Name: production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors
Uploaded: 2011-11-27T14:00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors at JoVE.com

ראה איור 1 להמחשה המסכם את הפרוטוקול הבא. הערה בטיחות: כל החומר כי כבר במגע עם חלקיקים נגיפיים התאספו צריך לחטא עם פתרון Virkon או חומר חיטוי מתאים אחר. 1. הכנה של מניות ה-DNA פלסמיד (~ 2 ימים) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלסמידים הבאים נדרשים 1: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> pRV1 - מכיל את הודעות AAV2 רצפים שווי </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> pH21 - מכיל את AAV1 הודעות רצפים שווי </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> pFdelta6 - adenovirus-helper פלסמיד </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> AAV פלסמיד המכיל את הקלטת ביטוי רקומביננטי מוקף AAV2 אותות אריזה (חוזר מסוף הפוכה, ITRS) </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד pFdelta6 צריך להיות מבוגר Stbl2 תאים המוסמכות כדי למנוע מחיקה חלקית, pRV1 ו pH21 ניתן לגדל תאים DH5alpha המוסמכות. פלסמידים AAV ניתן לגדל תאים Stbl2 אם מחיקות חלקיות להתרחש בתאים DH5alpha. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">ה-DNA פלסמיד צריך להיות באיכות גבוהה ללא מזהמים RNA. פלסמידים יכול להיות מוקרן על שלמות באמצעות מעכל הבאים: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> pRV1 - לעכל עם XbaI לתת להקות של 7.5 קילו ו 3.8 קילו </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> pH21 - לעכל עם EcoRI לתת להקות של 4.5 קילו, 2.8 קילו ו 0.2 קילו </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> pFdelta6 - לעכל עם HindIII לתת להקות של 5.5 קילו, 3 קילו, 3 קילו, 2.3 קילו ו 1.5 קילו </li></ul></li></ol> 2. הכנת האדם תאים כליה 293 (Hek293) עובריים עבור transfection (2 - 3 ימים) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט two 80% ומחוברות 150 ס&quot;מ 2 בקבוקי Hek293 תאים לחמש בקוטר 15 ס&quot;מ רקמות מנות Nunc תרבות. תאים צריך להיות 70-80% ומחוברות לפני transfection (כ 48 שעות לאחר ציפוי). התרבות תאים שונה תקן Dulbecco הנשר בינוני (DMEM) עם גלוקוז נמוכה המכיל 10% עוברית עגל בסרום 100 U / ml פניצילין / 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​סטרפטומיצין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 3 שעות לפני transfection DMEM להסיר ולהחליף Iscove&quot;בינוני זה שונה של Dulbecco (IMDM) המכיל 5% עובר עגל בסרום. </li></ol> 3. Transfection של פלסמידים ויראלי (~ 1 שעה עבור transfection, 3 ימים של דגירה) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן הבאים על אצווה אחת (5 x 15 ס&quot;מ רקמות צלחות התרבות) של הנגיף: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 62.5 מיקרוגרם פלסמיד AAV </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 125 מיקרוגרם pFdelta6 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 31.25 מיקרוגרם pRV1 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 31.25 מיקרוגרם pH21 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1650 μl 2.5 M CaCl 2 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 12 מ&quot;ל DH 2 O </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב 2 הכיתה מסנן רקמה ברדס תרבות סטרילי transfection את התערובת לתוך שפופרת 50 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד vortexing הפתרון, להוסיף במהירות של 13 מ&quot;ל 2 HEPES x שנאגרו מלוחים (pH 7.05). החלפת מכסה של שפופרת 50 מ&quot;ל ולהמשיך מערבולת למשך 15 שניות. השאר לעמוד למשך 1 דקה 45 שניות, משקע לבן עדין צריך טופס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להוסיף 5 מ&quot;ל של הפתרון transfection לכל צלחת 15 ס&quot;מ רקמה תרבות. צלחות מערבולת לערבב ולחזור חממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 16 שעות לאחר transfection להסיר בינוני IMDM ולהחליף DMEM. </li></ol> 4. Lysing של תאים קצירת rAAVs (2 שעות) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 72 שעות לאחר transfection, להסיר מדיה צלחות תרבית תאים וזורקים. כל פסולת יש להתייחס פתרון Virkon או חומר חיטוי מתאים אחר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף בעדינות את התאים פוספט 1x חם שנאגרו מלוחים (PBS, pH 7.4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 25 מ&quot;ל PBS חם כל צלחת בעדינות להסיר תאים עם מגרד תא. איסוף להשעיה 50 צינורות מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה תאים XG ב 800 במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant ו resuspend גלולה ב 150 מ&quot;מ NaCl, 20 מ&quot;מ טריס pH 8.0, השתמש 10 מ&quot;ל לכל צלחת בתרבית רקמה. פיצול לשתי צינורות 50 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון חדש של deoxycholate נתרן 10% DH 2 O. הוסף 1.25 מ&quot;ל של זה צינור עבור כל ריכוז סופי של 0.5%. הוסף benzonase nuclease לריכוז סופי של 50 יחידות לכל מיליליטר. מערבבים צינור ביסודיות. </li><li&gt; לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר פסולת הסלולר על ידי centrifuging XG ב 3000 במשך 15 דקות. העברה שפופרת 50 מ&quot;ל טריים, להבטיח את כל פסולת התא הוסר על מנת למנוע חסימה של עמודות הפרין (ראה שלב 5). בשלב זה, הדגימות ניתן לאחסן ב -20 ° C לפני שתמשיך. יש לנו לאחסן דגימות במשך מספר שבועות ב -20 ° C, ללא הפחתה של infectivity. </li></ol> 5. טור טיהור הפרין של rAAVs (2 - 3 שעות) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> HiTrap ההתקנה הפרין עמודות באמצעות משאבה peristaltic כך פתרונות לזרום דרך העמודה ב 1 מ&quot;ל לדקה עבור צעדים 5.2-5.4. חשוב לוודא שאין בועות אוויר מוכנסים בעמודה הפרין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן את הטור עם 10 מ&quot;ל 150 mM NaCl, 20 מ&quot;מ טריס, pH 8.0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלת 50 וירוס פתרון מ&quot;ל לעמודה ולאפשר לזרום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף טור עם 20 מ&quot;ל 100 mM NaCl, 20 מ&quot;מ טריס, pH 8.0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מזרק 5 מ&quot;ל להמשיך לשטוף את w עמודהith 1 מ&quot;ל 200 mM NaCl, 20 מ&quot;מ טריס, pH 8.0, ואחריו 1 מ&quot;ל 300 mM NaCl, 20 מ&quot;מ טריס, pH 8.0. מחק את הזרימה דרך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במזרקים 5 מ&quot;ל ו elute לחץ עדין את הוירוס מן הטור על ידי יישום: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1.5 מ&quot;ל 400 mM NaCl, 20 מ&quot;מ טריס, pH 8.0 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 3.0 מ&quot;ל 450 mM NaCl, 20 מ&quot;מ טריס, pH 8.0 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1.5 מ&quot;ל 500 mM NaCl, 20 מ&quot;מ טריס, pH 8.0 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף אלה בצינור צנטריפוגה 15 מ&quot;ל. </li></ul></li></ol> 6. ריכוז סינון סטרילי של rAAVs (1 שעה) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תתרכז וקטור באמצעות Amicon אולטרה 4 יחידות מסנן צנטריפוגלי עם הפסקת 100,000 משקל מולקולרי. טען 4 מ&quot;ל של eluate עמודה לתוך concentrator ו צנטריפוגות XG ב 2000 למשך 2 דקות (בטמפרטורת החדר). בטל flowthrough ו concentrator מחדש עם פתרון וירוס הנותרים צנטריפוגה לחזור. נפח מרוכז צריך להיות כ 250 μl. אם נפח מרוכזים באופן משמעותי יותר מזה, לא להשליך את זרימתדרך עינית ולהמשיך צנטריפוגות באחד השלבים דקה עד נפח כ 250 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 250 μl של PBS לנגיף עבור נפח סופי של 500 μl ולהסיר concentrator. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וקטור סינון באמצעות מסנן 13 מ&quot;מ קוטר 0.2 מיקרומטר מזרק. וקטור צריך להיות aliquoted ומאוחסנים ב -80 ° C עד הנדרשים. </li></ol> 7. Titering מניות ויראלי (3 ימים) זה דורש היזם כי הוא פעיל Hek293 תאים נהיגה גן עיתונאי או מוצר לגילוי הגן immunocytochemically. כאשר ייצור וקטור כי אינו תואם Hek293 תאים שורות תאים אחרים או בתרביות תאים ראשונית ניתן להשתמש. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 18 פולי-L-ליזין coverslips זכוכית מצופה או 18 בארות של שקופיות Nunc קאמרית על ידי זריעת Hek293 התאים, כך הם 40-50% ומחוברות. עבור טיטרציה של Cre תלויי rAAVs להשתמש Hek293 התאים ביציבות להביע Cre recombinase 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להדביק כל טוב עם ד סדרתיilutions של וקטור AAV (איור 2A). השתמש 3 בארות לכל דילול. אנחנו באופן קבוע להוסיף וירוס ישירות היטב כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 72 שעות לתקן Hek293 תאים ידי הוספת נפח שווה של paraformaldehyde 4% (PFA) עד בינוני (מתן ריכוז סופי של PFA 2%) למשך עשר דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף תא שלוש פעמים PBS, לשטוף ב DH 2 O ו coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים transduced משלוש בארות, כי יש גורם לדילול הגבוה ביותר, אך עדיין מכילים תאים נגועים, למצוא את הממוצע של אלה להכפיל בפקטור את הדילול לתת את מספר יחידות זיהומיות לכל microliter (איור 2 ב). </li></ol> 8. תוצאות חזויות Hek293 תאים transduced עם קידוד וירוס משופרת חלבון הפלואורסצנט הירוק (eGFP) מוצגים בתרשים 2B. אנחנו בדרך כלל להשיג titers עקבית של כ 6 x 10 6 חלקיקים זיהומיות לליטר מיקרו. אנו משתמשים באופן שגרתי אלה וקטורים עבור stereotaxic injection לתוך המוח מכרסם מבוגר. זה מספק שיטה רבת עוצמה לביטוי באזור ספציפי גן 2. כדי לשלב ספציפי זה אזור עם הביטוי תא מסוג גנים סלקטיבית אנו מזריקים Cre recombinase תלויי rAAVs לאזורים היעד של העכברים הטרנסגניים Cre-2. איור 2C-E מציג דוגמאות של זריקות stereotaxic של Cre תלויי rAAVs קידוד eGFP לתוך אזורי מוח שונים של מבוגר parvalbumin-Cre העכברים הטרנסגניים 3. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3348/3348fig1.jpg" /> באיור 1. איור סכמטי של פרוטוקול לייצור rAAV. . 1) Hek293 תאים מצופה גדלה 70-80 מפגש%. 2.) פלסמידים AAV וגם עוזר מוכנים ו transfected Hek293 לתוך התאים. 3.) בינוני משתנה בחזרה DMEM 16 שעות לאחר transfection ו Hek293 התאים בתרבית למשך 56 שעות. 4.) Hek293 התאים נקצרים ו lysed. וקטורים rAAV מופרדים מן ההריסות התא על ידי גentrifugation. 5.) חלקיקים נגיפיים הם מטוהרים באמצעות עמודות הפרין לפני ריכוז עיקור. 6). Hek293 התאים גדלים על 24 צלחות טוב להדביק עם דילולים סדרתי של וקטור AAV כדי לקבוע את מספר יחידות זיהומיות. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3348/3348fig2.jpg" /> באיור 2. Titering ו ביישום vivo של rAAV1 / 2. (א) ההתקנה של Hek293 תאים למדידת כייל הנגיף. Hek293 תאים transduced עם דילולים הסידורי של rAAVs. C, שליטה נגוע, N, 1 μl של המניה ויראלי חי. (ב) Hek293 תאים נגועים עם rAAVs להביע eGFP. (CE) ביטוי eGFP ויראלי מוגבל Cre-להביע עצב באזורים שונים של יעד parvalbumin-Cre העכברים הטרנסגניים לאחר ההזרקה stereotaxic של Cre המופעל rAAVs. תמונות דוגמאות להראות immunoreactivity GFP ב pallidus התלמוס רשתי וגלובוס (ג), (ד) gyrus משוננת ו (ה) באזור CA1 של ההיפוקמפוס. DG, דהntate gyrus, RT, רשתי thalamic גרעין, GP, pallidus גלובוס. סולם ברים: B, 500 מיקרומטר, C, 100 מיקרומטר; ד &#39;, 100 מיקרומטר, E, 500 מיקרומטר.

<ol>
	<li>Klugmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV-mediated+hippocampal+expression+of+short+and+long+Homer+1+proteins+differentially+affect+cognition+and+seizure+activity+in+adult+rats.">AAV-mediated hippocampal expression of short and long Homer 1 proteins differentially affect cognition and seizure activity in adult rats.</a> Molecular and Cellular Neurosciences. 28, 347-360 (2005).</li><li>Murray, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parvalbumin-positive+CA1+interneurons+are+required+for+spatial+working+but+not+for+reference+memory.">Parvalbumin-positive CA1 interneurons are required for spatial working but not for reference memory.</a> Nature Neuroscience. 14, 297-299 (2011).</li><li>Hippenmeyer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+developmental+switch+in+the+response+of+DRG+neurons+to+ETS+transcription+factor+signaling.">A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling.</a> PLoS Biology. 3, e159-e159 (2005).</li><li>Hauck, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+characterization+of+chimeric+recombinant+AAV+vectors.">Generation and characterization of chimeric recombinant AAV vectors.</a> Molecular Therapy. 7, 419-425 (2003).</li><li>Halbert, C. L., Allen, J. M., Miller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+type+6+(AAV6)+vectors+mediate+efficient+transduction+of+airway+epithelial+cells+in+mouse+lungs+compared+to+that+of+AAV2+vectors.">Adeno-associated virus type 6 (AAV6) vectors mediate efficient transduction of airway epithelial cells in mouse lungs compared to that of AAV2 vectors.</a> Journal of Virology. 75, 6615-6615 (2001).</li><li>Blankinship, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transduction+of+skeletal+muscle+using+vectors+based+on+adeno-associated+virus+serotype+6.">Efficient transduction of skeletal muscle using vectors based on adeno-associated virus serotype 6.</a> Molecular Therapy. 10, 671-678 (2004).</li><li>Wu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+amino+acid+changes+can+influence+titer,+heparin+binding,+and+tissue+tropism+in+different+adeno-associated+virus+serotypes.">Single amino acid changes can influence titer, heparin binding, and tissue tropism in different adeno-associated virus serotypes.</a> Journal of Virology. 80, 11393-11397 (2006).</li><li>Dong, J. Y., Fan, P. D., Frizzell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+the+packaging+capacity+of+recombinant+adeno-associated+virus.">Quantitative analysis of the packaging capacity of recombinant adeno-associated virus.</a> Human gene therapy. 7, 2101-2112 (1996).</li><li>Zolotukhin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+purification+of+serotype+1,+2,+and+5+recombinant+adeno-associated+viral+vectors.">Production and purification of serotype 1, 2, and 5 recombinant adeno-associated viral vectors.</a> Methods. 1, 158-167 (2002).</li><li>Burova, E., Loffe, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatographic+purification+of+recombinant+adenoviral+and+adeno-associated+viral+vectors:+methods+and+implications.">Chromatographic purification of recombinant adenoviral and adeno-associated viral vectors: methods and implications.</a> Gene Therapy. 12, 5-17 (2005).</li><li>Zolotukhin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+adeno-associated+virus+purification+using+novel+methods+improves+infectious+titer+and+yield.">Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield.</a> Gene Therapy. 6, 973-985 (1999).</li><li>Bilbao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+gene+expression+from+in+utero+delivery+of+adenoviral-associated+vector+serotype+1.">Patterns of gene expression from in utero delivery of adenoviral-associated vector serotype 1.</a> Human Gene Therapy. 16, 678-684 (2005).</li><li>Pilpel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=reproducible+transduction+of+select+forebrain+regions+by+targeted+recombinant+virus+injection+into+the+neonatal+mouse+brain.">reproducible transduction of select forebrain regions by targeted recombinant virus injection into the neonatal mouse brain.</a> Journal of Neuroscience Methods. 182, 55-63 (2009).</li><li>Mastakov, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+injection+of+rAAV+with+mannitol+enhances+gene+expression+in+the+rat+brain.">Combined injection of rAAV with mannitol enhances gene expression in the rat brain.</a> Molecular Therapy. 3, 225-232 (2001).</li><li>Fu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-complementary+adeno-associated+virus+serotype+2+vector:+global+distribution+and+broad+dispersion+of+AAV-mediated+transgene+expression+in+mouse+brain.">Self-complementary adeno-associated virus serotype 2 vector: global distribution and broad dispersion of AAV-mediated transgene expression in mouse brain.</a> Molecular Therapy. 8, 911-917 (2003).</li><li>Ghosh, A., Yue, Y., Duan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Transgene+Reconstitution+with+Hybrid+Dual+AAV+Vectors+Carrying+the+Minimized+Bridging+Sequences.">Efficient Transgene Reconstitution with Hybrid Dual AAV Vectors Carrying the Minimized Bridging Sequences.</a> Human Gene Therapy. 22, 77-83 (2011).</li><li>McCarty, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-complementary+AAV+vectors;+advances+and+applications.">Self-complementary AAV vectors; advances and applications.</a> Molecular Therapy. 16, 1648-1656 (2008).</li><li>Georgiadis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV-mediated+knockdown+of+peripherin-2+in+vivo+using+miRNA-based+hairpins.">AAV-mediated knockdown of peripherin-2 in vivo using miRNA-based hairpins.</a> Gene Therapy. 17, 486-493 (2010).</li><li>Atasoy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FLEX+switch+targets+Channelrhodopsin-2+to+multiple+cell+types+for+imaging+and+long-range+circuit+mapping.">A FLEX switch targets Channelrhodopsin-2 to multiple cell types for imaging and long-range circuit mapping.</a> The Journal of Neuroscience. 28, 7025-7030 (2008).</li><li>Guggenhuber, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV+Vector-Mediated+Overexpression+of+CB1+Cannabinoid+Receptor+in+Pyramidal+Neurons+of+the+Hippocampus+Protects+against+Seizure-Induced+Excitoxicity.">AAV Vector-Mediated Overexpression of CB1 Cannabinoid Receptor in Pyramidal Neurons of the Hippocampus Protects against Seizure-Induced Excitoxicity.</a> PLoS One. 5, e15707-e15707 (2010).</li><li>Lawlor, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+delivery+and+selective+transduction+of+glial+cells+in+the+mammalian+brain+by+AAV+serotypes+isolated+from+nonhuman+primates.">Efficient gene delivery and selective transduction of glial cells in the mammalian brain by AAV serotypes isolated from nonhuman primates.</a> Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 17, 1692-1702 (2009).</li><li>Chtarto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetracycline-inducible+transgene+expression+mediated+by+a+single+AAV+vector.">Tetracycline-inducible transgene expression mediated by a single AAV vector.</a> Gene Therapy. 10, 84-94 (2003).</li><li>Han, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+humoral+immune+response+to+the+tetracycline+(Tet)+activator+in+rats+injected+intracranially+with+Tet-off+rAAV+vectors.">Lack of humoral immune response to the tetracycline (Tet) activator in rats injected intracranially with Tet-off rAAV vectors.</a> Gene Therapy. 17, 616-625 (2010).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

וקטורים rAAV הופכים חשובים יותר ויותר עבור vivo במחקרים בבעלי חיים. הנה, יש לנו תיאר פרוטוקול פשוט וזול עבור rAAVs ייצור, אשר עשוי להקל על היישום הנרחב של וקטור זה שימושי ידי הימנעות מיקור חוץ יקר של ייצור וירוס לחברות. פרוטוקול (מבוסס על התייחסות 1) מתאר את ייצור rAAV1 / 2 וקטורים chimeric המכילים חלבונים capsid משני קפסיד ההורים בבית יחס שווה 4. טיהור של וקטורים rAAV באמצעות קשירה עמודות הפרין מסתמך על הביטוי של חלבונים AAV2 capsid, אבל יכול להיות משולב עם קפסיד אחר מאשר AAV1 שתוארו כאן. בנוסף, AAV6 דווחה להיקשר הפרין, למרות עם זיקה מופחתת, שעלולים להיות מטוהרים עם עמודות הפרין באמצעות הליך זה 5,6. יצוין, עם זאת, כי קפסיד אחרים ידרוש ריכוזים שונים של NaCl עבור elution טור הפרין 5,7. אריזות הגנום rAAV הוצגה להיות אופטימלי בין 4.1 ו 4.9 kb עם ירידה חדה של יעילות האריזה עד 5.2 קילו 8. הגבלה זו אריזה יכול להיחשב החיסרון הגדול של המערכת rAAV, שכן סוג ספציפי תא תקנה הביטוי transgene מושגת בדרך כלל על ידי cis משחק גדול אלמנטים אשר לא ניתן לאכלס בתוך חלקיקי AAV קטן. כדי להתגבר על קבוצות כייל נמוך, כגון אלה הנובעים מנסה גנים החבילה שהם קרוב לגבול אריזה AAV אנחנו שילוב קבוצות ויראלי נפרד מרוכז כדי μl 250 לתוך אצווה 500 one μl, במקום להוסיף PBS כפי שמתואר בשלב 6.3. התמרה אמין תא מסוג מסוים יכולה להיות מושגת על ידי Cre נהג עכברים שילוב וקלטות rAAV מותנה (ראה להלן), כדי למנוע מתיחת גבול האריזה. יש לציין, בעוד פרוטוקול זה מנסה לספק קל לעקוב אחר ההוראות המופיעות על ייצור לא גבוההiter rAAV, זה דורש נוכחות של חלבון AAV2 moieties capsid לטיהור על ידי כרומטוגרפיה זיקה הפרין. קפסיד אחר מאשר AAV2 חייבים להיות מטוהרים באמצעות נהלים חלופיים 9. אחד היתרונות של טיהור טור הפרין הוא הוא האמין לייצר וקטורים AAV כי יש שיעור infectivity גדולים יותר מאלה המיוצרים באמצעות שיפוע צזיום כלוריד 10. עם זאת, ישנם גם מספר חסרונות לשיטה זו. לדוגמה, חלבונים אחרים הנקשרים הפרין עשוי גם להיות נוכח המניה ויראלי מטוהרים. בעוד של-כמיהות הפרין מטוהרים וקטורים יכול להיות מושפע titer וקטור 10, הגישה שלנו ממוקדת או 20 מעוררים או מעכבים נוירונים (איור 2) מעסיקה Cre-Induced ההפעלה הביטוי AAV בתיווך transgene והוא titre עצמאית. חלופה טיהור טור הפרין הוא השימוש שיפוע צפיפות iodixanol, אשר מייצרת titer ויראלי גבוה והכנת טהור יותר לשימוששיפוע צזיום כלוריד 10. שיטה זו יכולה גם להיות משולב עם טיהור טור הפרין לייצר וקטור גדול מ 99% טהור 11. לכן, שיקול דעת צריך לקחת על ידי קבוצות כמו אל הפרט באיזו שיטה לטיהור ויראלי הוא הטוב ביותר עבור יישום מסוים במורד הזרם שלהם. הבעיה הנפוצה ביותר הקשורים בפרוטוקול זה כייל הנגיף נמוכה. מניסיוננו זה בדרך כלל ניתן לייחס transfection יעילות נמוכה, או elution של הנגיף מן העמודות הפרין. כל החומרים transfection צריך להיות בטמפרטורת החדר לפני transfection ו transfections הבדיקה יש לבצע כדי למצוא את התנאים האופטימליים במעבדה כל אחד. שיטות אחרות של transfection, כגון lipofectamine, הם יעילים מאוד, אבל יכול להיות יקר. בנוסף, ריכוז ה-pH של פתרונות elution הפרין עמודה היא קריטית עבור elution מלאה של virions מ witho עמודות הפריןut נזק. נקודה חשובה נוספת היא כי התאים האריזה חייבת לדבוק גם אל פני השטח של הכלים בתרבית רקמה. אם התאים לנתק בשלב מסוים במהלך ההליך מומלץ להפסיק את הניסוי להפשיר בקבוקון חדש של תאים. במרחב ובזמן בקרת ביטוי transgene במכרסמים מושגת בקלות על ידי מיקוד אנטומי מדויק השלב ההתפתחותי של החיה. העברה יעילה AAV בתיווך גן הוכח ברחם 12,13. במוח הבוגר, באזור נגוע חלקיקים rAAV לאחר ההזרקה stereotaxic יכול להיות מותאם מאזורים ממוקדים קטנים מאוד, לאזורים הרבה יותר גדול לא רק על ידי שינויים כייל הנגיף אלא גם על ידי שינוי הפרמטרים של ההזרקה. אלה כוללים את נפח ומהירות זריקות הכללת mannitol polyol עם ההשעיה וירוס 14. Mannitol יכול לשמש גם כדי לשפר את זיהום של מגוון רחב של רקמות לאחר ההזרקה rAAV מערכתית 15 &lt;/ Sup&gt;. כושר האריזה של rAAV (כ 4.7 קילו) הוא כנראה הגורם המגביל ביותר במונחים של גנים יכול לבוא לידי ביטוי מתוך אלה וקטורים ויראליים. עם זאת, מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי ניתן להתגבר חלקית לתוך נפרד וקטורים rAAV ידי הגנים פיצול גדול או קלטות הביטוי מציגה רצף גישור, ייזום ביטוי גנים כאשר virions ידביק את התא אותו 16. רמות הביטוי של הגנים הנישאים על ידי וקטורים rAAV יכול להיות גם משפר באמצעות עצמית חינם וקטורים rAAV 17. הזרקת Stereotaxic של וקטורים rAAV מספק שיטה מהירה, זולה עוצמה גרימת ביטוי גנים באופן אזורים ספציפיים. בשילוב עם דור 2 nd אסטרטגיות התערבות RNA 18 rAAVs יכול לשמש גם עבור אזורים ספציפיים גנים להפיל. rAAVs יכול להיות משולב עם Cre-העכברים הטרנסגניים או תאים מסוג מסוים היזמים להשיג במעגל של התא מסוגספציפית ביטוי גנים, המתיר מניפולציות גנטיות עם רזולוציה מרחבית גבוהה 2,19-21, בעוד rAAVs הולם במערכת למשל ט &#39;מוסיפה לשלוט הזמני על הביטוי וירוס בתיווך גן 22,23. דוגמאות אלה ממחישות את הפוטנציאל העצום קומבינטורית של וקטורים אלו צופים גידול מהיר rAAV מבוססי מחקרים בשנים הבאות.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> Amicon מסננים צנטריפוגלי Ultra </td><td> Millipore </td><td> UFC810024 </td><td> 100,000 MWCO </td></tr><tr><td> Benzonase nuclease </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E1014 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbeco של הנשר שונה בינוני (DMEM) </td><td> Invitrogen </td><td> 10567014 </td><td> מוסף עם FCS 10% ו 10 יחידות / מ&quot;ל ​​penicillin/100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​סטרפטומיצין </td></tr><tr><td> Hek293 תאים </td><td> התרבות האמריקאית סוג אוסף </td><td> CRL-1573 </td><td> השתמש במעבר פחות מ 30 </td></tr><tr><td> HEPES שנאגרו מלוחים </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 51558 </td><td></td></tr><tr><td> HiTrap הפרין מחסנית </td><td> סיגמאאולדריץ </td><td> 54836 </td><td></td></tr><tr><td> שונה Iscove של Dulbecco של המדיום </td><td> Invitrogen </td><td> 12440-053 </td><td> מוסף עם FCS 5% </td></tr><tr><td> נתרן deoxycholate </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D5670 </td><td> הפוך את פתרון חדש עבור כל אצווה </td></tr><tr><td> 15 ס&quot;מ רקמות תרבות מנות </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 157150 </td><td></td></tr><tr><td> Stbl2 תאים המוסמכת </td><td> Invitrogen </td><td> 10268-019 </td><td></td></tr><tr><td> Virkon פתרון </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> NC9821357 </td><td> השאירו לחטא לילה לפני השלכת לניקוז </td></tr></tbody></table> טבלה 1. ריאגנטים ספציפיים הנדרשים פרוטוקול

production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors

בשנים האחרונות רקומביננטי adeno הקשורים וקטורים ויראליים (AAV) הפכו חשובים יותר ויותר עבור vivo במחקרים בבעלי חיים, והם גם כעת נבדק בניסויים קליניים בבני אדם. Wild-type AAV הוא חבר פתוגניים שאינם משפחת parvoviridae ו-לקוי מיסודו שכפול. הפרופיל התמרה רחבה, תגובה חיסונית נמוכה, כמו גם את הביטוי transgene חזקה מתמיד שהושגו עם וקטורים אלו הפכה אותם כלי פופולרי תכליתי עבור במבחנה משלוח גן vivo. rAAVs ניתן בקלות ובזול המיוצר במעבדה, המבוססת על פרופיל בטיחותי גבוה שלהם, מקבלים בדרך כלל סיווג בטיחות נמוכה. כאן, אנו מתארים שיטה לייצור ו titering של rAAVs כימרי המכיל את החלבונים capsid של שני AAV1 ו AAV2. השימוש של אלה הקרויים וקטורים chimeric משלבת את היתרונות של שני ההורים קפסיד כגון מניות titres גבוה (AAV1) וטיהורעל ידי כרומטוגרפיה זיקה (AAV2). אלה קפסיד AAV הם הטובים ביותר למד כל קפסיד AAV, ו בנפרד יש דפוס infectivity רחבה. וקטורים chimeric המתואר כאן צריך את המאפיינים זיהומיות של AAV1 ו AAV2 ולכן יכול להיות צפוי להדביק מגוון רחב של רקמות, כולל נוירונים, שריר שלד, לבלב, כליות ועוד. השיטה המתוארת כאן משתמש טיהור טור הפרין, שיטה האמין לתת titer ויראלי גבוה והכנת ויראלי נקי יותר שיטות טיהור אחרים, כגון צנטריפוגה דרך מפל צזיום כלוריד. בנוסף, אנו מתארים כיצד אלה וקטורים ניתן titered במהירות ובקלות לתת קריאה מדויקת של מספר חלקיקים זיהומיות מיוצר.

Watch this Scientific Journal Video about Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors at JoVE.com

Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors

רקומביננטי adeno הקשורים וירוס (rAAVs) וקטורים נעשים חשובים יותר ויותר עבור<em&gt; In vivo</em&gt; מחקרים בבעלי חיים. אנו מתארים כיצד rAAVs ניתן לייצר במעבדה וכיצד אלה יכולים להיות וקטורים titered לתת קריאה מדויקת של מספר חלקיקים זיהומיות מיוצר.

ייצור Titering של Adeno הקשורים ווקטורים רקומביננטי ויראלי

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently ...

production-and-titering-of-recombinant-adeno-associated-viral-vectors

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Recombinant Retroviral Production and Infection of B Cells

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control of a heterologous expression system to facilitate the analysis of the resulting phenotype. This approach can be used to express a gene that is not normally found in the organism, to express a mutant form of a gene product, or to over-express a dominant-negative form of the gene product. It is particularly useful in the study of the hematopoetic system, where transcriptional regulation is a major control mechanism in the development and differentiation of B cells 1, reviewed in 2-4.
Mouse genetics is a powerful tool for the study of human genes and diseases. A comparative analysis of the mouse and human genome reveals conservation of synteny in over 90% of the genome 5. Also, much of the technology used in mouse models is applicable to the study of human genes, for example, gene disruptions and allelic replacement 6. However, the creation of a transgenic mouse requires a great deal of resources of both a financial and technical nature. Several projects have begun to compile libraries of knock out mouse strains (KOMP, EUCOMM, NorCOMM) or mutagenesis induced strains (RIKEN), which require large-scale efforts and collaboration 7. Therefore, it is desirable to first study the phenotype of a desired gene in a cell culture model of primary cells before progressing to a mouse model. 
Retroviral DNA integrates into the host DNA, preferably within or near transcription units or CpG islands, resulting in stable and heritable expression of the packaged gene of interest while avoiding transcriptional silencing 8 9. The genes are then transcribed under the control of a high efficiency retroviral promoter, resulting in a high efficiency of transcription and protein production. Therefore, retroviral expression can be used with cells that are difficult to transfect, provided the cells are in an active state during mitosis. Because the structural genes of the virus are contained within the packaging cell line, the expression vectors used to clone the gene of interest contain no structural genes of the virus, which both eliminates the possibility of viral revertants and increases the safety of working with viral supernatants as no infectious virions are produced 10. 
Here we present a protocol for recombinant retroviral production and subsequent infection of splenic B cells. After isolation, the cultured splenic cells are stimulated with Th derived lymphokines and anti-CD40, which induces a burst of B cell proliferation and differentiation 11. This protocol is ideal for the study of events occurring late in B cell development and differentiation, as B cells are isolated from the spleen following initial hematopoetic events but prior to antigenic stimulation to induce plasmacytic differentiation.

An efficient system of structure and function analysis of a gene in an ex vivo culture of splenic B-lymphocytes is described. This method takes advantage of recombinant retroviral production in a helper free, ecotrophic packaging cell line. Stable, heritable expression of a gene of interest within primary lymphocytes is achieved leading to generation of surface antibodies on B cells undergoing class switch recombination.

רקומביננטי הפקה זיהום retroviral של תאים B

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control ...

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the generation of extreme population diversity that facilitates virus adaptation and evolution. Increasing evidence shows that the intrinsic error rates, and the resulting mutation frequencies, of RNA viruses can be modulated by subtle amino acid changes to the viral polymerase. Although biochemical assays exist for some viral RNA polymerases that permit quantitative measure of incorporation fidelity, here we describe a simple method of measuring mutation frequencies of RNA viruses that has proven to be as accurate as biochemical approaches in identifying fidelity altering mutations. The approach uses conventional virological and sequencing techniques that can be performed in most biology laboratories. Based on our experience with a number of different viruses, we have identified the key steps that must be optimized to increase the likelihood of isolating fidelity variants and generating data of statistical significance. The isolation and characterization of fidelity altering mutations can provide new insights into polymerase structure and function1-3. Furthermore, these fidelity variants can be useful tools in characterizing mechanisms of virus adaptation and evolution4-7.

The present article describes the steps required to isolate and characterize RNA polymerase fidelity variants of RNA viruses and how to use mutation frequency data to confirm fidelity changes in tissue culture.

בידוד של פידליטי גרסאות של וירוסים RNA ו אפיון תדירות המוטציה וירוס

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. Several downstream applications require large quantities of pure viral DNA, which is provided by this protocol. These applications include viral genome sequencing, where the removal of host DNA is crucial to optimize data output for viral sequences, and the production of new viral recombinant strains, where co-transfection of purified plasmid and linear viral DNA facilitates recombination.1,2,3 
This procedure utilizes a combination of extractions and density-based centrifugation to isolate purified linear herpesvirus nucleocapsid DNA from infected cells.4,5 The initial purification steps aim to isolate purified viral capsids, which contain and protect the viral DNA during the extractions and centrifugation steps that remove cellular proteins and DNA. Lysis of nucleocapsids then releases viral DNA, and two final phenol-chloroform steps remove remaining proteins. The final DNA captured from solution is highly concentrated and pure, with an average OD260/280 of 1.90. Depending on the quantity of infected cells used, yields of viral DNA range from 150-800 &mu;g or more. The purity of this DNA makes it stable during long-term storage at 4C. This DNA is thus ideally suited for high-throughput sequencing, high fidelity PCR reactions, and transfections. 
Prior to beginning the protocol, it is important to know the average number of cells per dish (e.g. an average of 8 x 106 PK-15 cells in a confluent 15 cm dish), and the titer of the viral stock to be used (e.g. 1 x 108 plaque-forming units per ml). These are necessary to calculate the appropriate multiplicity of infection (MOI) for the protocol.6 For instance, to infect one 15 cm dish of PK-15 cells with the above viral stock, at an MOI of 5, you would use 400 &mu;l of viral stock and dilute it with 3.6 ml of medium (total inoculation volume of 4 ml for one 15 cm plate).
Multiple viral DNA preparations can be prepared at the same time. The number of simultaneous preparations is limited only by the number of tubes held by the ultracentrifuge rotor (one per virus; see step 3.9 below). Here we describe the procedure as though being done for one virus.

We describe the process of isolating high purity herpesvirus nucleocapsid DNA from infected cells. The final DNA captured from solution is of high concentration and purity, making it ideally suited for high-throughput sequencing, high fidelity PCR reactions, and transfections to produce new viral recombinants.

ההכנה של ה-DNA ויראלי של Nucleocapsids

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. ...

Efficient Recombinant Parvovirus Production with the Help of Adenovirus-derived Systems

Rodent parvoviruses (PV) such as rat H-1PV and MVM, are small icosahedral, single stranded, DNA viruses. Their genome includes two promoters P4 and P38 which regulate the expression of non-structural (NS1 and NS2) and capsid proteins (VP1 and VP2) respectively1. They attract high interest as anticancer agents for their oncolytic and oncosuppressive abilities while being non-pathogenic for humans2. NS1 is the major effector of viral cytotoxicity3. In order to further enhance their natural antineoplastic activities, derivatives from these vectors have been generated by replacing the gene encoding for the capsid proteins with a therapeutic transgene (e.g. a cytotoxic polypeptide, cytokine, chemokine, tumour suppressor gene etc.)4. The recombinant parvoviruses (recPVs) vector retains the NS1/2 coding sequences and the PV genome telomeres which are necessary for viral DNA amplification and packaging. Production of recPVs occurs only in the producer cells (generally HEK293T), by co-transfecting the cells with a second vector (pCMV-VP) expressing the gene encoding for the VP proteins (Fig. 1)4. The recPV vectors generated in this way are replication defective. Although recPVs proved to possess enhanced oncotoxic activities with respect to the parental viruses from which they have been generated, their production remains a major challenge and strongly hampers the use of these agents in anti-cancer clinical applications.
We found that introduction of an Ad-5 derived vector containing the E2a, E4(orf6) and the VA RNA genes (e.g. pXX6 plasmid) into HEK293T improved the production of recPVs by more than 10 fold in comparison to other protocols in use. Based on this finding, we have constructed a novel Ad-VP-helper that contains the genomic adenoviral elements necessary to enhance recPVs production as well as the parvovirus VP gene unit5. The use of Ad-VP-helper, allows production of rec-PVs using a protocol that relies entirely on viral infection steps (as opposed to plasmid transfection), making possible the use of cell lines that are difficult to transfect (e.g. NB324K) (Fig. 2). We present a method that greatly improves the amount of recombinant virus produced, reducing both the production time and costs, without affecting the quality of the final product5. In addition, large scale production of recPV (in suspension cells and bioreactors) is now conceivable.

Here we describe a protocol based only on cell infection, which improves the efficiency of recombinant parvovirus production by more than 100 fold in comparison to other protocols in use. This protocol relies on the use of a novel adenovirus 5-based helper containing the parvovirus VP transcription unit (Ad-VP).

ייצור יעיל Parvovirus רקומביננטי בעזרת adenovirus הנגזרות מערכות

Rodent parvoviruses (PV) such as rat H-1PV and MVM, are small icosahedral, single stranded, DNA viruses. Their genome includes two promoters P4 and P38 ...

Engineering and Evolution of Synthetic Adeno-Associated Virus (AAV) Gene Therapy Vectors via DNA Family Shuffling

Adeno-associated viral (AAV) vectors represent some of the most potent and promising vehicles for therapeutic human gene transfer due to a unique combination of beneficial properties1. These include the apathogenicity of the underlying wildtype viruses and the highly advanced methodologies for production of high-titer, high-purity and clinical-grade recombinant vectors2. A further particular advantage of the AAV system over other viruses is the availability of a wealth of naturally occurring serotypes which differ in essential properties yet can all be easily engineered as vectors using a common protocol1,2. Moreover, a number of groups including our own have recently devised strategies to use these natural viruses as templates for the creation of synthetic vectors which either combine the assets of multiple input serotypes, or which enhance the properties of a single isolate. The respective technologies to achieve these goals are either DNA family shuffling3, i.e. fragmentation of various AAV capsid genes followed by their re-assembly based on partial homologies (typically &gt;80% for most AAV serotypes), or peptide display4,5, i.e. insertion of usually seven amino acids into an exposed loop of the viral capsid where the peptide ideally mediates re-targeting to a desired cell type. For maximum success, both methods are applied in a high-throughput fashion whereby the protocols are up-scaled to yield libraries of around one million distinct capsid variants. Each clone is then comprised of a unique combination of numerous parental viruses (DNA shuffling approach) or contains a distinctive peptide within the same viral backbone (peptide display approach). The subsequent final step is iterative selection of such a library on target cells in order to enrich for individual capsids fulfilling most or ideally all requirements of the selection process. The latter preferably combines positive pressure, such as growth on a certain cell type of interest, with negative selection, for instance elimination of all capsids reacting with anti-AAV antibodies. This combination increases chances that synthetic capsids surviving the selection match the needs of the given application in a manner that would probably not have been found in any naturally occurring AAV isolate. Here, we focus on the DNA family shuffling method as the theoretically and experimentally more challenging of the two technologies. We describe and demonstrate all essential steps for the generation and selection of shuffled AAV libraries (Fig. 1), and then discuss the pitfalls and critical aspects of the protocols that one needs to be aware of in order to succeed with molecular AAV evolution.

Engineering and Evolution of Synthetic Adeno-Associated Virus AAV Gene Therapy Vectors via DNA Family Shuffling

We demonstrate the basic technique to molecularly engineer and evolve synthetic Adeno-associated viral (AAV) gene therapy vectors via DNA family shuffling. Moreover, we provide general guidelines and representative examples for selection and analysis of individual chimeric capsids with enhanced properties on target cells in culture or in mice.

הנדסה האבולוציה של הנגיף Adeno הקשורים סינתטי (AAV) בריפוי גנטי באמצעות וקטור משפחת ה-DNA של גרירת רגליים

Adeno-associated viral (AAV) vectors represent some of the most potent and promising vehicles for therapeutic human gene transfer due to a unique ...

Production and Purification of Non Replicative Canine Adenovirus Type 2 Derived Vectors

Adenovirus (Ad) derived vectors have been widely used for short or long-term gene transfer, both for gene therapy and vaccine applications. Because of the frequent pre-existing immunity against the classically used human adenovirus type 5, canine adenovirus type 2 (CAV2) has been proposed as an alternative vector for human gene transfer. The well-characterized biology of CAV2, together with its ease of genetic manipulation, offer major advantages, notably for gene transfer into the central nervous system, or for inducing a wide range of protective immune responses, from humoral to cellular immunity. Nowadays, CAV2 represents one of the most appealing nonhuman adenovirus for use as a vaccine vector. This protocol describes a simple method to construct, produce and titer recombinant CAV2 vectors. After cloning the expression cassette of the gene of interest into a shuttle plasmid, the recombinant genomic plasmid is obtained by homologous recombination in the E. coli BJ5183 bacterial strain. The resulting genomic plasmid is then transfected into canine kidney cells expressing the complementing CAV2-E1 genes (DK-E1). A viral amplification enables the production of a large viral stock, which is purified by ultracentrifugation through cesium chloride gradients and desalted by dialysis. The resulting viral suspension routinely has a titer of over 1010 infectious particles per ml and can be directly administrated in vivo.

These past 15 years, canine adenovirus type 2 (CAV2)-derived vectors have proven their efficiency to transduce cells in vitro&#160;and in vivo and are widely used for vaccination and gene therapy. Here, we describe a procedure to construct, produce and purify CAV2 vectors, giving rise to high-titer viral suspensions.

Adenovirus (Ad) derived vectors have been widely used for short or long-term gene transfer, both for gene therapy and vaccine applications. Because of the ...

Dissecting Innate Immune Signaling in Viral Evasion of Cytokine Production

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. Conversely, viruses have evolved intricate strategies to evade and exploit host immune signaling for survival and propagation. Viral immune evasion, entailing host defense and viral evasion, provides one of the most fascinating and dynamic interfaces to discern the host-virus interaction. These studies advance our understanding in innate immune regulation and pave our way to develop novel antiviral therapies.
Murine &#947;HV68 is a natural pathogen of murine rodents. &#947;HV68 infection of mice provides a tractable small animal model to examine the antiviral response to human KSHV and EBV of which perturbation of in vivo virus-host interactions is not applicable. Here we describe a protocol to determine the antiviral cytokine production. This protocol can be adapted to other viruses and signaling pathways.
Recently, we have discovered that &#947;HV68 hijacks MAVS and IKK&#946;, key innate immune signaling components downstream of the cytosolic RIG-I and MDA5, to abrogate NF&#922;B activation and antiviral cytokine production. Specifically, &#947;HV68 infection activates IKK&#946; and that activated IKK&#946; phosphorylates RelA to accelerate RelA degradation. As such, &#947;HV68 efficiently uncouples NF&#922;B activation from its upstream activated IKK&#946;, negating antiviral cytokine gene expression. This study elucidates an intricate strategy whereby the upstream innate immune activation is intercepted by a viral pathogen to nullify the immediate downstream transcriptional activation and evade antiviral cytokine production.

We describe a protocol to measure the antiviral cytokine production in mice infected with a model herpesvirus, murine gamma herpesvirus 68 (&#947;HV68) that is closely-related to human Kaposi&#8217;s sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) and Epstein-Barr virus (EBV). Utilizing genetically modified mouse strains and mouse embryonic fibroblasts (MEFs), we assessed the antiviral cytokine production both in vivo and ex vivo. &#8220;Reconstituting&#8221; the expression of innate immune components in knockout embryonic fibroblasts by lentiviral transduction, we further pinpoint specific innate immune molecules and dissect the key signaling events that differentially regulate the antiviral cytokine production.

הביתור מולדת איתות חיסון בהתחמקות ויראלי של ציטוקין ייצור

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. burnetii DNA in cell cultures and clinical samples. PCR requires specialized equipment and extensive end user training, and therefore, it is not suitable for routine work especially in a resource-constrained area. We have developed a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay to detect the presence of C. burnetii in patient samples. This method is performed at a single temperature around 60 &#176;C in a water bath or heating block. The sensitivity of this LAMP assay is very similar to PCR with a detection limit of about 25 copies per reaction. This report describes the preparation of the reaction using lyophilized reagents and visualization of results using hydroxynaphthol blue (HNB) or a UV lamp with fluorescent intercalating dye in the reaction. The LAMP reagents were lyophilized and stored at room temperature (RT) for one month without loss of detection sensitivity. This LAMP assay is particularly robust because the reaction mixture preparation does not involve complex steps. This method is ideal for use in resource-limited settings where Q fever is endemic.

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

We described here a simple loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method using lyophilized reagents for the detection of C. burnetii in patient samples.

התפתחות Lyophilized Loop בתיווך ריאגנטים הגברה איזו תרמים לצורך זיהוי של<em&gt; Burnetii Coxiella</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional methods to measure NA inhibiting (NI) antibody titers are not practical for routine serology. This protocol describes the enzyme-linked lectin assay (ELLA), a practical alternative method to measure NI titers that is performed in 96 well plates coated with a large glycoprotein substrate, fetuin. NA cleaves terminal sialic acids from fetuin, exposing the penultimate sugar, galactose. Peanut agglutinin (PNA) is a lectin with specificity for galactose and therefore the extent of desialylation can be quantified using a PNA-horseradish peroxidase conjugate, followed by addition of a chromogenic peroxidase substrate. The optical density that is measured is proportional to NA activity. To measure NI antibody titers, serial dilutions of sera are incubated at 37 &#176;C O/N on fetuin-coated plates with a fixed amount of NA. The reciprocal of the highest serum dilution that results in &#8805;50% inhibition of NA activity is designated as the NI antibody titer. The ELLA provides a practical format for routine evaluation of human antibody responses following influenza infection or vaccination.

We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.

מדידת טיטר נוגדנים עיכוב Neuraminidase שפעת ידי enzyme-linked Assay לקטינים

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the person-to-person route or indirectly through environmental surfaces or food, contaminated fomites and inanimate surfaces are important vehicles for the spread of the virus during norovirus outbreaks.
We developed and evaluated a protocol using macrofoam swabs for the detection and typing of human noroviruses from hard surfaces. Compared with fiber-tipped swabs or antistatic wipes, macrofoam swabs allow virus recovery (range 1.2-33.6%) from toilet seat surfaces of up to 700 cm2. The protocol includes steps for the extraction of the virus from the swabs and further concentration of the viral RNA using spin columns. In total, 127 (58.5%) of 217 swab samples that had been collected from surfaces in cruise ships and long-term care facilities where norovirus gastroenteritis had been reported tested positive for GII norovirus by RT-qPCR. Of these 29 (22.8%) could be successfully genotyped. In conclusion, detection of norovirus on environmental surfaces using the protocol we developed may assist in determining the level of environmental contamination during outbreaks as well as detection of virus when clinical samples are not available; it may also facilitate monitoring of effectiveness of remediation strategies.

A macrofoam based sampling methodology was developed and evaluated for the detection and quantification of norovirus on environmental hard surfaces.

שיטת הדגימה ספוגית לצורך זיהוי של norovirus האדם על משטחים

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...