Name: production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors
Uploaded: 2011-11-27T14:00:00
Duration: 8 min 35 s
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Voir Figure 1 pour une illustration résumant le protocole suivant. Note de sécurité: Tous les documents qui ont été en contact avec les particules virales assemblées doit être désinfecté avec une solution Virkon ou un autre désinfectant approprié. 1. Préparation des stocks d&#39;ADN plasmidique (~ 2 jours) <ol><li> Les plasmides suivants sont requis 1: <ul><li> pRV1 - Contenant de la Rep AAV2 et des séquences Cap </li><li> PH21 - Contenant de la Rep AAV1 et des séquences Cap </li><li> pFdelta6 - Adenovirus-plasmide helper </li><li> Plasmide AAV contenant la cassette d&#39;expression recombinante flanqué AAV2 signaux d&#39;emballage (répétitions terminales inversées, RTI) </li></ul></li><li> Bien pFdelta6 doivent être cultivées dans Stbl2 cellules compétentes pour empêcher la suppression partielle, pRV1 et PH21 peuvent être cultivés dans des cellules DH5alpha compétentes. Plasmides AAV peuvent être cultivés dans des cellules Stbl2 si délétions partielles se produisent dans les cellules DH5alpha. </li><li>L&#39;ADN plasmidique devrait être de haute qualité et exempts de contaminants ARN. Les plasmides peuvent être sélectionnés pour l&#39;intégrité en utilisant les suivantes digère: <ul><li> pRV1 - digérer par Xbal pour donner des bandes de 7,5 kb et 3,8 kb </li><li> PH21 - digérer par EcoRI pour donner des bandes de 4,5 kb, 2,8 kb et 0,2 kb </li><li> pFdelta6 - digérer avec HindIII pour donner des bandes de 5,5 kb, 3 kb, 3 kb, 2,3 kb et 1,5 kb </li></ul></li></ol> 2. Préparation de l&#39;Homme cellules rénales 293 (HEK293) embryonnaires pour la transfection (2 - 3 jours) <ol><li> Deux plaques de 80% confluentes de 150 cm 2 flacons de cellules HEK293 en cinq plats 15 cm de diamètre de culture de tissus Nunc. Les cellules doivent être de 70 à 80% de confluence avant la transfection (environ 48 heures après placage). Cellules en culture en milieu standard Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) avec faible taux de glucose contenant 10% de sérum de veau foetal et 100 U / ml de pénicilline / 100 pg / ml de streptomycine. </li><li> 3 heures avant la transfection retirer DMEM et le remplacer par Iscove«Moyen s de Dulbecco modifié (IMDM) contenant 5% de sérum de veau foetal. </li></ol> 3. La transfection de plasmides viraux (~ 1 heure pour la transfection, 3 jours d&#39;incubation) <ol><li> Préparer les informations suivantes pour un seul lot (5 x 15 cm des plaques de culture de tissu) du virus: <ul><li> 62,5 ug de plasmide AAV </li><li> 125 ug pFdelta6 </li><li> 31,25 mg pRV1 </li><li> 31,25 mg PH21 </li><li> 1650 ul de 2,5 M CaCl 2 </li><li> 12 ml dH 2 O </li></ul></li><li> Dans une classe de filtre 2 capot de culture de tissus stériles le mélange de transfection dans un tube de 50 ml. </li><li> Alors vortex de la solution, ajouter rapidement 13 ml de HEPES x 2 saline tamponnée (pH 7,05). Replacer le couvercle du tube de 50 ml et de continuer à vortex pendant 15 secondes. Laisser reposer pendant 1 minute 45 secondes, un fin précipité blanc doit se former. </li><li> Doucement ajouter 5 ml de la solution de transfection pour chaque plat de 15 cm de culture de tissu. Swirl plaques pour mélanger et retourner à l&#39;incubateur. </li><li> 16 heures après transfection retirer milieu IMDM et remplacer par du DMEM. </li></ol> 4. Lyse des cellules et la récolte de rAAVs (2 heures) <ol><li> 72 heures après transfection, retirez le support de plaques de culture cellulaire et le jeter. Tous les déchets doivent être traités avec une solution Virkon ou un autre désinfectant approprié. </li><li> Lavez délicatement les cellules de phosphate de 1x chaude saline tamponnée (PBS, pH 7,4). </li><li> Ajouter 25 ml de PBS chaude à chaque plaque et retirez délicatement les cellules avec un racleur de cellules. Recueillir suspension dans des tubes de 50 ml. </li><li> Pellet cellules à 800 xg pendant 10 minutes. </li><li> Rejeter le surnageant et remettre le culot dans 150 mM de NaCl, 20 mM Tris pH 8,0, utiliser 10 ml par plaque de culture tissulaire. Scindé en deux tubes de 50 ml. </li><li> Préparer une nouvelle solution de désoxycholate de sodium à 10% en DH 2 O. Ajouter 1,25 ml de cette dans chaque tube pour une concentration finale de 0,5%. Ajouter benzonase nucléase à une concentration finale de 50 unités par ml. Mélanger soigneusement le tube. </li><li&gt; Incuber à 37 ° C pendant 1 heure. </li><li> Enlevez les débris cellulaires par centrifugation à 3000 xg pendant 15 minutes. Transfert à tube de 50 ml frais, s&#39;assurer que tous les débris cellulaires a été enlevée pour empêcher le blocage des colonnes d&#39;héparine (voir étape 5). A ce stade, les échantillons peuvent être conservés à -20 ° C avant de continuer. Nous avons stocké des échantillons pendant plusieurs semaines à -20 ° C sans réduction de l&#39;infectiosité. </li></ol> 5. Purification sur colonne d&#39;héparine de rAAVs (2 - 3 heures) <ol><li> Configuration des colonnes HiTrap héparine en utilisant une pompe péristaltique afin que les solutions de flux dans la colonne à 1 ml par minute pour les étapes 5.2 à 5.4. Il est important de s&#39;assurer qu&#39;aucune bulle d&#39;air sont introduits dans la colonne d&#39;héparine. </li><li> Equilibrer la colonne avec 10 ml de NaCl 150 mM, Tris 20 mM, pH 8,0. </li><li> Appliquer 50 ml solution de virus de la colonne et permettre de circuler à travers. </li><li> Laver la colonne avec 20 ml de NaCl 100 mM, Tris 20 mM, pH 8,0. </li><li> En utilisant une seringue de 5 ml de continuer à laver les colonnes wvec 1 ml de NaCl 200 mM, Tris 20 mM, pH 8,0, puis 1 ml de NaCl 300 mM, Tris 20 mM, pH 8,0. Jeter l&#39;effluent à travers. </li><li> Utiliser seringues de 5 ml et éluer une légère pression du virus de la colonne en appliquant: <ul><li> 1,5 ml de NaCl 400 mM, Tris 20 mM, pH 8,0 </li><li> 3,0 ml de NaCl 450 mM, Tris 20 mM, pH 8,0 </li><li> 1,5 ml de NaCl 500 mM, Tris 20 mM, pH 8,0 </li><li> Collectionnez ces dans un tube à centrifuger de 15 ml. </li></ul></li></ol> 6. Concentration et la filtration stérile de rAAVs (1 heure) <ol><li> Concentré vecteur en utilisant Amicon ultra-4 unités de filtration centrifuge avec une coupure 100 000 poids moléculaire. Charge de 4 ml d&#39;éluat de la colonne dans le concentrateur et centrifuger à 2000 xg pendant 2 minutes (à température ambiante). Jeter accréditives et le concentrateur de rechargement avec une solution de virus restants et centrifugation répéter. Le volume concentré devrait être d&#39;environ 250 pi. Si le volume de concentré est beaucoup plus que cela, jeter le flux de trâce et de continuer à centrifugeuse dans une minute jusqu&#39;à ce que les mesures de volume est d&#39;environ 250 pi. </li><li> Ajouter 250 pi de PBS au virus pour un volume final de 500 pl et retirer du concentrateur. </li><li> Filtrer à travers un vecteur de diamètre filtre de 0,2 um 13 mm seringue. Vecteur devraient être aliquotés et conservés à -80 ° C jusqu&#39;à ce que nécessaire. </li></ol> 7. Titrage des stocks viraux (3 jours) Cela nécessite un promoteur qui est actif dans les cellules HEK293 conduire un gène rapporteur ou un produit du gène immunocytochimique détectable. Lorsque la production d&#39;un vecteur qui n&#39;est pas compatible avec les cellules HEK293 autres lignées cellulaires ou des cultures de cellules primaires peut être utilisé. <ol><li> Préparer 18 poly-L-lysine lamelles de verre enduit ou 18 puits de diapositives chambre de Nunc par ensemencement des cellules HEK293 de sorte qu&#39;ils sont 40 - 50% confluentes. Pour le titrage de Cre dépendant rAAVs utiliser les cellules HEK293 qui expriment de façon stable la recombinase Cre 2. </li><li> Infect chaque puits avec de série Dilutions du vecteur AAV (figure 2A). Utilisez 3 puits par dilution. Nous avons régulièrement ajouter des virus directement à chaque puits. </li><li> Après 72 heures corriger les cellules HEK293 en ajoutant un volume égal de 4% de paraformaldéhyde (PFA) à moyenne (ce qui donne une concentration finale de 2% PFA) pendant dix minutes à température ambiante. </li><li> Laver la cellule à trois reprises dans du PBS, rincer à l&#39;dH 2 O et lamelle. </li><li> Comptez le nombre de cellules transduites par les trois puits qui ont le plus haut facteur de dilution, mais contient encore des cellules infectées, trouver le moyen de ces derniers et le multiplier par le facteur de dilution de donner le nombre d&#39;unités infectieuses par microlitre (figure 2B). </li></ol> 8. Résultats prévus HEK293 transduites avec un encodage virus renforcée protéine fluorescente verte (eGFP) sont présentés dans la figure 2B. Nous avons généralement d&#39;atteindre des titres cohérents d&#39;environ 6 x 10 6 particules infectieuses par litre micro. Nous utilisons régulièrement ces vecteurs pour stéréotaxique Injection dans le cerveau de rongeurs adultes. Ceci fournit une technique puissante pour la région spécifique l&#39;expression des gènes 2. Pour combiner cette spécificité région avec un type de cellule d&#39;expression génique sélective nous injectons de la recombinase Cre dépendant rAAVs dans les régions cibles de Cre-souris transgéniques 2. Figure 2C-E montre des exemples d&#39;injections stéréotaxiques de Cre dépendant rAAVs encodage eGFP dans différentes régions du cerveau des souris adultes parvalbumine-Cre transgéniques 3. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3348/3348fig1.jpg" /> Figure 1. Illustration schématique du protocole pour la production de rAAV. . 1) les cellules HEK293 sont plaquées et cultivées à 70 - 80% de confluence. 2.) Plasmides AAV et d&#39;aide sont préparés et transfecté dans les cellules HEK293. 3.) Medium est modifié pour revenir à DMEM 16 heures après transfection et les cellules HEK293 sont cultivées pour un autre 56 heures. 4.) HEK293 sont récoltées et lysées. vecteurs rAAV sont séparés des débris cellulaires par centrifugation. 5.) Les particules virales sont purifiées à travers des colonnes d&#39;héparine avant la concentration et la stérilisation. 6.) HEK293 sont cultivés sur des plaques de 24 puits et les infecter avec des dilutions en série du vecteur AAV pour déterminer le nombre d&#39;unités infectieuses. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3348/3348fig2.jpg" /> Figure 2. Titrage et en application in vivo de rAAV1 / 2. (A) l&#39;installation des cellules HEK293 pour la mesure de titre viral. Cellules HEK293 sont transduites avec des dilutions en série de rAAVs. C, le contrôle non infectés, N, 1 pl de stock viral non dilué. (B) Hek293 cellules infectées par rAAVs exprimant eGFP. (CE) expression de l&#39;EGFP virale est limitée à Cre-neurones exprimant dans les régions cibles différentes de souris transgéniques parvalbumine-Cre après l&#39;injection stéréotaxique de Cre-activé rAAVs. Des exemples montrent des images immunoréactivité GFP dans (C) pallidus l&#39;réticulaire du thalamus et le globus, (D) le gyrus denté et (E) de la région CA1 de l&#39;hippocampe. DG, deNtate gyrus; RT, le noyau réticulaire thalamique; GP, le globus pallidus. Barres d&#39;échelle: B, 500 um; C, 100 um; D, 100 um; E, 500 um.

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Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

vecteurs rAAV sont de plus en plus précieuse pour les études in vivo chez l&#39;animal. Ici, nous avons décrit un protocole simple et peu coûteuse pour produire rAAVs, ce qui peut faciliter l&#39;application généralisée de ce vecteur utile en évitant l&#39;externalisation coûteuse de la production de virus pour les entreprises. Le protocole (basé sur la référence 1) décrit la production de chimères rAAV1 / 2 vecteurs contenant des protéines de capside des deux sérotypes parental à 4 rapports égaux. La purification des vecteurs rAAV en se liant à l&#39;héparine colonnes repose sur l&#39;expression des protéines de capside AAV2, mais peut être combiné avec d&#39;autres sérotypes que AAV1 décrites ici. En outre, les AAV6 a été signalé à lier à l&#39;héparine, mais avec une affinité réduite, et pourrait potentiellement être purifié par des colonnes d&#39;héparine en utilisant cette procédure 5,6. Il faut noter cependant que d&#39;autres sérotypes nécessitera différentes concentrations de NaCl pour élution sur colonne d&#39;héparine 5,7. Emballage génomes rAAV a été montré pour être optimal entre 4,1 et 4,9 kb avec une forte réduction de l&#39;efficacité des emballages jusqu&#39;à 5,2 kb 8. Cette limite de l&#39;emballage peut être considéré comme le plus grand inconvénient du système rAAV, puisque le type spécifique de cellules régulation de l&#39;expression du transgène est généralement réalisée par des éléments agissant en cis grands qui ne peuvent pas être logés dans les particules de petite AAV. Pour surmonter lots titre faible, tels que ceux résultant de tenter de gènes colis qui sont proches de la limite d&#39;emballage AAV nous sommes séparés lots combinant virale concentrée à 250 ul dans un lot de 500 ul, plutôt que d&#39;ajouter du PBS comme décrit dans l&#39;étape 6.3. Fiable type cellulaire transduction spécifiques peuvent être obtenus en combinant Cre-pilote des souris et des cassettes rAAV conditionnelle (voir ci-dessous) pour éviter d&#39;étirer à la limite de l&#39;emballage. Fait à noter, tout ce protocole tente de fournir facile à suivre les instructions sur la production de t hauteITER rAAV, elle nécessite la présence de fragments de protéine de capside AAV2 pour la purification par chromatographie d&#39;affinité d&#39;héparine. Sérotypes autres que AAV2 doit être purifiée en utilisant des procédures de rechange 9. Un avantage de purification sur colonne d&#39;héparine est il est censé produire des vecteurs AAV qui ont un taux plus infectieux que ceux produits en utilisant un gradient de chlorure de césium 10. Cependant, il ya aussi quelques inconvénients à cette méthode. Par exemple, d&#39;autres protéines qui se lient l&#39;héparine peut également être présents dans le stock viral purifié. Alors que le tropisme de l&#39;héparine purifiée vecteurs peuvent être influencés par le titre en vecteur 10, notre approche pour cibler spécifiquement soit 20 excitateurs ou inhibiteurs des neurones (Fig. 2) emploie Cre induit l&#39;activation de l&#39;expression du transgène AAV-médiatisée et est indépendante du titre. Une alternative à la purification sur colonne d&#39;héparine est l&#39;utilisation d&#39;un gradient de densité iodixanol, qui produit un titre supérieur et de la préparation virale plus pur que l&#39;utilisation deun gradient de chlorure de césium 10. Cette méthode peut également être combiné avec purification sur colonne d&#39;héparine pour produire un vecteur qui est supérieure à 99% pur 11. Par conséquent, un examen attentif doit être pris par des groupes individuels quant à la méthode de purification virale est le meilleur pour leur application particulière aval. Le problème le plus fréquent associé à ce protocole est faible titre viral. Dans notre expérience, cela peut généralement être attribuée à l&#39;efficacité de transfection faible, ou l&#39;élution du virus à partir des colonnes d&#39;héparine. Tous les matériaux de transfection doit être à température ambiante avant la transfection, et transfections test doit être effectué à trouver les conditions optimales dans chaque laboratoire. D&#39;autres méthodes de transfection, tels que la lipofectamine, sont très efficaces, mais peut être prohibitif. En outre, la concentration et du pH des solutions d&#39;héparine élution de la colonne est critique pour l&#39;élution complète des virions à partir witho colonnes d&#39;héparinedommages ut. Un autre point important est que les cellules de conditionnement doit bien adhérer à la surface des boîtes de culture tissulaire. Si les cellules se détachent à un certain stade de la procédure, il est conseillé de mettre fin à l&#39;expérience et le dégivrage d&#39;un nouveau flacon de cellules. Spatio-temporelle contrôle de l&#39;expression du transgène chez les rongeurs est facilement réalisé en ciblant anatomiques précis et le stade de développement de l&#39;animal. Efficace le transfert de gène AAV-médiatisée a été démontré in utero 12,13. Dans le cerveau adulte, la zone infectée avec des particules rAAV après l&#39;injection stéréotaxique peut être réglée de très petites régions ciblées, à des domaines beaucoup plus grande, non seulement par des changements dans le titre viral mais aussi en modifiant les paramètres d&#39;injection. Il s&#39;agit notamment du volume et de rapidité d&#39;injections et de l&#39;inclusion du mannitol polyol avec la suspension de 14 virus. Le mannitol peut aussi être utilisé pour améliorer l&#39;infection d&#39;une variété de tissus après injection systémique rAAV 15 &lt;/ Sup&gt;. La capacité de conditionnement de rAAV (environ 4,7 kb) est probablement le facteur le plus limitant en termes de gènes qui peuvent être exprimées à partir de ces vecteurs viraux. Cependant, des études récentes ont montré que cela peut être partiellement surmonté par fractionnement gènes plus ou cassettes d&#39;expression dans des vecteurs rAAV séparées et l&#39;introduction d&#39;une séquence de transition, initier l&#39;expression des gènes lors des virions infectent la même cellule 16. Les niveaux d&#39;expression des gènes portés par les vecteurs rAAV peut aussi être grandement améliorée en utilisant l&#39;auto-gratuit vecteurs rAAV 17. Injection stéréotaxique de vecteurs rAAV fournit une méthode rapide, peu coûteux et puissant pour induire l&#39;expression des gènes de façon spécifique à la région. En combinaison avec deux stratégies de génération de l&#39;interférence ARN ND 18 rAAVs peut également être utilisé pour la région spécifique du gène-assommer. rAAVs peut être combiné avec Cre-souris transgéniques ou de type cellulaire promoteurs spécifiques à atteindre et des circuits de type cellulaireSpécifiques à l&#39;expression des gènes, permettant les manipulations génétiques à haute résolution spatiale 2,19-21, tandis rAAVs raccord avec par exemple le système Tet ajoute le contrôle temporel sur le virus de l&#39;expression génique à médiation 22,23. Ces exemples illustrent l&#39;énorme potentiel combinatoire de ces vecteurs et prédisent une augmentation rapide de rAAV études basées sur les années à venir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Amicon Ultra filtres centrifuges </td><td> Millipore </td><td> UFC810024 </td><td> 100000 MWCO </td></tr><tr><td> Benzonase nucléase </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E1014 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbeco Eagle modifié (DMEM) </td><td> Invitrogen </td><td> 10567014 </td><td> Supplément de 10% de SVF et 10 unités / ml penicillin/100 pg / ml de streptomycine </td></tr><tr><td> Cellules HEK293 </td><td> American Type Culture Collection </td><td> CRL-1573 </td><td> Utilisez au passage de moins de 30 </td></tr><tr><td> HEPES solution saline tamponnée </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 51558 </td><td></td></tr><tr><td> HiTrap héparine cartouche </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 54836 </td><td></td></tr><tr><td> Iscove Dulbecco modifié par support </td><td> Invitrogen </td><td> 12440-053 </td><td> Supplément de 5% SVF </td></tr><tr><td> Désoxycholate de sodium </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D5670 </td><td> Faire une solution fraîche pour chaque lot </td></tr><tr><td> 15 cm plats culture tissulaire </td><td> Fisher Scientific </td><td> 157150 </td><td></td></tr><tr><td> Stbl2 cellules compétentes </td><td> Invitrogen </td><td> 10268-019 </td><td></td></tr><tr><td> Solution de Virkon </td><td> Fisher Scientific </td><td> NC9821357 </td><td> Laisser pour désinfecter la nuit avant de les jeter à la vidange </td></tr></tbody></table> Réactifs Tableau 1. Spécifiques requises pour le protocole

production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors

Ces dernières années, adéno-associé recombinant vecteurs viraux (AAV) sont devenus de plus en plus précieux pour les études in vivo chez l&#39;animal, et sont également actuellement testé dans des essais cliniques humains. AAV de type sauvage est un membre non-pathogène de la famille des Parvoviridae et intrinsèquement réplication déficiente. Le profil de transduction large, faible réponse immunitaire ainsi que l&#39;expression du transgène forte et persistante obtenus avec ces vecteurs en a fait un outil populaire et versatile pour in vitro et in vivo de gènes. rAAVs peut être facilement et à moindre coût fabriqués en laboratoire et, en fonction de leur profil d&#39;innocuité favorable, sont généralement donnés une classification de sécurité faible. Ici, nous décrivons une méthode pour la production et du titrage rAAVs chimérique contenant les protéines de capside des deux AAV1 et AAV2. L&#39;utilisation de ces vecteurs dits chimérique combine les avantages des deux sérotypes parentale tels que les stocks de titres élevés (AAV1) et de la purificationpar chromatographie d&#39;affinité (AAV2). Ces sérotypes d&#39;AAV sont les mieux étudiés de tous les sérotypes AAV, et individuellement ont un modèle d&#39;infectivité large. Les vecteurs chimériques décrites ici doivent avoir les propriétés infectieuses de AAV1 et AAV2 et peut donc s&#39;attendre à infecter une large gamme de tissus, y compris les neurones, les muscles squelettiques, le pancréas, du rein, entre autres. La méthode décrite ici utilise purification sur colonne d&#39;héparine, une méthode cru donner un titre plus élevé virale et plus propre que les méthodes de préparation virale de purification d&#39;autres, comme la centrifugation à travers un gradient de chlorure de césium. De plus, nous décrivons comment ces vecteurs peuvent être rapidement et facilement titrés de donner une lecture précise du nombre de particules infectieuses produites.

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Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors

Recombinant virus adéno-associés (rAAVs) vecteurs sont de plus en plus précieux pour<em&gt; In vivo</em&gt; Les études chez l&#39;animal. Nous décrivons comment rAAVs peuvent être produites dans le laboratoire et la manière dont ces vecteurs peuvent être titrés de donner une lecture précise du nombre de particules infectieuses produites.

Production et titrage des adéno-associé recombinant vecteurs viraux

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently ...

production-and-titering-of-recombinant-adeno-associated-viral-vectors

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Recombinant Retroviral Production and Infection of B Cells

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control of a heterologous expression system to facilitate the analysis of the resulting phenotype. This approach can be used to express a gene that is not normally found in the organism, to express a mutant form of a gene product, or to over-express a dominant-negative form of the gene product. It is particularly useful in the study of the hematopoetic system, where transcriptional regulation is a major control mechanism in the development and differentiation of B cells 1, reviewed in 2-4.
Mouse genetics is a powerful tool for the study of human genes and diseases. A comparative analysis of the mouse and human genome reveals conservation of synteny in over 90% of the genome 5. Also, much of the technology used in mouse models is applicable to the study of human genes, for example, gene disruptions and allelic replacement 6. However, the creation of a transgenic mouse requires a great deal of resources of both a financial and technical nature. Several projects have begun to compile libraries of knock out mouse strains (KOMP, EUCOMM, NorCOMM) or mutagenesis induced strains (RIKEN), which require large-scale efforts and collaboration 7. Therefore, it is desirable to first study the phenotype of a desired gene in a cell culture model of primary cells before progressing to a mouse model. 
Retroviral DNA integrates into the host DNA, preferably within or near transcription units or CpG islands, resulting in stable and heritable expression of the packaged gene of interest while avoiding transcriptional silencing 8 9. The genes are then transcribed under the control of a high efficiency retroviral promoter, resulting in a high efficiency of transcription and protein production. Therefore, retroviral expression can be used with cells that are difficult to transfect, provided the cells are in an active state during mitosis. Because the structural genes of the virus are contained within the packaging cell line, the expression vectors used to clone the gene of interest contain no structural genes of the virus, which both eliminates the possibility of viral revertants and increases the safety of working with viral supernatants as no infectious virions are produced 10. 
Here we present a protocol for recombinant retroviral production and subsequent infection of splenic B cells. After isolation, the cultured splenic cells are stimulated with Th derived lymphokines and anti-CD40, which induces a burst of B cell proliferation and differentiation 11. This protocol is ideal for the study of events occurring late in B cell development and differentiation, as B cells are isolated from the spleen following initial hematopoetic events but prior to antigenic stimulation to induce plasmacytic differentiation.

An efficient system of structure and function analysis of a gene in an ex vivo culture of splenic B-lymphocytes is described. This method takes advantage of recombinant retroviral production in a helper free, ecotrophic packaging cell line. Stable, heritable expression of a gene of interest within primary lymphocytes is achieved leading to generation of surface antibodies on B cells undergoing class switch recombination.

Recombinante de production et infection rétrovirale des cellules B

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control ...

Recherche

Immunologie et infection

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the generation of extreme population diversity that facilitates virus adaptation and evolution. Increasing evidence shows that the intrinsic error rates, and the resulting mutation frequencies, of RNA viruses can be modulated by subtle amino acid changes to the viral polymerase. Although biochemical assays exist for some viral RNA polymerases that permit quantitative measure of incorporation fidelity, here we describe a simple method of measuring mutation frequencies of RNA viruses that has proven to be as accurate as biochemical approaches in identifying fidelity altering mutations. The approach uses conventional virological and sequencing techniques that can be performed in most biology laboratories. Based on our experience with a number of different viruses, we have identified the key steps that must be optimized to increase the likelihood of isolating fidelity variants and generating data of statistical significance. The isolation and characterization of fidelity altering mutations can provide new insights into polymerase structure and function1-3. Furthermore, these fidelity variants can be useful tools in characterizing mechanisms of virus adaptation and evolution4-7.

The present article describes the steps required to isolate and characterize RNA polymerase fidelity variants of RNA viruses and how to use mutation frequency data to confirm fidelity changes in tissue culture.

Isolement des variantes des virus à ARN de Fidelity et caractérisation de la fréquence de mutation de virus

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

Efficient Recombinant Parvovirus Production with the Help of Adenovirus-derived Systems

Rodent parvoviruses (PV) such as rat H-1PV and MVM, are small icosahedral, single stranded, DNA viruses. Their genome includes two promoters P4 and P38 which regulate the expression of non-structural (NS1 and NS2) and capsid proteins (VP1 and VP2) respectively1. They attract high interest as anticancer agents for their oncolytic and oncosuppressive abilities while being non-pathogenic for humans2. NS1 is the major effector of viral cytotoxicity3. In order to further enhance their natural antineoplastic activities, derivatives from these vectors have been generated by replacing the gene encoding for the capsid proteins with a therapeutic transgene (e.g. a cytotoxic polypeptide, cytokine, chemokine, tumour suppressor gene etc.)4. The recombinant parvoviruses (recPVs) vector retains the NS1/2 coding sequences and the PV genome telomeres which are necessary for viral DNA amplification and packaging. Production of recPVs occurs only in the producer cells (generally HEK293T), by co-transfecting the cells with a second vector (pCMV-VP) expressing the gene encoding for the VP proteins (Fig. 1)4. The recPV vectors generated in this way are replication defective. Although recPVs proved to possess enhanced oncotoxic activities with respect to the parental viruses from which they have been generated, their production remains a major challenge and strongly hampers the use of these agents in anti-cancer clinical applications.
We found that introduction of an Ad-5 derived vector containing the E2a, E4(orf6) and the VA RNA genes (e.g. pXX6 plasmid) into HEK293T improved the production of recPVs by more than 10 fold in comparison to other protocols in use. Based on this finding, we have constructed a novel Ad-VP-helper that contains the genomic adenoviral elements necessary to enhance recPVs production as well as the parvovirus VP gene unit5. The use of Ad-VP-helper, allows production of rec-PVs using a protocol that relies entirely on viral infection steps (as opposed to plasmid transfection), making possible the use of cell lines that are difficult to transfect (e.g. NB324K) (Fig. 2). We present a method that greatly improves the amount of recombinant virus produced, reducing both the production time and costs, without affecting the quality of the final product5. In addition, large scale production of recPV (in suspension cells and bioreactors) is now conceivable.

Here we describe a protocol based only on cell infection, which improves the efficiency of recombinant parvovirus production by more than 100 fold in comparison to other protocols in use. This protocol relies on the use of a novel adenovirus 5-based helper containing the parvovirus VP transcription unit (Ad-VP).

Efficacité de la production Parvovirus recombinant avec l&#39;aide d&#39;adénovirus dérivés Systems

Rodent parvoviruses (PV) such as rat H-1PV and MVM, are small icosahedral, single stranded, DNA viruses. Their genome includes two promoters P4 and P38 ...

Engineering and Evolution of Synthetic Adeno-Associated Virus (AAV) Gene Therapy Vectors via DNA Family Shuffling

Adeno-associated viral (AAV) vectors represent some of the most potent and promising vehicles for therapeutic human gene transfer due to a unique combination of beneficial properties1. These include the apathogenicity of the underlying wildtype viruses and the highly advanced methodologies for production of high-titer, high-purity and clinical-grade recombinant vectors2. A further particular advantage of the AAV system over other viruses is the availability of a wealth of naturally occurring serotypes which differ in essential properties yet can all be easily engineered as vectors using a common protocol1,2. Moreover, a number of groups including our own have recently devised strategies to use these natural viruses as templates for the creation of synthetic vectors which either combine the assets of multiple input serotypes, or which enhance the properties of a single isolate. The respective technologies to achieve these goals are either DNA family shuffling3, i.e. fragmentation of various AAV capsid genes followed by their re-assembly based on partial homologies (typically &gt;80% for most AAV serotypes), or peptide display4,5, i.e. insertion of usually seven amino acids into an exposed loop of the viral capsid where the peptide ideally mediates re-targeting to a desired cell type. For maximum success, both methods are applied in a high-throughput fashion whereby the protocols are up-scaled to yield libraries of around one million distinct capsid variants. Each clone is then comprised of a unique combination of numerous parental viruses (DNA shuffling approach) or contains a distinctive peptide within the same viral backbone (peptide display approach). The subsequent final step is iterative selection of such a library on target cells in order to enrich for individual capsids fulfilling most or ideally all requirements of the selection process. The latter preferably combines positive pressure, such as growth on a certain cell type of interest, with negative selection, for instance elimination of all capsids reacting with anti-AAV antibodies. This combination increases chances that synthetic capsids surviving the selection match the needs of the given application in a manner that would probably not have been found in any naturally occurring AAV isolate. Here, we focus on the DNA family shuffling method as the theoretically and experimentally more challenging of the two technologies. We describe and demonstrate all essential steps for the generation and selection of shuffled AAV libraries (Fig. 1), and then discuss the pitfalls and critical aspects of the protocols that one needs to be aware of in order to succeed with molecular AAV evolution.

Engineering and Evolution of Synthetic Adeno-Associated Virus AAV Gene Therapy Vectors via DNA Family Shuffling

We demonstrate the basic technique to molecularly engineer and evolve synthetic Adeno-associated viral (AAV) gene therapy vectors via DNA family shuffling. Moreover, we provide general guidelines and representative examples for selection and analysis of individual chimeric capsids with enhanced properties on target cells in culture or in mice.

Vecteurs d&#39;ingénierie et de l&#39;évolution de la synthèse Adeno-Associated Virus (AAV) thérapie génique par la famille de réarrangement d&#39;ADN

Adeno-associated viral (AAV) vectors represent some of the most potent and promising vehicles for therapeutic human gene transfer due to a unique ...

Production and Purification of Non Replicative Canine Adenovirus Type 2 Derived Vectors

Adenovirus (Ad) derived vectors have been widely used for short or long-term gene transfer, both for gene therapy and vaccine applications. Because of the frequent pre-existing immunity against the classically used human adenovirus type 5, canine adenovirus type 2 (CAV2) has been proposed as an alternative vector for human gene transfer. The well-characterized biology of CAV2, together with its ease of genetic manipulation, offer major advantages, notably for gene transfer into the central nervous system, or for inducing a wide range of protective immune responses, from humoral to cellular immunity. Nowadays, CAV2 represents one of the most appealing nonhuman adenovirus for use as a vaccine vector. This protocol describes a simple method to construct, produce and titer recombinant CAV2 vectors. After cloning the expression cassette of the gene of interest into a shuttle plasmid, the recombinant genomic plasmid is obtained by homologous recombination in the E. coli BJ5183 bacterial strain. The resulting genomic plasmid is then transfected into canine kidney cells expressing the complementing CAV2-E1 genes (DK-E1). A viral amplification enables the production of a large viral stock, which is purified by ultracentrifugation through cesium chloride gradients and desalted by dialysis. The resulting viral suspension routinely has a titer of over 1010 infectious particles per ml and can be directly administrated in vivo.

These past 15 years, canine adenovirus type 2 (CAV2)-derived vectors have proven their efficiency to transduce cells in vitro&#160;and in vivo and are widely used for vaccination and gene therapy. Here, we describe a procedure to construct, produce and purify CAV2 vectors, giving rise to high-titer viral suspensions.

Adenovirus (Ad) derived vectors have been widely used for short or long-term gene transfer, both for gene therapy and vaccine applications. Because of the ...

Dissecting Innate Immune Signaling in Viral Evasion of Cytokine Production

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. Conversely, viruses have evolved intricate strategies to evade and exploit host immune signaling for survival and propagation. Viral immune evasion, entailing host defense and viral evasion, provides one of the most fascinating and dynamic interfaces to discern the host-virus interaction. These studies advance our understanding in innate immune regulation and pave our way to develop novel antiviral therapies.
Murine &#947;HV68 is a natural pathogen of murine rodents. &#947;HV68 infection of mice provides a tractable small animal model to examine the antiviral response to human KSHV and EBV of which perturbation of in vivo virus-host interactions is not applicable. Here we describe a protocol to determine the antiviral cytokine production. This protocol can be adapted to other viruses and signaling pathways.
Recently, we have discovered that &#947;HV68 hijacks MAVS and IKK&#946;, key innate immune signaling components downstream of the cytosolic RIG-I and MDA5, to abrogate NF&#922;B activation and antiviral cytokine production. Specifically, &#947;HV68 infection activates IKK&#946; and that activated IKK&#946; phosphorylates RelA to accelerate RelA degradation. As such, &#947;HV68 efficiently uncouples NF&#922;B activation from its upstream activated IKK&#946;, negating antiviral cytokine gene expression. This study elucidates an intricate strategy whereby the upstream innate immune activation is intercepted by a viral pathogen to nullify the immediate downstream transcriptional activation and evade antiviral cytokine production.

We describe a protocol to measure the antiviral cytokine production in mice infected with a model herpesvirus, murine gamma herpesvirus 68 (&#947;HV68) that is closely-related to human Kaposi&#8217;s sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) and Epstein-Barr virus (EBV). Utilizing genetically modified mouse strains and mouse embryonic fibroblasts (MEFs), we assessed the antiviral cytokine production both in vivo and ex vivo. &#8220;Reconstituting&#8221; the expression of innate immune components in knockout embryonic fibroblasts by lentiviral transduction, we further pinpoint specific innate immune molecules and dissect the key signaling events that differentially regulate the antiviral cytokine production.

Dissection Innate Immune signalisation Evasion virale de la production de cytokines

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. burnetii DNA in cell cultures and clinical samples. PCR requires specialized equipment and extensive end user training, and therefore, it is not suitable for routine work especially in a resource-constrained area. We have developed a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay to detect the presence of C. burnetii in patient samples. This method is performed at a single temperature around 60 &#176;C in a water bath or heating block. The sensitivity of this LAMP assay is very similar to PCR with a detection limit of about 25 copies per reaction. This report describes the preparation of the reaction using lyophilized reagents and visualization of results using hydroxynaphthol blue (HNB) or a UV lamp with fluorescent intercalating dye in the reaction. The LAMP reagents were lyophilized and stored at room temperature (RT) for one month without loss of detection sensitivity. This LAMP assay is particularly robust because the reaction mixture preparation does not involve complex steps. This method is ideal for use in resource-limited settings where Q fever is endemic.

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

We described here a simple loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method using lyophilized reagents for the detection of C. burnetii in patient samples.

Le développement de lyophilisé boucle médiées isothermes Amplification Réactifs pour la détection des<em&gt; Coxiella burnetii</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional methods to measure NA inhibiting (NI) antibody titers are not practical for routine serology. This protocol describes the enzyme-linked lectin assay (ELLA), a practical alternative method to measure NI titers that is performed in 96 well plates coated with a large glycoprotein substrate, fetuin. NA cleaves terminal sialic acids from fetuin, exposing the penultimate sugar, galactose. Peanut agglutinin (PNA) is a lectin with specificity for galactose and therefore the extent of desialylation can be quantified using a PNA-horseradish peroxidase conjugate, followed by addition of a chromogenic peroxidase substrate. The optical density that is measured is proportional to NA activity. To measure NI antibody titers, serial dilutions of sera are incubated at 37 &#176;C O/N on fetuin-coated plates with a fixed amount of NA. The reciprocal of the highest serum dilution that results in &#8805;50% inhibition of NA activity is designated as the NI antibody titer. The ELLA provides a practical format for routine evaluation of human antibody responses following influenza infection or vaccination.

We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.

Mesure de la grippe neuraminidase Inhibition Titres d&#39;anticorps par-enzymatique lectine Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the person-to-person route or indirectly through environmental surfaces or food, contaminated fomites and inanimate surfaces are important vehicles for the spread of the virus during norovirus outbreaks.
We developed and evaluated a protocol using macrofoam swabs for the detection and typing of human noroviruses from hard surfaces. Compared with fiber-tipped swabs or antistatic wipes, macrofoam swabs allow virus recovery (range 1.2-33.6%) from toilet seat surfaces of up to 700 cm2. The protocol includes steps for the extraction of the virus from the swabs and further concentration of the viral RNA using spin columns. In total, 127 (58.5%) of 217 swab samples that had been collected from surfaces in cruise ships and long-term care facilities where norovirus gastroenteritis had been reported tested positive for GII norovirus by RT-qPCR. Of these 29 (22.8%) could be successfully genotyped. In conclusion, detection of norovirus on environmental surfaces using the protocol we developed may assist in determining the level of environmental contamination during outbreaks as well as detection of virus when clinical samples are not available; it may also facilitate monitoring of effectiveness of remediation strategies.

A macrofoam based sampling methodology was developed and evaluated for the detection and quantification of norovirus on environmental hard surfaces.

Swab Méthode d&#39;échantillonnage pour la détection des norovirus humains sur les surfaces

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and cellular proteins by mass spectrometry. Although proteins that interact with viral genomes play major roles in determining the outcome of infection, a comprehensive analysis of viral genome associated proteins was not previously feasible. Here we demonstrate a method that enables the direct purification of HSV-1 genomes from infected cells. Replicating viral DNA is selectively labeled with modified nucleotides that contain an alkyne functional group. Labeled DNA is then specifically and irreversibly tagged via the covalent attachment of biotin azide via a copper(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition or click reaction. Biotin-tagged DNA is purified on streptavidin-coated beads and associated proteins are eluted and identified by mass spectrometry. This method enables the selective targeting and isolation of HSV-1 replication forks or whole genomes from complex biological environments. Furthermore, adaptation of this approach will allow for the investigation of various aspects of herpesviral infection, as well as the examination of the genomes of other DNA viruses.

The goal of this protocol is to specifically tag and selectively isolate viral DNA from infected cells for the characterization of viral genome associated proteins.