Name: production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors
Uploaded: 2011-11-27T14:00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors at JoVE.com

انظر الشكل 1 للمزيد من التوضيح يلخص بروتوكول التالية. ملاحظة السلامة : جميع المواد التي تم في اتصال مع الجسيمات الفيروسية تجميعها يجب تطهيرها بمحلول مطهر Virkon أو مناسبة أخرى. 1. إعداد مخزونات DNA البلازميد (~ 2 أيام) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مطلوبة البلازميدات التالية : 1 <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> pRV1 -- تحتوي على معدل رسملة AAV2 ومتواليات </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> pH21 -- تحتوي على معدل رسملة AAV1 ومتواليات </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> pFdelta6 -- اتش مساعد في البلازميد </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> AAV البلازميد التي تحتوي على شريط كاسيت التعبير المؤتلف يحيط بها إشارات AAV2 التعبئة والتغليف (يكرر محطة المقلوب ، نظام الإسناد الأرضي) </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حين ينبغي أن تزرع في pFdelta6 Stbl2 الخلايا المختصة لمنع حذف جزئية ، يمكن أن تنمو وpRV1 pH21 DH5alpha في الخلايا المختصة. يمكن زراعتها في البلازميدات AAV Stbl2 الخلايا إذا الحذف جزئية تحدث في الخلايا DH5alpha. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">وينبغي أن الحمض النووي بلازميد تكون ذات جودة عالية وخالية من الملوثات الحمض النووي الريبي. ويمكن فحص البلازميدات لسلامة استخدام هضم التالية : <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> pRV1 -- هضم XbaI مع اعطاء عصابات من 7.5 كيلو بايت و 3.8 كيلوبايت </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> pH21 -- هضم EcoRI مع اعطاء عصابات 4.5 كيلوبايت ، 2.8 كيلو بايت و 0.2 كيلوبايت </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> pFdelta6 -- هضم HindIII مع اعطاء عصابات 5.5 كيلوبايت ، 3 كيلو و 3 كيلو بايت ، كيلوبايت 2.3 و 1.5 كيلوبايت </li></ul></li></ol> 2. إعداد الإنسان خلايا الكلى 293 (Hek293) الجنينية لترنسفكأيشن (2 -- 3 أيام) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة two 80 ٪ متموجة 150 سم 2 من القوارير Hek293 الخلايا إلى خمسة أطباق بقطر 15 سم نونك زراعة الأنسجة. وينبغي أن تكون خلايا 70-80 ٪ متموجة قبل ترنسفكأيشن (حوالي 48 ساعة بعد الطلاء). الثقافة في خلايا النسر Dulbecco القياسية لتعديل المتوسطة (DMEM) مع انخفاض الجلوكوز تحتوي على 10 ٪ الجنين مصل العجل ويو 100 / البنسلين مل / 100 الستربتوميسين ميكروغرام / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل 3 ساعات ترنسفكأيشن إزالة DMEM واستبدالها مع Iscove&#39;ق تعديل Dulbecco المتوسطة في (IMDM) التي تحتوي على 5 ٪ الجنين العجل المصل. </li></ol> 3. ترنسفكأيشن من البلازميدات الفيروسي (~ 1 ساعة لترنسفكأيشن و 3 أيام للحضانة) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد ما يلي لدفعة واحدة (5 × الطول الأنسجة لوحات الثقافة 15) من الفيروس : <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 62.5 ميكروغرام AAV البلازميد </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 125 ميكروغرام pFdelta6 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 31.25 ميكروغرام pRV1 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 31.25 ميكروغرام pH21 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1650 م 2.5 ميكروليتر CaCl 2 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 12 مل درهم 2 O </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في تصفية الطبقة الأنسجة 2 غطاء الثقافة العقيمة ترنسفكأيشن الخليط في أنبوب 50 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بينما vortexing الحل ، بسرعة إضافة 13 مل من HEPES × 2 مخزنة المالحة (7.05 درجة الحموضة). استبدال غطاء أنبوب 50 مل والاستمرار في دوامة لمدة 15 ثانية. ترك الوقوف لمدة 1 دقيقة 45 ثانية ، وينبغي أن يعجل غرامة أبيض النموذج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة بلطف 5 مل من محلول ترنسفكأيشن إلى كل طبق 15 سم زراعة الأنسجة. لوحات دوامة لخلط والعودة إلى الحاضنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 16 ساعة بعد إزالة ترنسفكأيشن IMDM المتوسطة واستبدالها مع DMEM. </li></ol> 4. Lysing من الخلايا وحصاد rAAVs (2 ساعة) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 72 ساعة ترنسفكأيشن ، وإزالة وسائل الاعلام من لوحات ونبذ ثقافة الخلية. وينبغي معاملة جميع النفايات بمحلول مطهر Virkon أو مناسبة أخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل بلطف الخلايا في الفوسفات مخزنة المالحة الدافئة 1X (PBS ، درجة الحموضة 7.4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 25 مل PBS الحار كل لوحة وإزالة الخلايا برفق مع مكشطة الخلية. جمع نظام التعليق في 50 مل من الأنابيب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا بيليه في 800 x ج لمدة 10 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل وطاف بيليه resuspend في 150 مم كلوريد الصوديوم ، و 20 ملي تريس درجة الحموضة 8.0 ، استخدام 10 مل لكل لوحة زراعة الأنسجة. انقسام في أنابيب 50 two مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اعداد جديدة من حل deoxycholate الصوديوم 10 ٪ في DH 2 O. إضافة 1.25 مل من هذا إلى كل أنبوب لتركيز النهائي من 0.5 ٪. إضافة benzonase nuclease إلى تركيز النهائي من 50 وحدة لكل مل. مزيج أنبوب دقيق. </li><lط&gt; احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الحطام الخلوية بواسطة الطرد المركزي في 3000 x ج لمدة 15 دقيقة. نقل إلى أنبوب جديد 50 مل ، وضمان تمت إزالة جميع الأنقاض الخلية لمنع تجميد الأعمدة الهيبارين (راجع الخطوة 5). في هذه المرحلة ، يمكن تخزين العينات في -20 درجة مئوية قبل متابعة العمل. لقد كنا تخزين العينات لعدة أسابيع في -20 درجة مئوية دون أي تخفيض في نقل العدوى. </li></ol> 5. الهيبارين تنقية عمود rAAVs (2 -- 3 ساعات) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أعمدة الإعداد الهيبارين HiTrap باستخدام مضخة تمعجية بحيث تتدفق من خلال حلول العمود في 1 مل في الدقيقة للخطوات 5،2-5،4. فمن المهم لضمان تقديم أي فقاعات الهواء في العمود الهيبارين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يوازن العمود مع 10 مل كلوريد الصوديوم 150 ملم ، 20 ملم تريس ، ودرجة الحموضة 8.0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق حل 50 مل الفيروس إلى العمود والسماح لتدفق من خلال. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل العمود مع 20 مل من كلوريد الصوديوم 100 ملم ، 20 ملم تريس ، ودرجة الحموضة 8.0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام حقنة 5 مل تستمر لغسل ث العمودإيث 1 مل كلوريد الصوديوم 200 ملي ، 20 ملي تريس ، ودرجة الحموضة 8.0 ، تليها 1 مل كلوريد الصوديوم 300 ملم ، 20 ملم تريس ، ودرجة الحموضة 8.0. تجاهل التدفق من خلال. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5 مل باستخدام الحقن ورقيقة أزل الضغط على الفيروس من خلال تطبيق العمود : <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1.5 مل كلوريد الصوديوم 400 ملم ، 20 ملم تريس ، ودرجة الحموضة 8.0 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 3.0 مل 450 مم كلوريد الصوديوم ، و 20 ملي تريس ، ودرجة الحموضة 8.0 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1.5 مل كلوريد الصوديوم 500 ملم ، 20 ملم تريس ، ودرجة الحموضة 8.0 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع هذه الطرد المركزي في أنبوب 15 مل. </li></ul></li></ol> 6. تركيز والترشيح العقيمة rAAVs (1 ساعة) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تركيز النواقل باستخدام Amicon فائقة 4 وحدات الطرد المركزي تصفية مع قطع 100،000 الوزن الجزيئي. تحميل 4 مل من شطافة في العمود المكثف والطرد المركزي في 2000 x ج لمدة 2 دقيقة (في درجة حرارة الغرفة). تجاهل flowthrough والمكثف مع الحل تحديث الفيروس المتبقية وكرر الطرد المركزي. وينبغي أن يتركز على حجم ما يقرب من 250 ميكرولتر. إذا كان حجم تتركز أكثر بكثير من ذلك ، تجاهل ر تدفقhrough وتواصل أجهزة الطرد المركزي في أحد الخطوات حتى اللحظة حجم ما يقرب من 250 ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 250 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لفيروس عن الحجم النهائي من 500 ميكروليتر وإزالته من مكثف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصفية ناقلات خلال 13 ملم قطرها 0.2 ميكرون تصفية المحاقن. وينبغي aliquoted ناقلات وتخزينها على -80 درجة مئوية حتى المطلوبة. </li></ol> 7. Titering المخزونات الفيروسية (3 أيام) هذا يتطلب أن مروج نشط في الخلايا Hek293 يقود مراسل الجين أو الجينات منتج للكشف immunocytochemically. عندما المنتجة للناقل غير متوافق مع Hek293 الخلايا يمكن أن تستخدم خطوط الخلايا الأخرى أو ثقافات الخلية الأولية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 18 - L - بولي يسين coverslips الزجاج المطلي أو 18 بئرا من الشرائح غرفة نونك التي بذر Hek293 الخلايا بحيث أنها ما بين 40 -- 50 ٪ متموجة. لمعايرة من لجنة المساواة العرقية التي تعتمد على استخدام rAAVs Hek293 الخلايا التي ستابلي عن لجنة المساواة العرقية recombinase 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصيب كل بئر مع د التسلسليilutions من ناقلات AAV (الشكل 2A). استخدام 3 آبار في التخفيف. نضيف بشكل روتيني الفيروس مباشرة إلى كل بئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 72 ساعة الإصلاح Hek293 الخلايا من خلال إضافة حجم مساو من بارافورمالدهيد 4 ٪ (PFA) والمتوسطة (إعطاء تركيز النهائي من PFA 2 ٪) لمدة عشر دقائق في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلية ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني ، في شطف درهم 2 O وساترة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب عدد الخلايا transduced من الآبار الثلاث التي لديها أعلى عامل التخفيف ، ولكن لا تزال تحتوي على الخلايا المصابة ، والعثور على المتوسط ​​وتتضاعف هذه العوامل التي تعطي لتخفيف عدد الوحدات المعدية لكل ميكروليتر (الشكل 2B). </li></ol> 8. النتائج المتوقعة transduced Hek293 الخلايا مع ترميز الفيروس تظهر خضراء معززة بروتين فلوري (eGFP) في الشكل 2B. نحقق عموما التتر ثابت من حوالي 6 × 6 10 جزيئات معدية للتر الواحد الجزئي. نحن نستخدم بشكل روتيني هذه نواقل inje التجسيميction في الدماغ القوارض الكبار. وهذا يوفر تقنية قوية لمنطقة محددة التعبير الجيني 2. الجمع بين هذه الخلية مع خصوصية المنطقة من نوع التعبير الجيني انتقائية نحن حقن recombinase لجنة المساواة العرقية التي تعتمد على rAAVs في المناطق المستهدفة من لجنة المساواة العرقية ، الفئران المعدلة وراثيا 2. الشكل 2C - E يظهر أمثلة من الحقن التجسيمي من لجنة المساواة العرقية التي تعتمد على الترميز rAAVs eGFP في مناطق مختلفة من الدماغ الفئران المعدلة وراثيا لا أخلاقي parvalbumin - 3 لجنة المساواة العرقية. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/3348/3348fig1.jpg" /> الشكل 1. توضيح تخطيطي لبروتوكول لانتاج rAAV. 1 هي مطلي) Hek293 الخلايا وتنمو ل70-80 التقاء ٪. 2) ومستعدون AAV المساعد البلازميدات وtransfected Hek293 في الخلايا. 3) يتم تغيير متوسطة مرة أخرى إلى 16 ساعة بعد DMEM ترنسفكأيشن ومثقف Hek293 الخلايا لمدة 56 ساعة. 4. تحصد) Hek293 الخلايا وlysed. يتم فصل ناقلات rAAV من حطام خلية جentrifugation. 5) يتم تنقية الجزيئات الفيروسية من خلال أعمدة الهيبارين قبل الاعتقال والتعقيم. 6) تزرع Hek293 الخلايا على 24 لوحات جيدة وتصيب مع التخفيفات التسلسلي للناقلات AAV لتحديد عدد الوحدات المعدية. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/3348/3348fig2.jpg" /> الشكل 2. Titering والتطبيق في الجسم الحي / 2 rAAV1. (أ) من إعداد Hek293 الخلايا لقياس عيار الفيروسية. وtransduced Hek293 الخلايا مع التخفيفات المتسلسلة لrAAVs. C ، والسيطرة المعافين ؛ N ، 1 ميكرولتر من الأسهم فيروسية غير مخفف. (ب) Hek293 الخلايا المصابة مع rAAVs معربا عن eGFP. غير المقيد (م) التعبير eGFP الفيروسية لجنة المساواة العرقية ، معربا عن الخلايا العصبية في المناطق المستهدفة مختلفة من الفئران المعدلة وراثيا ، لجنة المساواة العرقية parvalbumin بعد الحقن التجسيمي من لجنة المساواة العرقية التي تنشط rAAVs. تظهر الصور أمثلة تفاعلية مناعية في GFP الشاحبة المهاد شبكي وكرة (C) ، (D) في التلفيف المسنن و (E) في المنطقة CA1 من الحصين. ج ، ديntate التلفيف ؛ RT ، نواة مهادي شبكي ؛ GP ، الكرة الشاحبة. أشرطة النطاق : B ، 500 ميكرون ، C ، 100 ميكرون ، D ، 100 ميكرون ، E ، و 500 ميكرون.

<ol>
	<li>Klugmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV-mediated+hippocampal+expression+of+short+and+long+Homer+1+proteins+differentially+affect+cognition+and+seizure+activity+in+adult+rats.">AAV-mediated hippocampal expression of short and long Homer 1 proteins differentially affect cognition and seizure activity in adult rats.</a> Molecular and Cellular Neurosciences. 28, 347-360 (2005).</li><li>Murray, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parvalbumin-positive+CA1+interneurons+are+required+for+spatial+working+but+not+for+reference+memory.">Parvalbumin-positive CA1 interneurons are required for spatial working but not for reference memory.</a> Nature Neuroscience. 14, 297-299 (2011).</li><li>Hippenmeyer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+developmental+switch+in+the+response+of+DRG+neurons+to+ETS+transcription+factor+signaling.">A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling.</a> PLoS Biology. 3, e159-e159 (2005).</li><li>Hauck, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+characterization+of+chimeric+recombinant+AAV+vectors.">Generation and characterization of chimeric recombinant AAV vectors.</a> Molecular Therapy. 7, 419-425 (2003).</li><li>Halbert, C. L., Allen, J. M., Miller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+type+6+(AAV6)+vectors+mediate+efficient+transduction+of+airway+epithelial+cells+in+mouse+lungs+compared+to+that+of+AAV2+vectors.">Adeno-associated virus type 6 (AAV6) vectors mediate efficient transduction of airway epithelial cells in mouse lungs compared to that of AAV2 vectors.</a> Journal of Virology. 75, 6615-6615 (2001).</li><li>Blankinship, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transduction+of+skeletal+muscle+using+vectors+based+on+adeno-associated+virus+serotype+6.">Efficient transduction of skeletal muscle using vectors based on adeno-associated virus serotype 6.</a> Molecular Therapy. 10, 671-678 (2004).</li><li>Wu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+amino+acid+changes+can+influence+titer,+heparin+binding,+and+tissue+tropism+in+different+adeno-associated+virus+serotypes.">Single amino acid changes can influence titer, heparin binding, and tissue tropism in different adeno-associated virus serotypes.</a> Journal of Virology. 80, 11393-11397 (2006).</li><li>Dong, J. Y., Fan, P. D., Frizzell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+the+packaging+capacity+of+recombinant+adeno-associated+virus.">Quantitative analysis of the packaging capacity of recombinant adeno-associated virus.</a> Human gene therapy. 7, 2101-2112 (1996).</li><li>Zolotukhin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+purification+of+serotype+1,+2,+and+5+recombinant+adeno-associated+viral+vectors.">Production and purification of serotype 1, 2, and 5 recombinant adeno-associated viral vectors.</a> Methods. 1, 158-167 (2002).</li><li>Burova, E., Loffe, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatographic+purification+of+recombinant+adenoviral+and+adeno-associated+viral+vectors:+methods+and+implications.">Chromatographic purification of recombinant adenoviral and adeno-associated viral vectors: methods and implications.</a> Gene Therapy. 12, 5-17 (2005).</li><li>Zolotukhin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+adeno-associated+virus+purification+using+novel+methods+improves+infectious+titer+and+yield.">Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield.</a> Gene Therapy. 6, 973-985 (1999).</li><li>Bilbao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+gene+expression+from+in+utero+delivery+of+adenoviral-associated+vector+serotype+1.">Patterns of gene expression from in utero delivery of adenoviral-associated vector serotype 1.</a> Human Gene Therapy. 16, 678-684 (2005).</li><li>Pilpel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=reproducible+transduction+of+select+forebrain+regions+by+targeted+recombinant+virus+injection+into+the+neonatal+mouse+brain.">reproducible transduction of select forebrain regions by targeted recombinant virus injection into the neonatal mouse brain.</a> Journal of Neuroscience Methods. 182, 55-63 (2009).</li><li>Mastakov, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+injection+of+rAAV+with+mannitol+enhances+gene+expression+in+the+rat+brain.">Combined injection of rAAV with mannitol enhances gene expression in the rat brain.</a> Molecular Therapy. 3, 225-232 (2001).</li><li>Fu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-complementary+adeno-associated+virus+serotype+2+vector:+global+distribution+and+broad+dispersion+of+AAV-mediated+transgene+expression+in+mouse+brain.">Self-complementary adeno-associated virus serotype 2 vector: global distribution and broad dispersion of AAV-mediated transgene expression in mouse brain.</a> Molecular Therapy. 8, 911-917 (2003).</li><li>Ghosh, A., Yue, Y., Duan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Transgene+Reconstitution+with+Hybrid+Dual+AAV+Vectors+Carrying+the+Minimized+Bridging+Sequences.">Efficient Transgene Reconstitution with Hybrid Dual AAV Vectors Carrying the Minimized Bridging Sequences.</a> Human Gene Therapy. 22, 77-83 (2011).</li><li>McCarty, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-complementary+AAV+vectors;+advances+and+applications.">Self-complementary AAV vectors; advances and applications.</a> Molecular Therapy. 16, 1648-1656 (2008).</li><li>Georgiadis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV-mediated+knockdown+of+peripherin-2+in+vivo+using+miRNA-based+hairpins.">AAV-mediated knockdown of peripherin-2 in vivo using miRNA-based hairpins.</a> Gene Therapy. 17, 486-493 (2010).</li><li>Atasoy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FLEX+switch+targets+Channelrhodopsin-2+to+multiple+cell+types+for+imaging+and+long-range+circuit+mapping.">A FLEX switch targets Channelrhodopsin-2 to multiple cell types for imaging and long-range circuit mapping.</a> The Journal of Neuroscience. 28, 7025-7030 (2008).</li><li>Guggenhuber, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV+Vector-Mediated+Overexpression+of+CB1+Cannabinoid+Receptor+in+Pyramidal+Neurons+of+the+Hippocampus+Protects+against+Seizure-Induced+Excitoxicity.">AAV Vector-Mediated Overexpression of CB1 Cannabinoid Receptor in Pyramidal Neurons of the Hippocampus Protects against Seizure-Induced Excitoxicity.</a> PLoS One. 5, e15707-e15707 (2010).</li><li>Lawlor, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+delivery+and+selective+transduction+of+glial+cells+in+the+mammalian+brain+by+AAV+serotypes+isolated+from+nonhuman+primates.">Efficient gene delivery and selective transduction of glial cells in the mammalian brain by AAV serotypes isolated from nonhuman primates.</a> Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 17, 1692-1702 (2009).</li><li>Chtarto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetracycline-inducible+transgene+expression+mediated+by+a+single+AAV+vector.">Tetracycline-inducible transgene expression mediated by a single AAV vector.</a> Gene Therapy. 10, 84-94 (2003).</li><li>Han, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+humoral+immune+response+to+the+tetracycline+(Tet)+activator+in+rats+injected+intracranially+with+Tet-off+rAAV+vectors.">Lack of humoral immune response to the tetracycline (Tet) activator in rats injected intracranially with Tet-off rAAV vectors.</a> Gene Therapy. 17, 616-625 (2010).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

ناقلات rAAV أصبحت ذات قيمة متزايدة لفي الدراسات المجراة على الحيوانات. هنا ، وقد وصفت لدينا بروتوكول بسيطة وغير مكلفة لrAAVs المنتجة ، والتي قد تسهل تطبيق على نطاق واسع من هذه النواقل مفيدة عن طريق تجنب الاستعانة بمصادر خارجية مكلفة لإنتاج فيروس للشركات. البروتوكول (على أساس مرجعية 1) يصف إنتاج النواقل rAAV1 / 2 التي تحتوي على البروتينات قفيصة خيالية من كلا الوالدين المصليين في نسب متساوية 4. تنقية ناقلات rAAV ملزمة لأعمدة الهيبارين يعتمد على التعبير عن AAV2 البروتينات قفيصة ، ولكن يمكن دمجها مع غيرها من الأنماط المصلية من AAV1 الواردة هنا. بالإضافة إلى ذلك ، تم الإبلاغ عن AAV6 ربط الهيبارين ، على الرغم من تقارب مع انخفاض ، ويحتمل أن يطهر الهيبارين مع الأعمدة باستخدام هذا الإجراء 5،6. وتجدر الإشارة إلى أنه مع ذلك ، أن الأنماط المصلية الأخرى سوف تتطلب تركيزات مختلفة من كلوريد الصوديوم لشطف العمود 5،7 الهيبارين. وقد تبين التغليف الجينوم rAAV أن أمثل بين 4.1 و 4.9 كيلو بايت مع انخفاض حاد في كفاءة التعبئة تصل إلى 5.2 كيلو بايت 8. ويمكن اعتبار هذا الحد التغليف أكبر عيوب النظام rAAV ، وعادة ما يتحقق منذ الخلية نوع معين من التنظيم من قبل رابطة الدول المستقلة التعبير التحوير كبيرة تعمل العناصر التي لا يمكن استيعابها داخل جزيئات AAV الصغيرة. للتغلب على دفعات عيار منخفضة ، مثل تلك الناجمة عن محاولة مجموعة الجينات التي هي قريبة إلى حد التعبئة AAV نحن الجمع بين دفعات منفصلة تتركز الفيروسية إلى 250 ميكروليتر في الدفعة 500 one ميكرولتر ، بدلا من إضافة برنامج تلفزيوني على النحو المبين في الخطوة 6.3. ويمكن تحقيق موثوق الخلية من نوع محدد من الفئران تنبيغ لجنة المساواة العرقية الجمع بين السائق وأشرطة rAAV الشرطي (انظر أدناه) لتجنب تمتد حدود التعبئة والتغليف. من الملاحظة ، في حين أن هذا البروتوكول محاولات لتوفير سهلة المتابعة تعليمات لإنتاج طن عاليةمعبر rAAV ، فإنه يتطلب وجود البروتين قفيصة AAV2 شاردات لتنقية اللوني التي تقارب الهيبارين. يجب تنقيتها من الأنماط المصلية الأخرى AAV2 باستخدام إجراءات بديلة 9. ميزة واحدة من العمود تنقية الهيبارين يعتقد أن انتاج ناقلات AAV التي أكبر معدل العدوى من تلك المنتجة باستخدام التدرج كلوريد السيزيوم 10. ومع ذلك ، هناك أيضا بعض العيوب لهذا الأسلوب. على سبيل المثال ، قد البروتينات الأخرى التي تربط الهيبارين أيضا أن تكون موجودة في المخزون الفيروسية المنقى. في حين يمكن أن تؤثر على النواقل tropism - الهيبارين تنقيته من عيار 10 ناقلات ، نهجنا خصيصا لاستهداف إما 20 أو استثارية الخلايا العصبية المثبطة (الشكل 2) توظف لجنة المساواة العرقية التي يسببها تفعيل التعبير التحوير AAV بوساطة وعيار مستقلة. بديل لتنقية العمود الهيبارين هو استخدام لكثافة iodixanol التدرج ، والتي تنتج أعلى عيار الفيروسية وإعداد أنقى من استخدامكلوريد السيزيوم الانحدار 10. ويمكن أيضا أن تكون هذه الطريقة جنبا إلى جنب مع عمود تنقية الهيبارين لانتاج ناقلات أكبر من 99 ٪ نقية 11. لذلك ، النظر بعناية الاحتياجات التي يتعين اتخاذها من قبل الجماعات الفردية على النحو الذي الفيروسية الأسلوب هو الأفضل لتنقية تطبيقها المصب معينة. المشكلة الأكثر شيوعا المرتبطة بهذا البروتوكول هو عيار الفيروسية منخفضة. ويمكن في تجربتنا هذه عادة أن تعزى إلى انخفاض كفاءة ترنسفكأيشن ، أو شطف من الفيروس من الأعمدة الهيبارين. وينبغي أن تكون جميع المواد ترنسفكأيشن في درجة حرارة الغرفة قبل ترنسفكأيشن ، ويجب أن يتم تنفيذ transfections اختبار للعثور على أفضل الظروف في كل مختبر. طرق أخرى لنقل العدوى ، مثل lipofectamine ، وكفاءة عالية ، ولكن يمكن أن تكون باهظة التكلفة. بالإضافة إلى ذلك ، التركيز ودرجة الحموضة من الحلول العمود شطف الهيبارين هو أمر حاسم لشطف كاملة virions من الأعمدة witho الهيبارينالتحرير الضرر. نقطة أخرى مهمة هي أن الخلايا التعبئة والتغليف يجب أن تلتزم أيضا إلى السطح من الأطباق زراعة الأنسجة. إذا كانت الخلايا فصل في مرحلة ما أثناء إجراء ينصح لإنهاء التجربة وتذويب قارورة جديدة من الخلايا. ويتحقق بسهولة السيطرة المكانية والزمانية التعبير التحوير في القوارض من خلال استهداف تشريحية دقيقة والمرحلة التنموية للحيوان. وقد أظهرت كفاءة نقل الجينات AAV بوساطة 12،13 في الرحم. الكبار في الدماغ ، يمكن تعديلها المنطقة المصابة مع جزيئات rAAV بعد حقن صغيرة جدا من التجسيمي المناطق المستهدفة ، إلى مناطق أكبر من ذلك بكثير ، ليس فقط بسبب التغيرات في عيار الفيروسية ولكن أيضا عن طريق تغيير معالم الحقن. وتشمل هذه حجم وسرعة الحقن وإدراج مانيتول البوليول مع تعليق الفيروس 14. ويمكن أيضا أن تستخدم لمانيتول تعزيز العدوى من مجموعة متنوعة من الأنسجة بعد الحقن rAAV النظامية 15 &lt;/ سوب&gt;. قدرة التعبئة والتغليف من rAAV (حوالي 4.7 كيلوبايت) وربما كان أهم عامل يحد من حيث الجينات التي يمكن التعبير عن هذه النواقل الفيروسية. ومع ذلك ، فقد أظهرت الدراسات الحديثة أنه يمكن التغلب على هذه الجينات جزئيا تقسيم أكبر أو أشرطة التعبير إلى نواقل rAAV منفصلة وإدخال تسلسل سد ، وبدء التعبير الجيني عندما تصيب virions نفس الخلية 16. ويمكن أيضا مستويات التعبير عن الجينات التي تحملها ناقلات rAAV ستتعزز إلى حد كبير باستخدام الذاتي مجانية ناقلات rAAV 17. حقن التجسيمي ناقلات rAAV يوفر السريع ، وطريقة رخيصة وقوية لحمل الجينات في المنطقة بطريقة محددة. ويمكن في تركيبة مع 2 استراتيجيات الجيل الثاني تدخل الحمض النووي الريبي أيضا 18 rAAVs تستعمل لمنطقة محددة الجينات نهدم. ويمكن الجمع بين لجنة المساواة العرقية ، rAAVs مع الفئران المعدلة وراثيا أو خلية من نوع المروجين محددة لتحقيق الدوائر ونوع الخليةمحددة التعبير الجيني ، مما يتيح التلاعب الجيني لقرار مكانية عالية 2،19-21 ، بينما rAAVs مع تركيب نظام مثل تيت ويضيف السيطرة الزمنية على الفيروس بوساطة 22،23 التعبير الجيني ، وهذه الأمثلة توضح إمكانات هائلة اندماجي من هذه النواقل و ويتوقع حدوث زيادة سريعة في rAAV الدراسات المستندة على مدى السنوات القادمة.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم الكاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> مرشحات Amicon الطرد المركزي الترا </td><td> ميليبور </td><td> UFC810024 </td><td> 100000 MWCO </td></tr><tr><td> Benzonase nuclease </td><td> سيغما الدريخ </td><td> E1014 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbeco لتعديل النسر المتوسط ​​(DMEM) </td><td> Invitrogen </td><td> 10567014 </td><td> الملحق مع FCS 10 ٪ والوحدات 10 / مل penicillin/100 الستربتوميسين ميكروغرام / مل </td></tr><tr><td> Hek293 الخلايا </td><td> جمع نوع الثقافة الأميركية </td><td> CRL - 1573 </td><td> استخدامها في مرور أقل من 30 </td></tr><tr><td> HEPES مخزنة المالحة </td><td> سيغما الدريخ </td><td> 51558 </td><td></td></tr><tr><td> HiTrap الهيبارين خرطوشة </td><td> سيغماالدريخ </td><td> 54836 </td><td></td></tr><tr><td> Iscove لتعديل Dulbecco والمتوسطة </td><td> Invitrogen </td><td> 12440-053 </td><td> الملحق مع FCS 5 ٪ </td></tr><tr><td> الصوديوم deoxycholate </td><td> سيغما الدريخ </td><td> D5670 </td><td> حل جديد لجعل كل دفعة </td></tr><tr><td> أطباق 15 سم زراعة الأنسجة </td><td> فيشر العلمية </td><td> 157150 </td><td></td></tr><tr><td> Stbl2 الخلايا المختصة </td><td> Invitrogen </td><td> 10268-019 </td><td></td></tr><tr><td> Virkon الحل </td><td> فيشر العلمية </td><td> NC9821357 </td><td> ترك بين عشية وضحاها لتطهير قبل رميه لاستنزاف </td></tr></tbody></table> الجدول 1. الكواشف المحددة اللازمة لبروتوكول

production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors

في السنوات الأخيرة الغدة المؤتلف المرتبطة النواقل الفيروسية (AAV) أصبحت ذات قيمة متزايدة لفي الدراسات المجراة على الحيوانات ، وهنا أيضا يجري اختباره حاليا في تجارب اكلينيكية على البشر. من النوع البري AAV عضو غير ممرضة للأسرة وparvoviridae بطبيعتها النسخ التي تعاني من نقص. جعلت ملف تنبيغ واسع ، استجابة مناعية منخفضة وكذلك التعبير التحوير قوية ومستمرة مع هذه الناقلة حققت لهم أداة شعبية وتنوعا لفي المختبر والمجراة في توصيل الجينات. rAAVs يمكن بسهولة وبثمن بخس المنتجة في المختبرات ، واستنادا الى البيانات الشخصية للسلامتهم مواتية ، وتعطى عادة لتصنيف السلامة منخفضة. هنا ، نحن تصف طريقة لانتاج وtitering من rAAVs خيالية تحتوي على البروتينات قفيصة كلا AAV1 وAAV2. استخدام هذه الناقلات ما يسمى خيالية يجمع بين فوائد كل من الأنماط المصلية الأبوية مثل الأسهم عيارات عالية (AAV1) وتنقيةالتي تقارب اللوني (AAV2). هذه الأنماط المصلية AAV هي أفضل درس لجميع الأنماط المصلية AAV ، ويكون فرديا نمط العدوى واسعة. ينبغي للناقلات خيالية وصفها هنا لديهم خصائص المعدية وAAV1 AAV2 وبالتالي يمكن توقع أن تصيب مجموعة كبيرة من الأنسجة ، بما في ذلك الخلايا العصبية ، الهيكل العظمي والعضلات والبنكرياس والكلى وغيرها. يعتقد أن الأسلوب أسلوب الموصوفة هنا يستخدم الهيبارين تنقية العمود ، لإعطاء أعلى عيار الفيروسية وإعداد أنظف من وسائل تنقية الفيروسية الأخرى ، مثل الطرد المركزي من خلال التدرج كلوريد السيزيوم. بالإضافة إلى ذلك ، وصف لنا كيف يمكن أن تكون هذه الناقلة بسرعة وسهولة titered لإعطاء قراءة دقيقة لعدد من الجزيئات المعدية المنتجة.

Watch this Scientific Journal Video about Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors at JoVE.com

Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors

الغدة المؤتلف المرتبطة بفيروس (rAAVs) ناقلات أصبحت ذات قيمة متزايدة لل<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; دراسات في الحيوانات. نحن تصف كيف يمكن أن تنتج rAAVs في المختبر ، وكيف يمكن titered هذه النواقل لإعطاء قراءة دقيقة لعدد من الجزيئات المعدية المنتجة.

إنتاج وناقلات Titering الغدة المؤتلف المرتبطة الفيروسية

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Recombinant Retroviral Production and Infection of B Cells

المؤتلف إنتاج فيروسات الرجعية والعدوى من خلايا B

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control ...

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

بمعزل عن المتغيرات الاخلاص للفيروسات الحمض النووي الريبي وتوصيف التردد يتحور الفيروس

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

Efficient Recombinant Parvovirus Production with the Help of Adenovirus-derived Systems

كفاءة الإنتاج البارفو المؤتلف مع مساعدة من اتش المستمدة من الأنظمة

Rodent parvoviruses (PV) such as rat H-1PV and MVM, are small icosahedral, single stranded, DNA viruses. Their genome includes two promoters P4 and P38 ...

Engineering and Evolution of Synthetic Adeno-Associated Virus (AAV) Gene Therapy Vectors via DNA Family Shuffling

Engineering and Evolution of Synthetic Adeno-Associated Virus AAV Gene Therapy Vectors via DNA Family Shuffling

الهندسة وتطور فيروس الغدة اسوشيتد الاصطناعية (AAV) المتجهات العلاج الجيني عن طريق الحمض النووي العائلة الخلط

Adeno-associated viral (AAV) vectors represent some of the most potent and promising vehicles for therapeutic human gene transfer due to a unique ...

Production and Purification of Non Replicative Canine Adenovirus Type 2 Derived Vectors

Adenovirus (Ad) derived vectors have been widely used for short or long-term gene transfer, both for gene therapy and vaccine applications. Because of the ...

Dissecting Innate Immune Signaling in Viral Evasion of Cytokine Production

تشريح الفطري اشارة المناعة في التهرب الفيروسية من الإنتاج خلوى

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

تطوير بوساطة حلقة-المجففة بالتبريد متساوي التضخيم الكواشف للكشف عن<em&gt; الكوكسيلا البورنيتية</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

قياس الأنفلونزا النورامينيداز تثبيط الجسم المضاد التتر من قبل انزيم مرتبط كتين الفحص

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

مسحة طريقة أخذ العينات للكشف عن نوروفيروس الإنسان على السطوح

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

تنقية الحمض النووي الفيروسي للتعرف على البروتينات الفيروسية والخلوية المرتبطة بها

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and ...