Name: production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors
Uploaded: 2011-11-27T14:00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors at JoVE.com

См. рисунок 1 для иллюстрации обобщения следующий протокол. Безопасность Примечание: Все материалы, которые были в контакте с собранном вирусных частиц необходимо дезинфицировать раствором Virkon или других подходящих дезинфицирующих средств. 1. Подготовка запасов плазмида ДНК (~ 2 дня) <ol><li> Следующие плазмиды требуется 1: <ul><li> pRV1 - содержащие AAV2 Rep и Кап последовательности </li><li> pH21 - содержащие AAV1 Rep и Кап последовательности </li><li> pFdelta6 - аденовирус-хелперов плазмиды </li><li> AAV плазмиды, содержащей рекомбинантный кассеты выражение окружении AAV2 упаковки сигналы (в виде перевернутого концевых повторов, РМЭ) </li></ul></li><li> Хотя pFdelta6 должны быть выращены в Stbl2 компетентных клеток, чтобы предотвратить частичное удаление, pRV1 и pH21 могут быть выращены в DH5alpha компетентных клеток. AAV плазмиды могут быть выращены в Stbl2 клеток, если частичное удаление происходят в клетках DH5alpha. </li><li>ДНК плазмиды должны быть высокого качества и свободным от загрязнений РНК. Плазмиды могут быть проверены на целостность, используя следующий дайджестов: <ul><li> pRV1 - дайджест с XbaI дать полосы 7,5 кб и 3,8 кб </li><li> pH21 - дайджест с EcoRI дать полосы 4,5 кб, 2,8 кб и 0,2 кб </li><li> pFdelta6 - дайджест с HindIII дать полосы 5,5 кб, 3 кб, 3 кб, 2,3 кб и 1,5 кб </li></ul></li></ol> 2. Подготовка человеческих эмбриональных клетках почек 293 (HEK293) для трансфекции (2 - 3 дней) <ol><li> Пластина два 80% сливной 150 см 2 колбы НЕК293 на пять 15 см в диаметре блюда Nunc тканевой культуры. Клетки должны быть 70 - 80% сливной до трансфекции (примерно через 48 часов после покрытия). Культуры клеток в изменение стандартного Eagle Дульбекко среде (DMEM) с низким уровнем глюкозы, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 100 Ед / мл пенициллина / 100 мкг / мл стрептомицина. </li><li> За 3 часа до трансфекции удалить DMEM и заменить Айскоув&quot;Среды с изменение Дульбеко (IMDM), содержащий 5% эмбриональной телячьей сыворотки. </li></ol> 3. Трансфекция вирусных плазмид (~ 1 час для трансфекции, 3 дня инкубации) <ol><li> Подготовка следующих за одну партию (5 х 15 см пластины культуре ткани) вируса: <ul><li> 62,5 мкг плазмиды AAV </li><li> 125 мкг pFdelta6 </li><li> 31,25 мкг pRV1 </li><li> 31,25 мкг pH21 </li><li> 1650 мкл 2,5 М CaCl 2 </li><li> 12 мл дН 2 O </li></ul></li><li> В классе 2 культуре ткани капот стерильный фильтр трансфекции смесь в 50 мл трубки. </li><li> В то время вортексе решение, быстро добавить 13 мл 2 HEPES х буферном растворе (рН = 7,05). Замените крышку 50 мл трубку и продолжают вихрь в течение 15 секунд. Оставить постоять в течение 1 минуты 45 секунд, мелкий белый осадок должен форме. </li><li> Аккуратно добавить 5 мл трансфекции раствора в каждую 15 см блюдо культуры ткани. Swirl пластин для смешивания и вернуться в инкубаторе. </li><li> 16 часов после трансфекции удалить IMDM средних и заменить DMEM. </li></ol> 4. Лизирующий клеток и уборки rAAVs (2 часа) <ol><li> Через 72 часа после трансфекции, удалить СМИ из пластин культуре клеток и выбросьте. Все отходы следует относиться с решением Virkon или других подходящих дезинфицирующих средств. </li><li> Осторожно промыть клетки в теплой 1x фосфатным буферным раствором (PBS, рН 7,4). </li><li> Добавить 25 мл теплой PBS в каждую тарелку и аккуратно удалить соты с ячейкой скребком. Сбор суспензии в 50 мл пробирки. </li><li> Гранул клетки при 800 мкг в течение 10 минут. </li><li> Удалите супернатант и ресуспендируют осадок в 150 мМ NaCl, 20 мМ Трис рН 8,0, использовать 10 мл на ткани пластины культуры. Разделение на две 50 мл пробирки. </li><li> Подготовка свежий раствор 10% натрия дезоксихолата в дН 2 O. Добавить 1,25 мл этого в каждую пробирку для конечной концентрации 0,5%. Добавить benzonase нуклеазы до конечной концентрации 50 единиц на мл. Смешайте трубки тщательно. </li><lя&gt; Инкубировать при 37 ° С в течение 1 часа. </li><li> Удалить распада клеток путем центрифугирования при 3000 мкг в течение 15 минут. Трансфер в свежем 50 мл трубки, убедитесь, что все ячейки мусор был удален, чтобы предотвратить блокирование гепарин столбцов (см. шаг 5). На этом этапе образцы могут храниться при температуре -20 ° C, прежде чем продолжить. У нас хранятся образцы в течение нескольких недель при температуре -20 ° С без снижения инфективности. </li></ol> 5. Гепарин очистки колонке rAAVs (2 - 3 часа) <ol><li> Установка HiTrap гепарин столбцов с помощью перистальтического насоса так, что решения проходят через колонку на 1 мл в минуту для шагов 5,2 до 5,4. Важно, чтобы убедиться в отсутствии пузырьков воздуха вводятся в колонку гепарин. </li><li> Равновесие колонку с 10 мл 150 мМ NaCl, 20 мМ Трис, рН 8,0. </li><li> Применить 50 мл вируса решение колонки и дать течь через. </li><li> Промыть колонку с 20 мл 100 мМ NaCl, 20 мМ Трис, рН 8,0. </li><li> Использование 5 мл шприц продолжают мыть колонке Wго по 1 мл 200 мМ NaCl, 20 мМ Трис, рН 8,0, затем по 1 мл 300 мМ NaCl, 20 мМ Трис, рН 8,0. Отменить проточные. </li><li> Использование 5 мл шприцев и нежный элюировать давление вируса из колонки, применяя: <ul><li> 1,5 мл 400 мМ NaCl, 20 мМ Трис, рН 8,0 </li><li> 3,0 мл 450 мМ NaCl, 20 мМ Трис, рН 8,0 </li><li> 1,5 мл 500 мМ NaCl, 20 мМ Трис, рН 8,0 </li><li> Сбор этих в 15 мл центрифужную пробирку. </li></ul></li></ol> 6. Концентрация и стерильной фильтрации rAAVs (1 час) <ol><li> Концентрат вектора, используя Amicon ультра-4 центробежного фильтра с единицы 100000 молекулярного веса отсечки. Нагрузка 4 мл элюата колонки в концентратор и центрифуге при 2000 мкг в течение 2 минут (при комнатной температуре). Отменить flowthrough и перезагрузите концентратор с оставшийся раствор вируса и повторить центрифугирования. Концентрированный объем должен быть примерно 250 мкл. Если концентрированный объем значительно больше, чем это, отказаться от потока тhrough и продолжают центрифуги в минуту действия, пока объем составляет примерно 250 мкл. </li><li> Добавить 250 мкл PBS, чтобы вирус для конечного объема 500 мкл и удалить из концентратора. </li><li> Фильтры вектора через 13 мм диаметром 0,2 мкм фильтр шприца. Векторные должны быть аликвоты и хранили при температуре -80 ° C до требуется. </li></ol> 7. Titering вирусных акций (3 дня) Для этого требуется промоутер, который является активным в НЕК293 вождения гена репортера или immunocytochemically обнаружить генный продукт. При производстве вектор, который не совместим с НЕК293 других клеточных линий или первичных культур клеток могут быть использованы. <ol><li> Подготовка 18 поли-L-лизин покрытием покровные стекла или 18 скважин слайдов Nunc камеры путем посева НЕК293, чтобы они были 40 - 50% вырожденная. Для титрования Cre-зависимых rAAVs использовать НЕК293, что стабильно выразить Cre рекомбиназы 2. </li><li> Infect каждой лунки с серийными гilutions из AAV вектор (рис. 2A). Используйте 3 скважин в разведении. Мы регулярно добавлять вирус непосредственно в каждую лунку. </li><li> После 72 часов исправить HEK293, добавив равный объем 4% параформальдегида (PFA) и средних (предоставление конечной концентрации 2% PFA) в течение десяти минут при комнатной температуре. </li><li> Вымойте ячейки три раза PBS, промыть в дН 2 O и покровное. </li><li> Подсчитайте количество трансдуцированных клеток из трех скважин, которые имеют высокий коэффициент разбавления, но по-прежнему содержат инфицированные клетки, найти среднее значение этих и умножить на коэффициент разбавления, чтобы дать число инфекционных единиц на микролитр (рис. 2В). </li></ol> 8. Ожидаемые результаты НЕК293 трансдуцированных с вирусом кодирование расширенной зеленого флуоресцентного белка (EGFP) показаны на рисунке 2B. Как правило, мы добиться согласованных титры примерно 6 х 10 6 инфекционных частиц в микро-литра. Мы регулярно использовать эти векторы для стереотаксической Инджеction на взрослом мозге грызунов. Это обеспечивает мощную технику для конкретного региона экспрессии генов 2. Для объединения этого региона с специфика камерного типа селективной экспрессии генов мы вводим Cre рекомбиназы-зависимых rAAVs в целевых регионах Cre-трансгенных мышей 2. Рис 2С-Е приведены примеры стереотаксической инъекции Cre-зависимых rAAVs кодирования EGFP в различных регионах мозга взрослого парвальбумина-Cre трансгенных мышах 3. <img alt="Рисунок 1" src="/files/ftp_upload/3348/3348fig1.jpg" /> Рисунок 1. Схематическое изображение протокол для производства rAAV. 1.) НЕК293 высевают и выросли до 70 - 80% слияния. 2.) AAV и помощником плазмид готовятся и трансфицировали в НЕК293. 3.) Средний изменяется обратно на DMEM 16 часов после трансфекции и HEK293 клетки культивировали в течение еще 56 часов. 4.) HEK293 клетки собирают и разрушается. rAAV векторов отделены от клетки мусора на сentrifugation. 5.) Вирусные частицы очищаются через гепарин колонки, прежде концентрации и стерилизации. 6.) HEK293 клетки, выращенные на 24 луночных планшетах и ​​заразить серийные разведения вектора AAV, чтобы определить число инфекционных единиц. <img alt="Рисунок 2" src="/files/ftp_upload/3348/3348fig2.jpg" /> Рисунок 2. Titering и в естественных условиях применения rAAV1 / 2. (А) Настройка НЕК293 для измерения вирусного титра. HEK293 клетки трансдуцированных с серийные разведения rAAVs. С неинфицированных контроль, N 1 мкл неразбавленного вирусных акций. (B) HEK293 клетки, инфицированные rAAVs выражения EGFP. (CE) Вирусный выражение EGFP ограничивается Cre-экспрессирующих нейронов в различных регионах цель парвальбумина-Cre трансгенных мышей после стереотаксической инъекции Cre активированных rAAVs. Примеры изображения показывают GFP иммунореактивности в (С) бледного таламус и ретикулярную глобус, (D) зубчатой ​​извилине и (Е) СА1 области гиппокампа. Д.Г., де-ntate извилины; РТ, ретикулярные ядра таламуса; Г.П., бледного шара. Шкала бары: В, 500 мкм, C, 100 мкм, D, 100 мкм, Е, 500 мкм.

<ol>
	<li>Klugmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV-mediated+hippocampal+expression+of+short+and+long+Homer+1+proteins+differentially+affect+cognition+and+seizure+activity+in+adult+rats.">AAV-mediated hippocampal expression of short and long Homer 1 proteins differentially affect cognition and seizure activity in adult rats.</a> Molecular and Cellular Neurosciences. 28, 347-360 (2005).</li><li>Murray, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parvalbumin-positive+CA1+interneurons+are+required+for+spatial+working+but+not+for+reference+memory.">Parvalbumin-positive CA1 interneurons are required for spatial working but not for reference memory.</a> Nature Neuroscience. 14, 297-299 (2011).</li><li>Hippenmeyer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+developmental+switch+in+the+response+of+DRG+neurons+to+ETS+transcription+factor+signaling.">A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling.</a> PLoS Biology. 3, e159-e159 (2005).</li><li>Hauck, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+characterization+of+chimeric+recombinant+AAV+vectors.">Generation and characterization of chimeric recombinant AAV vectors.</a> Molecular Therapy. 7, 419-425 (2003).</li><li>Halbert, C. L., Allen, J. M., Miller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+type+6+(AAV6)+vectors+mediate+efficient+transduction+of+airway+epithelial+cells+in+mouse+lungs+compared+to+that+of+AAV2+vectors.">Adeno-associated virus type 6 (AAV6) vectors mediate efficient transduction of airway epithelial cells in mouse lungs compared to that of AAV2 vectors.</a> Journal of Virology. 75, 6615-6615 (2001).</li><li>Blankinship, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transduction+of+skeletal+muscle+using+vectors+based+on+adeno-associated+virus+serotype+6.">Efficient transduction of skeletal muscle using vectors based on adeno-associated virus serotype 6.</a> Molecular Therapy. 10, 671-678 (2004).</li><li>Wu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+amino+acid+changes+can+influence+titer,+heparin+binding,+and+tissue+tropism+in+different+adeno-associated+virus+serotypes.">Single amino acid changes can influence titer, heparin binding, and tissue tropism in different adeno-associated virus serotypes.</a> Journal of Virology. 80, 11393-11397 (2006).</li><li>Dong, J. Y., Fan, P. D., Frizzell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+the+packaging+capacity+of+recombinant+adeno-associated+virus.">Quantitative analysis of the packaging capacity of recombinant adeno-associated virus.</a> Human gene therapy. 7, 2101-2112 (1996).</li><li>Zolotukhin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+purification+of+serotype+1,+2,+and+5+recombinant+adeno-associated+viral+vectors.">Production and purification of serotype 1, 2, and 5 recombinant adeno-associated viral vectors.</a> Methods. 1, 158-167 (2002).</li><li>Burova, E., Loffe, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatographic+purification+of+recombinant+adenoviral+and+adeno-associated+viral+vectors:+methods+and+implications.">Chromatographic purification of recombinant adenoviral and adeno-associated viral vectors: methods and implications.</a> Gene Therapy. 12, 5-17 (2005).</li><li>Zolotukhin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+adeno-associated+virus+purification+using+novel+methods+improves+infectious+titer+and+yield.">Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield.</a> Gene Therapy. 6, 973-985 (1999).</li><li>Bilbao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+gene+expression+from+in+utero+delivery+of+adenoviral-associated+vector+serotype+1.">Patterns of gene expression from in utero delivery of adenoviral-associated vector serotype 1.</a> Human Gene Therapy. 16, 678-684 (2005).</li><li>Pilpel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=reproducible+transduction+of+select+forebrain+regions+by+targeted+recombinant+virus+injection+into+the+neonatal+mouse+brain.">reproducible transduction of select forebrain regions by targeted recombinant virus injection into the neonatal mouse brain.</a> Journal of Neuroscience Methods. 182, 55-63 (2009).</li><li>Mastakov, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+injection+of+rAAV+with+mannitol+enhances+gene+expression+in+the+rat+brain.">Combined injection of rAAV with mannitol enhances gene expression in the rat brain.</a> Molecular Therapy. 3, 225-232 (2001).</li><li>Fu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-complementary+adeno-associated+virus+serotype+2+vector:+global+distribution+and+broad+dispersion+of+AAV-mediated+transgene+expression+in+mouse+brain.">Self-complementary adeno-associated virus serotype 2 vector: global distribution and broad dispersion of AAV-mediated transgene expression in mouse brain.</a> Molecular Therapy. 8, 911-917 (2003).</li><li>Ghosh, A., Yue, Y., Duan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Transgene+Reconstitution+with+Hybrid+Dual+AAV+Vectors+Carrying+the+Minimized+Bridging+Sequences.">Efficient Transgene Reconstitution with Hybrid Dual AAV Vectors Carrying the Minimized Bridging Sequences.</a> Human Gene Therapy. 22, 77-83 (2011).</li><li>McCarty, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-complementary+AAV+vectors;+advances+and+applications.">Self-complementary AAV vectors; advances and applications.</a> Molecular Therapy. 16, 1648-1656 (2008).</li><li>Georgiadis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV-mediated+knockdown+of+peripherin-2+in+vivo+using+miRNA-based+hairpins.">AAV-mediated knockdown of peripherin-2 in vivo using miRNA-based hairpins.</a> Gene Therapy. 17, 486-493 (2010).</li><li>Atasoy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FLEX+switch+targets+Channelrhodopsin-2+to+multiple+cell+types+for+imaging+and+long-range+circuit+mapping.">A FLEX switch targets Channelrhodopsin-2 to multiple cell types for imaging and long-range circuit mapping.</a> The Journal of Neuroscience. 28, 7025-7030 (2008).</li><li>Guggenhuber, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV+Vector-Mediated+Overexpression+of+CB1+Cannabinoid+Receptor+in+Pyramidal+Neurons+of+the+Hippocampus+Protects+against+Seizure-Induced+Excitoxicity.">AAV Vector-Mediated Overexpression of CB1 Cannabinoid Receptor in Pyramidal Neurons of the Hippocampus Protects against Seizure-Induced Excitoxicity.</a> PLoS One. 5, e15707-e15707 (2010).</li><li>Lawlor, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+delivery+and+selective+transduction+of+glial+cells+in+the+mammalian+brain+by+AAV+serotypes+isolated+from+nonhuman+primates.">Efficient gene delivery and selective transduction of glial cells in the mammalian brain by AAV serotypes isolated from nonhuman primates.</a> Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 17, 1692-1702 (2009).</li><li>Chtarto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetracycline-inducible+transgene+expression+mediated+by+a+single+AAV+vector.">Tetracycline-inducible transgene expression mediated by a single AAV vector.</a> Gene Therapy. 10, 84-94 (2003).</li><li>Han, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+humoral+immune+response+to+the+tetracycline+(Tet)+activator+in+rats+injected+intracranially+with+Tet-off+rAAV+vectors.">Lack of humoral immune response to the tetracycline (Tet) activator in rats injected intracranially with Tet-off rAAV vectors.</a> Gene Therapy. 17, 616-625 (2010).</li></ol>

Нет конфликта интересов объявлены.

rAAV векторы становятся все более ценными для прижизненного исследования на животных. Здесь мы описали простой и недорогой протокол для производства rAAVs, которые могут способствовать широкому применению этого полезного вектор, избегая дорогостоящих услуг сторонних вируса продукции компании. Протокол (на основе справочных 1) описывает производство химерных rAAV1 / 2 векторов, содержащих белки капсида от обоих родительских серотипов при равном соотношении 4. Очистка rAAV векторов путем связывания с гепарином колонн опирается на выражение AAV2 капсид белков, но могут быть объединены с другими серотипами, чем AAV1 изложены здесь. Кроме того, AAV6, как сообщается, связываться с гепарином, хотя и с пониженным сродством, и потенциально может быть очищен с гепарином столбцов с помощью этой процедуры 5,6. Следует отметить, однако, что другие серотипы потребует различных концентраций NaCl для элюирования колонки гепарин 5,7. Упаковка rAAV геномов было показано, что оптимальное между 4,1 и 4,9 кб с резким сокращением в упаковке КПД до 5,2 кб 8. Эта упаковка предел может считаться крупнейшим недостатком системы rAAV, так как тип клеток-специфического регулирования экспрессии трансгена обычно достигается за счет большого цис-действующих элементов, которые не могут быть удовлетворены за счет мелких частиц AAV. Чтобы преодолеть низкий титр партий, например, в результате попытки пакета генов, которые близки к пределу AAV упаковки мы объединяем отдельные вирусные партиях сосредоточено до 250 мкл в 500 мкл одна партия, а не добавлять PBS как указано в пункте 6.3. Надежная камерного типа конкретных трансдукции может быть достигнуто за счет Cre-драйвера мыши и условных кассеты rAAV (см. ниже), чтобы избежать растяжения упаковки предела. Следует отметить, что в то время как этот протокол попытки обеспечить легкий в следуйте инструкциям на производство высококачественных тИТЭР rAAV, он требует наличия AAV2 капсида фрагментов белка для очистки гепарин аффинной хроматографии. Серотипов, кроме AAV2 должна быть очищена с помощью альтернативных процедур 9. Одним из преимуществ гепарин очистки столбец считается, производить AAV векторов, которые имеют большую инфекционности темпами, чем, полученной с использованием градиента цезия хлорид 10. Тем не менее, Есть также некоторые недостатки этого метода. Например, другие белки, которые связывают гепарин может также присутствовать в очищенной вирусной акции. Хотя тропизм гепарин-очищенных векторы могут влиять на вектор титр 10, наш подход к конкретно нацелены либо возбуждающих 20 или тормозных нейронов (рис. 2) работает Cre-индуцированной активации AAV-опосредованной экспрессии трансгена и титр-независимыми. Альтернативу гепарину очистки колонка использование iodixanol градиента плотности, которая производит более высокий титр вирусных и чище, чем подготовка использованиецезия градиентом хлорида 10. Этот метод может также сочетаться с гепарином очистки колонке для получения вектора, который больше, чем 99% чистого 11. Таким образом, серьезное внимание должны быть приняты отдельными группами, какие вирусные метод очистки лучше всего подходит для их конкретных приложений вниз по течению. Наиболее распространенные проблемы, связанные с этим протоколом низкий вирусный титр. По нашему опыту это, как правило, восходят к низкой эффективности трансфекции, или элюирования вируса из гепарин столбцов. Все трансфекции материалы должны быть при комнатной температуре до трансфекции, и проверить трансфекции должны быть выполнены, чтобы найти оптимальные условия в каждой лаборатории. Другие методы трансфекции, таких как lipofectamine, отличаются высокой эффективностью, но может быть слишком дорого. Кроме того, концентрации и рН гепарин решения элюирования колонка имеет решающее значение для полного вымывания вирионов из гепарина witho столбцовут повреждения. Еще одним важным моментом является то, что упаковка клетки должны хорошо прилипают к поверхности блюда тканевой культуры. Если клетки отделяются на определенном этапе во время процедуры рекомендуется прекратить эксперимент и размораживания новый флакон клеток. Пространственно-временной контроль экспрессии трансгена у грызунов легко достигается точной ориентации анатомических и стадии развития животного. Эффективное AAV-опосредованного переноса генов было показано внутриутробно 12,13. Во взрослом мозге, площадь инфицированных rAAV частиц после стереотаксической инъекции можно регулировать от очень маленьких целевых регионах, гораздо больших площадях не только изменениями в вирусном титре, но и путем изменения параметров впрыска. К ним относятся объем и скорость инъекции, а также включение полиола маннитол с вирусной суспензии 14. Маннитол также может быть использован для повышения заражения различных тканей после системной инъекции rAAV 15 &lt;/ SUP&gt;. Упаковке мощностью rAAV (примерно 4,7 кб), вероятно, наиболее ограничивающим фактором с точки зрения генов, которые могут быть выражены в этих вирусных векторов. Однако, недавние исследования показали, что это может быть частично преодолены путем расщепления больших генов или выражение кассеты на отдельные векторы rAAV и введение моста последовательности, инициируя экспрессию генов, когда вирионы заразить той же клетке 16. Выражение уровне генов, переносимых насекомыми, rAAV также может быть значительно повышена с помощью самостоятельного бесплатный rAAV векторов 17. Стереотаксической инъекции векторов rAAV обеспечивает быстрый, недорогой и мощный метод для стимуляции экспрессии генов в регионе имеет свои особенности. В сочетании с 2-го поколения стратегии РНК-интерференции 18 rAAVs также может быть использован для конкретного региона генов сбить. rAAVs могут быть объединены с Cre-трансгенных мышей или камерного типа конкретных промоутеров для достижения схемы и камерного типа-Специфическая экспрессия генов, позволяющих генетические манипуляции с высоким пространственным разрешением 2,19-21, при монтаже rAAVs, например, с системой тет добавляет временной контроль над вирусом-опосредованной экспрессии генов 22,23. Эти примеры иллюстрируют огромное комбинаторное потенциал этих векторов и прогнозировать быстрый рост rAAV основе исследований за долгие годы.

<table border="1"><tbody><tr><td> Название реагента </td><td> Компания </td><td> Номер по каталогу </td><td> Комментарии </td></tr><tr><td> Amicon Ультра центробежные фильтры </td><td> Millipore </td><td> UFC810024 </td><td> 100000 MWCO </td></tr><tr><td> Benzonase нуклеазы </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E1014 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbeco в модификации Eagle среды (DMEM) </td><td> Invitrogen </td><td> 10567014 </td><td> Дополнение с 10% FCS и 10 ед / мл penicillin/100 мкг / мл стрептомицина </td></tr><tr><td> НЕК293 </td><td> Американский тип культуры коллекцию </td><td> CRL-1573 </td><td> Использование при прохождении менее 30 </td></tr><tr><td> HEPES буферном растворе </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 51558 </td><td></td></tr><tr><td> HiTrap Гепарин картридж </td><td> Сигма-Aldrich </td><td> 54836 </td><td></td></tr><tr><td> Искова изменение Дульбекко среда </td><td> Invitrogen </td><td> 12440-053 </td><td> Дополнение с 5% FCS </td></tr><tr><td> Натрий дезоксихолата </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D5670 </td><td> Сделайте свежие решения для каждой партии </td></tr><tr><td> 15 см блюда культуры ткани </td><td> Fisher Scientific </td><td> 157150 </td><td></td></tr><tr><td> Stbl2 компетентных клеток </td><td> Invitrogen </td><td> 10268-019 </td><td></td></tr><tr><td> Virkon решение </td><td> Fisher Scientific </td><td> NC9821357 </td><td> Оставьте для дезинфекции ночь, прежде чем выбросить стечь </td></tr></tbody></table> Таблица 1. Конкретные реагенты, необходимые для протокола

production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors

В последние годы рекомбинантный адено-ассоциированные вирусные векторы (AAV) становятся все более ценными для прижизненного исследования на животных, а также в настоящее время проходит испытания в клинические испытания на человеке. Дикого типа AAV является непатогенных члена семьи parvoviridae и по своей сути репликации с дефицитом. Широкого профиля трансдукции, низкий иммунный ответ, а также сильных и устойчивых экспрессии трансгена достигнуты с этими векторами сделало их популярными и универсальный инструмент для в пробирке и в естественных условиях доставки гена. rAAVs можно легко и дешево производится в лаборатории, и, основываясь на их благоприятный профиль безопасности, которые обычно предоставляются низкой классификации безопасности. Здесь мы опишем метод производства и titering химерных rAAVs содержащие белки капсида, так и AAV1 AAV2. Использование этих так называемых химерного вектора сочетает в себе преимущества обоих родительских серотипов, таких как высокие запасы титры (AAV1) и очисткис помощью аффинной хроматографии (AAV2). Эти AAV серотипов являются наиболее изученным из всех серотипов AAV, и в индивидуальном порядке имеют широкую картину инфекционности. Химерного вектора, описанные здесь, должны иметь инфекционные свойства AAV1 и AAV2 и, таким образом, можно ожидать, чтобы заразить широкий спектр тканей, включая нейроны, скелетных мышцах, поджелудочной железы, почек и других. Метод, описанный здесь используется гепарин очистки колонки, метод считается, дают более высокий титр вирусных и чище вирусных подготовки, чем другие методы очистки, такие как центрифугирование через цезия градиентом хлорида. Кроме того, мы опишем, как эти векторы могут быть быстро и легко оттитрованы, чтобы дать точное считывание количества инфекционных частиц.

Watch this Scientific Journal Video about Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors at JoVE.com

Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors

Рекомбинантный адено-связанный вирус (rAAVs) векторов, становятся все более ценными для<em&gt; В естественных условиях</em&gt; Исследования на животных. Мы опишем, как rAAVs могут быть произведены в лаборатории, и как эти векторы могут быть оттитрованы, чтобы дать точное считывание количества инфекционных частиц.

Производство и Titering рекомбинантных адено-ассоциированные вирусные векторы

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently ...

production-and-titering-of-recombinant-adeno-associated-viral-vectors

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Recombinant Retroviral Production and Infection of B Cells

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control of a heterologous expression system to facilitate the analysis of the resulting phenotype. This approach can be used to express a gene that is not normally found in the organism, to express a mutant form of a gene product, or to over-express a dominant-negative form of the gene product. It is particularly useful in the study of the hematopoetic system, where transcriptional regulation is a major control mechanism in the development and differentiation of B cells 1, reviewed in 2-4.
Mouse genetics is a powerful tool for the study of human genes and diseases. A comparative analysis of the mouse and human genome reveals conservation of synteny in over 90% of the genome 5. Also, much of the technology used in mouse models is applicable to the study of human genes, for example, gene disruptions and allelic replacement 6. However, the creation of a transgenic mouse requires a great deal of resources of both a financial and technical nature. Several projects have begun to compile libraries of knock out mouse strains (KOMP, EUCOMM, NorCOMM) or mutagenesis induced strains (RIKEN), which require large-scale efforts and collaboration 7. Therefore, it is desirable to first study the phenotype of a desired gene in a cell culture model of primary cells before progressing to a mouse model. 
Retroviral DNA integrates into the host DNA, preferably within or near transcription units or CpG islands, resulting in stable and heritable expression of the packaged gene of interest while avoiding transcriptional silencing 8 9. The genes are then transcribed under the control of a high efficiency retroviral promoter, resulting in a high efficiency of transcription and protein production. Therefore, retroviral expression can be used with cells that are difficult to transfect, provided the cells are in an active state during mitosis. Because the structural genes of the virus are contained within the packaging cell line, the expression vectors used to clone the gene of interest contain no structural genes of the virus, which both eliminates the possibility of viral revertants and increases the safety of working with viral supernatants as no infectious virions are produced 10. 
Here we present a protocol for recombinant retroviral production and subsequent infection of splenic B cells. After isolation, the cultured splenic cells are stimulated with Th derived lymphokines and anti-CD40, which induces a burst of B cell proliferation and differentiation 11. This protocol is ideal for the study of events occurring late in B cell development and differentiation, as B cells are isolated from the spleen following initial hematopoetic events but prior to antigenic stimulation to induce plasmacytic differentiation.

An efficient system of structure and function analysis of a gene in an ex vivo culture of splenic B-lymphocytes is described. This method takes advantage of recombinant retroviral production in a helper free, ecotrophic packaging cell line. Stable, heritable expression of a gene of interest within primary lymphocytes is achieved leading to generation of surface antibodies on B cells undergoing class switch recombination.

Рекомбинантный Ретровирусные Производство и Заражение В-клетки

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control ...

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the generation of extreme population diversity that facilitates virus adaptation and evolution. Increasing evidence shows that the intrinsic error rates, and the resulting mutation frequencies, of RNA viruses can be modulated by subtle amino acid changes to the viral polymerase. Although biochemical assays exist for some viral RNA polymerases that permit quantitative measure of incorporation fidelity, here we describe a simple method of measuring mutation frequencies of RNA viruses that has proven to be as accurate as biochemical approaches in identifying fidelity altering mutations. The approach uses conventional virological and sequencing techniques that can be performed in most biology laboratories. Based on our experience with a number of different viruses, we have identified the key steps that must be optimized to increase the likelihood of isolating fidelity variants and generating data of statistical significance. The isolation and characterization of fidelity altering mutations can provide new insights into polymerase structure and function1-3. Furthermore, these fidelity variants can be useful tools in characterizing mechanisms of virus adaptation and evolution4-7.

The present article describes the steps required to isolate and characterize RNA polymerase fidelity variants of RNA viruses and how to use mutation frequency data to confirm fidelity changes in tissue culture.

Выделение вариантов Fidelity РНК-содержащих вирусов и характеристика вирусов Частота мутаций

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. Several downstream applications require large quantities of pure viral DNA, which is provided by this protocol. These applications include viral genome sequencing, where the removal of host DNA is crucial to optimize data output for viral sequences, and the production of new viral recombinant strains, where co-transfection of purified plasmid and linear viral DNA facilitates recombination.1,2,3 
This procedure utilizes a combination of extractions and density-based centrifugation to isolate purified linear herpesvirus nucleocapsid DNA from infected cells.4,5 The initial purification steps aim to isolate purified viral capsids, which contain and protect the viral DNA during the extractions and centrifugation steps that remove cellular proteins and DNA. Lysis of nucleocapsids then releases viral DNA, and two final phenol-chloroform steps remove remaining proteins. The final DNA captured from solution is highly concentrated and pure, with an average OD260/280 of 1.90. Depending on the quantity of infected cells used, yields of viral DNA range from 150-800 &mu;g or more. The purity of this DNA makes it stable during long-term storage at 4C. This DNA is thus ideally suited for high-throughput sequencing, high fidelity PCR reactions, and transfections. 
Prior to beginning the protocol, it is important to know the average number of cells per dish (e.g. an average of 8 x 106 PK-15 cells in a confluent 15 cm dish), and the titer of the viral stock to be used (e.g. 1 x 108 plaque-forming units per ml). These are necessary to calculate the appropriate multiplicity of infection (MOI) for the protocol.6 For instance, to infect one 15 cm dish of PK-15 cells with the above viral stock, at an MOI of 5, you would use 400 &mu;l of viral stock and dilute it with 3.6 ml of medium (total inoculation volume of 4 ml for one 15 cm plate).
Multiple viral DNA preparations can be prepared at the same time. The number of simultaneous preparations is limited only by the number of tubes held by the ultracentrifuge rotor (one per virus; see step 3.9 below). Here we describe the procedure as though being done for one virus.

We describe the process of isolating high purity herpesvirus nucleocapsid DNA from infected cells. The final DNA captured from solution is of high concentration and purity, making it ideally suited for high-throughput sequencing, high fidelity PCR reactions, and transfections to produce new viral recombinants.

Подготовка вирусных ДНК из нуклеокапсидов

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. ...

Efficient Recombinant Parvovirus Production with the Help of Adenovirus-derived Systems

Rodent parvoviruses (PV) such as rat H-1PV and MVM, are small icosahedral, single stranded, DNA viruses. Their genome includes two promoters P4 and P38 which regulate the expression of non-structural (NS1 and NS2) and capsid proteins (VP1 and VP2) respectively1. They attract high interest as anticancer agents for their oncolytic and oncosuppressive abilities while being non-pathogenic for humans2. NS1 is the major effector of viral cytotoxicity3. In order to further enhance their natural antineoplastic activities, derivatives from these vectors have been generated by replacing the gene encoding for the capsid proteins with a therapeutic transgene (e.g. a cytotoxic polypeptide, cytokine, chemokine, tumour suppressor gene etc.)4. The recombinant parvoviruses (recPVs) vector retains the NS1/2 coding sequences and the PV genome telomeres which are necessary for viral DNA amplification and packaging. Production of recPVs occurs only in the producer cells (generally HEK293T), by co-transfecting the cells with a second vector (pCMV-VP) expressing the gene encoding for the VP proteins (Fig. 1)4. The recPV vectors generated in this way are replication defective. Although recPVs proved to possess enhanced oncotoxic activities with respect to the parental viruses from which they have been generated, their production remains a major challenge and strongly hampers the use of these agents in anti-cancer clinical applications.
We found that introduction of an Ad-5 derived vector containing the E2a, E4(orf6) and the VA RNA genes (e.g. pXX6 plasmid) into HEK293T improved the production of recPVs by more than 10 fold in comparison to other protocols in use. Based on this finding, we have constructed a novel Ad-VP-helper that contains the genomic adenoviral elements necessary to enhance recPVs production as well as the parvovirus VP gene unit5. The use of Ad-VP-helper, allows production of rec-PVs using a protocol that relies entirely on viral infection steps (as opposed to plasmid transfection), making possible the use of cell lines that are difficult to transfect (e.g. NB324K) (Fig. 2). We present a method that greatly improves the amount of recombinant virus produced, reducing both the production time and costs, without affecting the quality of the final product5. In addition, large scale production of recPV (in suspension cells and bioreactors) is now conceivable.

Here we describe a protocol based only on cell infection, which improves the efficiency of recombinant parvovirus production by more than 100 fold in comparison to other protocols in use. This protocol relies on the use of a novel adenovirus 5-based helper containing the parvovirus VP transcription unit (Ad-VP).

Эффективное производство рекомбинантных парвовирус с помощью аденовируса производные системы

Rodent parvoviruses (PV) such as rat H-1PV and MVM, are small icosahedral, single stranded, DNA viruses. Their genome includes two promoters P4 and P38 ...

Engineering and Evolution of Synthetic Adeno-Associated Virus (AAV) Gene Therapy Vectors via DNA Family Shuffling

Adeno-associated viral (AAV) vectors represent some of the most potent and promising vehicles for therapeutic human gene transfer due to a unique combination of beneficial properties1. These include the apathogenicity of the underlying wildtype viruses and the highly advanced methodologies for production of high-titer, high-purity and clinical-grade recombinant vectors2. A further particular advantage of the AAV system over other viruses is the availability of a wealth of naturally occurring serotypes which differ in essential properties yet can all be easily engineered as vectors using a common protocol1,2. Moreover, a number of groups including our own have recently devised strategies to use these natural viruses as templates for the creation of synthetic vectors which either combine the assets of multiple input serotypes, or which enhance the properties of a single isolate. The respective technologies to achieve these goals are either DNA family shuffling3, i.e. fragmentation of various AAV capsid genes followed by their re-assembly based on partial homologies (typically &gt;80% for most AAV serotypes), or peptide display4,5, i.e. insertion of usually seven amino acids into an exposed loop of the viral capsid where the peptide ideally mediates re-targeting to a desired cell type. For maximum success, both methods are applied in a high-throughput fashion whereby the protocols are up-scaled to yield libraries of around one million distinct capsid variants. Each clone is then comprised of a unique combination of numerous parental viruses (DNA shuffling approach) or contains a distinctive peptide within the same viral backbone (peptide display approach). The subsequent final step is iterative selection of such a library on target cells in order to enrich for individual capsids fulfilling most or ideally all requirements of the selection process. The latter preferably combines positive pressure, such as growth on a certain cell type of interest, with negative selection, for instance elimination of all capsids reacting with anti-AAV antibodies. This combination increases chances that synthetic capsids surviving the selection match the needs of the given application in a manner that would probably not have been found in any naturally occurring AAV isolate. Here, we focus on the DNA family shuffling method as the theoretically and experimentally more challenging of the two technologies. We describe and demonstrate all essential steps for the generation and selection of shuffled AAV libraries (Fig. 1), and then discuss the pitfalls and critical aspects of the protocols that one needs to be aware of in order to succeed with molecular AAV evolution.

Engineering and Evolution of Synthetic Adeno-Associated Virus AAV Gene Therapy Vectors via DNA Family Shuffling

We demonstrate the basic technique to molecularly engineer and evolve synthetic Adeno-associated viral (AAV) gene therapy vectors via DNA family shuffling. Moreover, we provide general guidelines and representative examples for selection and analysis of individual chimeric capsids with enhanced properties on target cells in culture or in mice.

Инженерные и эволюции Синтетическая адено-связанный вирус (AAV) генной терапии векторы с помощью ДНК семьи Перетасовка

Adeno-associated viral (AAV) vectors represent some of the most potent and promising vehicles for therapeutic human gene transfer due to a unique ...

Production and Purification of Non Replicative Canine Adenovirus Type 2 Derived Vectors

Adenovirus (Ad) derived vectors have been widely used for short or long-term gene transfer, both for gene therapy and vaccine applications. Because of the frequent pre-existing immunity against the classically used human adenovirus type 5, canine adenovirus type 2 (CAV2) has been proposed as an alternative vector for human gene transfer. The well-characterized biology of CAV2, together with its ease of genetic manipulation, offer major advantages, notably for gene transfer into the central nervous system, or for inducing a wide range of protective immune responses, from humoral to cellular immunity. Nowadays, CAV2 represents one of the most appealing nonhuman adenovirus for use as a vaccine vector. This protocol describes a simple method to construct, produce and titer recombinant CAV2 vectors. After cloning the expression cassette of the gene of interest into a shuttle plasmid, the recombinant genomic plasmid is obtained by homologous recombination in the E. coli BJ5183 bacterial strain. The resulting genomic plasmid is then transfected into canine kidney cells expressing the complementing CAV2-E1 genes (DK-E1). A viral amplification enables the production of a large viral stock, which is purified by ultracentrifugation through cesium chloride gradients and desalted by dialysis. The resulting viral suspension routinely has a titer of over 1010 infectious particles per ml and can be directly administrated in vivo.

These past 15 years, canine adenovirus type 2 (CAV2)-derived vectors have proven their efficiency to transduce cells in vitro&#160;and in vivo and are widely used for vaccination and gene therapy. Here, we describe a procedure to construct, produce and purify CAV2 vectors, giving rise to high-titer viral suspensions.

Производство и очистка нерепликативной собак аденовируса типа 2 Производные векторов

Adenovirus (Ad) derived vectors have been widely used for short or long-term gene transfer, both for gene therapy and vaccine applications. Because of the ...

Dissecting Innate Immune Signaling in Viral Evasion of Cytokine Production

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. Conversely, viruses have evolved intricate strategies to evade and exploit host immune signaling for survival and propagation. Viral immune evasion, entailing host defense and viral evasion, provides one of the most fascinating and dynamic interfaces to discern the host-virus interaction. These studies advance our understanding in innate immune regulation and pave our way to develop novel antiviral therapies.
Murine &#947;HV68 is a natural pathogen of murine rodents. &#947;HV68 infection of mice provides a tractable small animal model to examine the antiviral response to human KSHV and EBV of which perturbation of in vivo virus-host interactions is not applicable. Here we describe a protocol to determine the antiviral cytokine production. This protocol can be adapted to other viruses and signaling pathways.
Recently, we have discovered that &#947;HV68 hijacks MAVS and IKK&#946;, key innate immune signaling components downstream of the cytosolic RIG-I and MDA5, to abrogate NF&#922;B activation and antiviral cytokine production. Specifically, &#947;HV68 infection activates IKK&#946; and that activated IKK&#946; phosphorylates RelA to accelerate RelA degradation. As such, &#947;HV68 efficiently uncouples NF&#922;B activation from its upstream activated IKK&#946;, negating antiviral cytokine gene expression. This study elucidates an intricate strategy whereby the upstream innate immune activation is intercepted by a viral pathogen to nullify the immediate downstream transcriptional activation and evade antiviral cytokine production.

We describe a protocol to measure the antiviral cytokine production in mice infected with a model herpesvirus, murine gamma herpesvirus 68 (&#947;HV68) that is closely-related to human Kaposi&#8217;s sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) and Epstein-Barr virus (EBV). Utilizing genetically modified mouse strains and mouse embryonic fibroblasts (MEFs), we assessed the antiviral cytokine production both in vivo and ex vivo. &#8220;Reconstituting&#8221; the expression of innate immune components in knockout embryonic fibroblasts by lentiviral transduction, we further pinpoint specific innate immune molecules and dissect the key signaling events that differentially regulate the antiviral cytokine production.

Пройдя врожденной иммунной Сигнализация в Вирусный Уклонение продукция цитокинов

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. burnetii DNA in cell cultures and clinical samples. PCR requires specialized equipment and extensive end user training, and therefore, it is not suitable for routine work especially in a resource-constrained area. We have developed a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay to detect the presence of C. burnetii in patient samples. This method is performed at a single temperature around 60 &#176;C in a water bath or heating block. The sensitivity of this LAMP assay is very similar to PCR with a detection limit of about 25 copies per reaction. This report describes the preparation of the reaction using lyophilized reagents and visualization of results using hydroxynaphthol blue (HNB) or a UV lamp with fluorescent intercalating dye in the reaction. The LAMP reagents were lyophilized and stored at room temperature (RT) for one month without loss of detection sensitivity. This LAMP assay is particularly robust because the reaction mixture preparation does not involve complex steps. This method is ideal for use in resource-limited settings where Q fever is endemic.

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

We described here a simple loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method using lyophilized reagents for the detection of C. burnetii in patient samples.

Развитие Лиофилизированный Loop опосредованных изотермических реагенты для амплификации для обнаружения<em&gt; Coxiella burnetii</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional methods to measure NA inhibiting (NI) antibody titers are not practical for routine serology. This protocol describes the enzyme-linked lectin assay (ELLA), a practical alternative method to measure NI titers that is performed in 96 well plates coated with a large glycoprotein substrate, fetuin. NA cleaves terminal sialic acids from fetuin, exposing the penultimate sugar, galactose. Peanut agglutinin (PNA) is a lectin with specificity for galactose and therefore the extent of desialylation can be quantified using a PNA-horseradish peroxidase conjugate, followed by addition of a chromogenic peroxidase substrate. The optical density that is measured is proportional to NA activity. To measure NI antibody titers, serial dilutions of sera are incubated at 37 &#176;C O/N on fetuin-coated plates with a fixed amount of NA. The reciprocal of the highest serum dilution that results in &#8805;50% inhibition of NA activity is designated as the NI antibody titer. The ELLA provides a practical format for routine evaluation of human antibody responses following influenza infection or vaccination.

We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.

Измерение гриппа нейраминидазы ингибирования Титры антител методом ферментативного лектина Пробирной

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the person-to-person route or indirectly through environmental surfaces or food, contaminated fomites and inanimate surfaces are important vehicles for the spread of the virus during norovirus outbreaks.
We developed and evaluated a protocol using macrofoam swabs for the detection and typing of human noroviruses from hard surfaces. Compared with fiber-tipped swabs or antistatic wipes, macrofoam swabs allow virus recovery (range 1.2-33.6%) from toilet seat surfaces of up to 700 cm2. The protocol includes steps for the extraction of the virus from the swabs and further concentration of the viral RNA using spin columns. In total, 127 (58.5%) of 217 swab samples that had been collected from surfaces in cruise ships and long-term care facilities where norovirus gastroenteritis had been reported tested positive for GII norovirus by RT-qPCR. Of these 29 (22.8%) could be successfully genotyped. In conclusion, detection of norovirus on environmental surfaces using the protocol we developed may assist in determining the level of environmental contamination during outbreaks as well as detection of virus when clinical samples are not available; it may also facilitate monitoring of effectiveness of remediation strategies.

A macrofoam based sampling methodology was developed and evaluated for the detection and quantification of norovirus on environmental hard surfaces.

Метод тампон Отбор проб для обнаружения человека норовирус на поверхностях

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...