines and representative examples for selection and analysis of individual chimeric capsids with enhanced properties on target cells in culture or in mice.

الهندسة وتطور فيروس الغدة اسوشيتد الاصطناعية (AAV) المتجهات العلاج الجيني عن طريق الحمض النووي العائلة الخلط

Adeno-associated viral (AAV) vectors represent some of the most potent and promising vehicles for therapeutic human gene transfer due to a unique ...

Production and Purification of Non Replicative Canine Adenovirus Type 2 Derived Vectors

Adenovirus (Ad) derived vectors have been widely used for short or long-term gene transfer, both for gene therapy and vaccine applications. Because of the frequent pre-existing immunity against the classically used human adenovirus type 5, canine adenovirus type 2 (CAV2) has been proposed as an alternative vector for human gene transfer. The well-characterized biology of CAV2, together with its ease of genetic manipulation, offer major advantages, notably for gene transfer into the central nervous system, or for inducing a wide range of protective immune responses, from humoral to cellular immunity. Nowadays, CAV2 represents one of the most appealing nonhuman adenovirus for use as a vaccine vector. This protocol describes a simple method to construct, produce and titer recombinant CAV2 vectors. After cloning the expression cassette of the gene of interest into a shuttle plasmid, the recombinant genomic plasmid is obtained by homologous recombination in the E. coli BJ5183 bacterial strain. The resulting genomic plasmid is then transfected into canine kidney cells expressing the complementing CAV2-E1 genes (DK-E1). A viral amplification enables the production of a large viral stock, which is purified by ultracentrifugation through cesium chloride gradients and desalted by dialysis. The resulting viral suspension routinely has a titer of over 1010 infectious particles per ml and can be directly administrated in vivo.

These past 15 years, canine adenovirus type 2 (CAV2)-derived vectors have proven their efficiency to transduce cells in vitro&#160;and in vivo and are widely used for vaccination and gene therapy. Here, we describe a procedure to construct, produce and purify CAV2 vectors, giving rise to high-titer viral suspensions.

Adenovirus (Ad) derived vectors have been widely used for short or long-term gene transfer, both for gene therapy and vaccine applications. Because of the ...

Dissecting Innate Immune Signaling in Viral Evasion of Cytokine Production

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. Conversely, viruses have evolved intricate strategies to evade and exploit host immune signaling for survival and propagation. Viral immune evasion, entailing host defense and viral evasion, provides one of the most fascinating and dynamic interfaces to discern the host-virus interaction. These studies advance our understanding in innate immune regulation and pave our way to develop novel antiviral therapies.
Murine &#947;HV68 is a natural pathogen of murine rodents. &#947;HV68 infection of mice provides a tractable small animal model to examine the antiviral response to human KSHV and EBV of which perturbation of in vivo virus-host interactions is not applicable. Here we describe a protocol to determine the antiviral cytokine production. This protocol can be adapted to other viruses and signaling pathways.
Recently, we have discovered that &#947;HV68 hijacks MAVS and IKK&#946;, key innate immune signaling components downstream of the cytosolic RIG-I and MDA5, to abrogate NF&#922;B activation and antiviral cytokine production. Specifically, &#947;HV68 infection activates IKK&#946; and that activated IKK&#946; phosphorylates RelA to accelerate RelA degradation. As such, &#947;HV68 efficiently uncouples NF&#922;B activation from its upstream activated IKK&#946;, negating antiviral cytokine gene expression. This study elucidates an intricate strategy whereby the upstream innate immune activation is intercepted by a viral pathogen to nullify the immediate downstream transcriptional activation and evade antiviral cytokine production.

We describe a protocol to measure the antiviral cytokine production in mice infected with a model herpesvirus, murine gamma herpesvirus 68 (&#947;HV68) that is closely-related to human Kaposi&#8217;s sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) and Epstein-Barr virus (EBV). Utilizing genetically modified mouse strains and mouse embryonic fibroblasts (MEFs), we assessed the antiviral cytokine production both in vivo and ex vivo. &#8220;Reconstituting&#8221; the expression of innate immune components in knockout embryonic fibroblasts by lentiviral transduction, we further pinpoint specific innate immune molecules and dissect the key signaling events that differentially regulate the antiviral cytokine production.

تشريح الفطري اشارة المناعة في التهرب الفيروسية من الإنتاج خلوى

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. burnetii DNA in cell cultures and clinical samples. PCR requires specialized equipment and extensive end user training, and therefore, it is not suitable for routine work especially in a resource-constrained area. We have developed a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay to detect the presence of C. burnetii in patient samples. This method is performed at a single temperature around 60 &#176;C in a water bath or heating block. The sensitivity of this LAMP assay is very similar to PCR with a detection limit of about 25 copies per reaction. This report describes the preparation of the reaction using lyophilized reagents and visualization of results using hydroxynaphthol blue (HNB) or a UV lamp with fluorescent intercalating dye in the reaction. The LAMP reagents were lyophilized and stored at room temperature (RT) for one month without loss of detection sensitivity. This LAMP assay is particularly robust because the reaction mixture preparation does not involve complex steps. This method is ideal for use in resource-limited settings where Q fever is endemic.

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

We described here a simple loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method using lyophilized reagents for the detection of C. burnetii in patient samples.

تطوير بوساطة حلقة-المجففة بالتبريد متساوي التضخيم الكواشف للكشف عن<em&gt; الكوكسيلا البورنيتية</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional methods to measure NA inhibiting (NI) antibody titers are not practical for routine serology. This protocol describes the enzyme-linked lectin assay (ELLA), a practical alternative method to measure NI titers that is performed in 96 well plates coated with a large glycoprotein substrate, fetuin. NA cleaves terminal sialic acids from fetuin, exposing the penultimate sugar, galactose. Peanut agglutinin (PNA) is a lectin with specificity for galactose and therefore the extent of desialylation can be quantified using a PNA-horseradish peroxidase conjugate, followed by addition of a chromogenic peroxidase substrate. The optical density that is measured is proportional to NA activity. To measure NI antibody titers, serial dilutions of sera are incubated at 37 &#176;C O/N on fetuin-coated plates with a fixed amount of NA. The reciprocal of the highest serum dilution that results in &#8805;50% inhibition of NA activity is designated as the NI antibody titer. The ELLA provides a practical format for routine evaluation of human antibody responses following influenza infection or vaccination.

We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.

قياس الأنفلونزا النورامينيداز تثبيط الجسم المضاد التتر من قبل انزيم مرتبط كتين الفحص

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the person-to-person route or indirectly through environmental surfaces or food, contaminated fomites and inanimate surfaces are important vehicles for the spread of the virus during norovirus outbreaks.
We developed and evaluated a protocol using macrofoam swabs for the detection and typing of human noroviruses from hard surfaces. Compared with fiber-tipped swabs or antistatic wipes, macrofoam swabs allow virus recovery (range 1.2-33.6%) from toilet seat surfaces of up to 700 cm2. The protocol includes steps for the extraction of the virus from the swabs and further concentration of the viral RNA using spin columns. In total, 127 (58.5%) of 217 swab samples that had been collected from surfaces in cruise ships and long-term care facilities where norovirus gastroenteritis had been reported tested positive for GII norovirus by RT-qPCR. Of these 29 (22.8%) could be successfully genotyped. In conclusion, detection of norovirus on environmental surfaces using the protocol we developed may assist in determining the level of environmental contamination during outbreaks as well as detection of virus when clinical samples are not available; it may also facilitate monitoring of effectiveness of remediation strategies.

A macrofoam based sampling methodology was developed and evaluated for the detection and quantification of norovirus on environmental hard surfaces.

مسحة طريقة أخذ العينات للكشف عن نوروفيروس الإنسان على السطوح

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...