Name: production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors
Uploaded: 2011-11-27T14:00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors at JoVE.com

Ver Figura 1 para un ejemplo que resume el siguiente protocolo. Nota de seguridad: Todo el material que ha estado en contacto con el ensamblado de partículas virales se debe desinfectar con una solución de Virkon o desinfectante adecuado. 1. Preparación de las poblaciones de ADN plásmido (~ 2 días) <ol><li> Los plásmidos son necesarios los siguientes 1: <ul><li> pRV1 - Con un contenido de la Rep AAV2 y secuencias de Cap </li><li> pH21 - Con un contenido de la Rep AAV1 y secuencias de Cap </li><li> pFdelta6 - Adenovirus-helper plásmido </li><li> AAV plásmido que contiene el cassette de expresión recombinante flanqueado por AAV2 señales de empaquetamiento (repeticiones terminales invertidas, RTI) </li></ul></li><li> Mientras pFdelta6 deben cultivarse en Stbl2 células competentes para evitar la eliminación parcial, pRV1 y pH21 se pueden cultivar en las células DH5alpha competente. AAV plásmidos pueden ser cultivadas en células Stbl2 si deleciones parciales ocurren en las células DH5alpha. </li><li>Plásmido de ADN debe ser de alta calidad y libre de contaminantes ARN. Los plásmidos pueden ser examinados para la integridad utilizando los siguientes compendios: <ul><li> pRV1 - digestión con XbaI para dar a las bandas de 7,5 kb y 3,8 kb </li><li> pH21 - digestión con EcoRI para dar a las bandas de 4,5 kb, 2,8 kb y 0,2 kb </li><li> pFdelta6 - digestión con HindIII para dar a las bandas de 5,5 kb, 3 kb, 3 kb, kb y 2,3 kb 1.5 </li></ul></li></ol> 2. Preparación de las células embrionarias humanas de riñón 293 (HEK293) para la transfección (2 - 3 días) <ol><li> Placa de dos 80% confluente de 150 cm 2 frascos de células HEK293 en cinco de 15 cm de diámetro placas de cultivo de tejidos Nunc. Las células deben ser de 70 - 80% confluentes antes de la transfección (aproximadamente 48 horas después de la siembra). Las células de cultivo en medio estándar Dulbecco modificado por Eagle (DMEM) con bajos niveles de glucosa que contiene 10% de suero fetal bovino y 100 U / ml de penicilina / estreptomicina 100 mg / ml. </li><li> 3 horas antes de la transfección DMEM eliminar y sustituir por Iscove&#39;S medio modificado de Dulbecco (IMDM) que contiene 5% de suero fetal bovino. </li></ol> 3. Transfección de plásmidos virales (aproximadamente 1 hora para la transfección, 3 días de incubación) <ol><li> Prepare las siguientes personas por un solo lote (5 x 15 cm placas de cultivo de tejidos) de virus: <ul><li> 62,5 g del plásmido AAV </li><li> 125 mg pFdelta6 </li><li> 31,25 mg pRV1 </li><li> 31,25 mg pH21 </li><li> 1650 l 2,5 M CaCl 2 </li><li> 12 ml dH 2 O </li></ul></li><li> En una clase de dos filtros de tejido cubierta de cultivo estéril la mezcla de transfección en un tubo de 50 ml. </li><li> Mientras agitación de la solución, añadir rápidamente 13 ml de HEPES 2 x solución salina tamponada (pH 7,05). Vuelva a colocar la tapa del tubo de 50 ml y continuar vórtice durante 15 segundos. Dejar reposar durante 1 minuto y 45 segundos, un precipitado blanco fino debe formar. </li><li> Suavemente añadir 5 ml de la solución de transfección a cada placa de cultivo de 15 cm de tejido. Placas de remolino para mezclar y retorno a la incubadora. </li><li> 16 horas después de la transfección medio IMDM eliminar y reemplazar con DMEM. </li></ol> 4. Lisis de las células y la cosecha de rAAVs (2 horas) <ol><li> 72 horas después de la transfección, retire el material de las placas de cultivo celular y descarte. Todos los residuos deben ser tratados con una solución de Virkon o desinfectante adecuado. </li><li> Lave suavemente las células de fosfato 1x caliente (PBS, pH 7,4). </li><li> Añadir 25 ml de PBS caliente a cada plato y retire suavemente las células con un rascador de células. Recoger la suspensión en tubos de 50 ml. </li><li> Pellet células a 800 g durante 10 minutos. </li><li> Desechar el sobrenadante y el precipitado se resuspende en 150 mM NaCl, 20 mM Tris pH 8,0, el uso de 10 ml por placa de cultivo de tejidos. Dividido en dos tubos de 50 ml. </li><li> Prepare una solución fresca de desoxicolato de sodio al 10% en dH 2 O. Añadir 1,25 ml de este a cada tubo, para una concentración final de 0,5%. Añadir benzonasa nucleasa a una concentración final de 50 unidades por ml. Mezclar el tubo completamente. </li><li&gt; Se incuba a 37 ° C durante 1 hora. </li><li> Eliminar los restos celulares por centrifugación a 3000 xg durante 15 minutos. Traslado al nuevo tubo de 50 ml, asegurar que todos los restos celulares se ha eliminado para evitar el bloqueo de las columnas de la heparina (ver paso 5). En esta etapa, las muestras pueden ser almacenadas a -20 ° C antes de continuar. Hemos almacenado las muestras durante varias semanas a -20 ° C sin reducción de la infectividad. </li></ol> 5. Purificación de columna de heparina de rAAVs (2 - 3 horas) <ol><li> Configuración de columnas HiTrap heparina usando una bomba peristáltica para que las soluciones de flujo a través de la columna a 1 ml por minuto para los pasos 5.2 a 5.4. Es importante asegurarse de que no queden burbujas de aire introducido en la columna de heparina. </li><li> Equilibrar la columna con 10 ml de NaCl 150 mM, 20 mM Tris, pH 8,0. </li><li> Aplicar 50 ml de solución de virus de la columna y permitir que fluya a través. </li><li> Lavar la columna con 20 ml de NaCl 100 mM, 20 mM Tris, pH 8,0. </li><li> Con una jeringa de 5 ml seguir lavando la columna wITH 1 ml de 200 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8,0, seguido de 1 ml de NaCl 300 mM, 20 mM Tris, pH 8,0. Deseche el flujo continuo. </li><li> Utilizando jeringas de 5 ml y eluir una presión suave que el virus de la columna mediante la aplicación de: <ul><li> 1,5 ml de 400 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8,0 </li><li> 3,0 ml de 450 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8,0 </li><li> 1,5 ml de 500 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 8,0 </li><li> Recoger estas en un tubo de centrífuga de 15 ml. </li></ul></li></ol> 6. La concentración y la filtración estéril de rAAVs (1 hora) <ol><li> Concentrado de vectores usando Amicon Ultra-4 unidades de filtro centrífugo con un límite de peso molecular 100.000. Carga de 4 ml de eluido de la columna en la planta concentradora y se centrifuga a 2000 xg durante 2 minutos (a temperatura ambiente). Deseche caudal contínuo y el concentrador vuelva a cargar con la solución de virus restantes y repita la centrifugación. El volumen de concentrado debe ser de aproximadamente 250 l. Si el volumen de concentrados es mucho más que eso, deseche el flujo tediante y seguir los pasos de centrifugación en un minuto hasta que el volumen es de aproximadamente 250 l. </li><li> Añadir 250 l de PBS al virus por un volumen final de 500 l y retirar del concentrador. </li><li> Vector a través de un filtro de 13 mm de diámetro 0,2 micras filtro de jeringa. Vector debe ser en alícuotas y se almacenó a -80 ° C hasta su utilización. </li></ol> 7. Titulación de los stocks de virus (3 días) Esto requiere de un promotor que es activo en células HEK293 la conducción de un gen reportero o un producto del gen immunocytochemically detectable. Cuando se produce un vector que no es compatible con las células HEK293 otras líneas celulares o cultivos primarios de células se pueden utilizar. <ol><li> Prepare 18 poli-L-lisina cubreobjetos de vidrio recubiertos o 18 pozos de la cámara de diapositivas Nunc sembrando células HEK293 para que sean 40 - 50% confluente. Para la titulación de Cre-dependiente rAAVs uso HEK293 células que expresan establemente la recombinasa Cre 2. </li><li> Infectar bien con serie dilutions del vector AAV (Fig. 2A). Utilice 3 pocillos por cada dilución. Nosotros habitualmente añaden el virus directamente a cada pocillo. </li><li> Después de 72 horas fijar HEK293 células mediante la adición de un volumen igual de paraformaldehído al 4% (PFA) a medio (dando una concentración final de 2% PFA) durante diez minutos a temperatura ambiente. </li><li> Lávese las células tres veces en PBS, enjuague en dH 2 O y cubreobjetos. </li><li> Cuente el número de células transducidas de los tres pozos que tienen el mayor factor de dilución, pero aún contienen células infectadas, encontrar el promedio de estos y se multiplica por el factor de dilución para obtener el número de unidades infecciosas por microlitro (Fig. 2B). </li></ol> 8. Los resultados previstos HEK293 células transducidas con una codificación de virus se muestran aumento de proteína verde fluorescente (EGFP) en la Figura 2B. Por lo general, lograr títulos constante de alrededor de 6 x 10 6 partículas infecciosas por microlitro. Nosotros usamos estos vectores para estereotáxica de colcción en el cerebro de roedores adultos. Esto proporciona una poderosa técnica para la región de la expresión génica específica 2. Para combinar esta especificidad región con la expresión de genes de células de tipo selectivo que se inyectan la recombinasa Cre-dependiente rAAVs en las regiones objetivo de Cre-ratones transgénicos 2. Figura 2C-E se muestran ejemplos de las inyecciones estereotáxica de Cre-dependiente rAAVs codificación eGFP en diferentes regiones del cerebro de ratones adultos parvalbúmina-Cre transgénicos 3. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3348/3348fig1.jpg" /> Figura 1. Esquema del protocolo para la producción de rAAV. 1.) HEK293 células se colocan y crecido a 70 a 80% de confluencia. 2.) Plásmidos AAV y el ayudante se preparan y se transfectaron en células HEK293. 3.) Media pasa a ser DMEM 16 horas después de la transfección y HEK293 células se cultivan durante otras 56 horas. 4.) HEK293 células se cosechan y se lisan. rAAV vectores están separados de los restos celulares por centrifugation. 5.) Las partículas virales se purifican a través de columnas de heparina antes de la concentración y la esterilización. 6.) HEK293 células se cultivan en placas de 24 pocillos e infectar con diluciones seriadas de los vectores AAV para determinar el número de unidades infecciosas. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3348/3348fig2.jpg" /> Figura 2. Titulación y aplicación in vivo de rAAV1 / 2. (A) la instalación de células HEK293 para medir el título viral. HEK293 células se transducen con diluciones seriadas de rAAVs. C, el control no infectados, N, 1 l de stock viral sin diluir. (B) HEK293 células infectadas con rAAVs expresan EGFP. (CE) eGFP expresión viral se limita a Cre-neuronas que expresan en las diferentes zonas piloto de parvalbúmina-Cre ratones transgénicos después de la inyección estereotáxica de Cre-activa rAAVs. Las imágenes muestran ejemplos inmunorreactividad en las buenas prácticas agrarias (C) el pálido reticular del tálamo y el globo, (D) y el giro dentado (E) de la región CA1 del hipocampo. DG, dentate giro, RT, núcleo reticular talámico, GP, globo pálido. Las barras de escala: B, 500 m; C, 100 m; D, 100 m; E, a 500 micras.

<ol>
	<li>Klugmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV-mediated+hippocampal+expression+of+short+and+long+Homer+1+proteins+differentially+affect+cognition+and+seizure+activity+in+adult+rats.">AAV-mediated hippocampal expression of short and long Homer 1 proteins differentially affect cognition and seizure activity in adult rats.</a> Molecular and Cellular Neurosciences. 28, 347-360 (2005).</li><li>Murray, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parvalbumin-positive+CA1+interneurons+are+required+for+spatial+working+but+not+for+reference+memory.">Parvalbumin-positive CA1 interneurons are required for spatial working but not for reference memory.</a> Nature Neuroscience. 14, 297-299 (2011).</li><li>Hippenmeyer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+developmental+switch+in+the+response+of+DRG+neurons+to+ETS+transcription+factor+signaling.">A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling.</a> PLoS Biology. 3, e159-e159 (2005).</li><li>Hauck, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+characterization+of+chimeric+recombinant+AAV+vectors.">Generation and characterization of chimeric recombinant AAV vectors.</a> Molecular Therapy. 7, 419-425 (2003).</li><li>Halbert, C. L., Allen, J. M., Miller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+type+6+(AAV6)+vectors+mediate+efficient+transduction+of+airway+epithelial+cells+in+mouse+lungs+compared+to+that+of+AAV2+vectors.">Adeno-associated virus type 6 (AAV6) vectors mediate efficient transduction of airway epithelial cells in mouse lungs compared to that of AAV2 vectors.</a> Journal of Virology. 75, 6615-6615 (2001).</li><li>Blankinship, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transduction+of+skeletal+muscle+using+vectors+based+on+adeno-associated+virus+serotype+6.">Efficient transduction of skeletal muscle using vectors based on adeno-associated virus serotype 6.</a> Molecular Therapy. 10, 671-678 (2004).</li><li>Wu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+amino+acid+changes+can+influence+titer,+heparin+binding,+and+tissue+tropism+in+different+adeno-associated+virus+serotypes.">Single amino acid changes can influence titer, heparin binding, and tissue tropism in different adeno-associated virus serotypes.</a> Journal of Virology. 80, 11393-11397 (2006).</li><li>Dong, J. Y., Fan, P. D., Frizzell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+the+packaging+capacity+of+recombinant+adeno-associated+virus.">Quantitative analysis of the packaging capacity of recombinant adeno-associated virus.</a> Human gene therapy. 7, 2101-2112 (1996).</li><li>Zolotukhin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+purification+of+serotype+1,+2,+and+5+recombinant+adeno-associated+viral+vectors.">Production and purification of serotype 1, 2, and 5 recombinant adeno-associated viral vectors.</a> Methods. 1, 158-167 (2002).</li><li>Burova, E., Loffe, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatographic+purification+of+recombinant+adenoviral+and+adeno-associated+viral+vectors:+methods+and+implications.">Chromatographic purification of recombinant adenoviral and adeno-associated viral vectors: methods and implications.</a> Gene Therapy. 12, 5-17 (2005).</li><li>Zolotukhin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+adeno-associated+virus+purification+using+novel+methods+improves+infectious+titer+and+yield.">Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield.</a> Gene Therapy. 6, 973-985 (1999).</li><li>Bilbao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+gene+expression+from+in+utero+delivery+of+adenoviral-associated+vector+serotype+1.">Patterns of gene expression from in utero delivery of adenoviral-associated vector serotype 1.</a> Human Gene Therapy. 16, 678-684 (2005).</li><li>Pilpel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=reproducible+transduction+of+select+forebrain+regions+by+targeted+recombinant+virus+injection+into+the+neonatal+mouse+brain.">reproducible transduction of select forebrain regions by targeted recombinant virus injection into the neonatal mouse brain.</a> Journal of Neuroscience Methods. 182, 55-63 (2009).</li><li>Mastakov, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+injection+of+rAAV+with+mannitol+enhances+gene+expression+in+the+rat+brain.">Combined injection of rAAV with mannitol enhances gene expression in the rat brain.</a> Molecular Therapy. 3, 225-232 (2001).</li><li>Fu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-complementary+adeno-associated+virus+serotype+2+vector:+global+distribution+and+broad+dispersion+of+AAV-mediated+transgene+expression+in+mouse+brain.">Self-complementary adeno-associated virus serotype 2 vector: global distribution and broad dispersion of AAV-mediated transgene expression in mouse brain.</a> Molecular Therapy. 8, 911-917 (2003).</li><li>Ghosh, A., Yue, Y., Duan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Transgene+Reconstitution+with+Hybrid+Dual+AAV+Vectors+Carrying+the+Minimized+Bridging+Sequences.">Efficient Transgene Reconstitution with Hybrid Dual AAV Vectors Carrying the Minimized Bridging Sequences.</a> Human Gene Therapy. 22, 77-83 (2011).</li><li>McCarty, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-complementary+AAV+vectors;+advances+and+applications.">Self-complementary AAV vectors; advances and applications.</a> Molecular Therapy. 16, 1648-1656 (2008).</li><li>Georgiadis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV-mediated+knockdown+of+peripherin-2+in+vivo+using+miRNA-based+hairpins.">AAV-mediated knockdown of peripherin-2 in vivo using miRNA-based hairpins.</a> Gene Therapy. 17, 486-493 (2010).</li><li>Atasoy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FLEX+switch+targets+Channelrhodopsin-2+to+multiple+cell+types+for+imaging+and+long-range+circuit+mapping.">A FLEX switch targets Channelrhodopsin-2 to multiple cell types for imaging and long-range circuit mapping.</a> The Journal of Neuroscience. 28, 7025-7030 (2008).</li><li>Guggenhuber, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV+Vector-Mediated+Overexpression+of+CB1+Cannabinoid+Receptor+in+Pyramidal+Neurons+of+the+Hippocampus+Protects+against+Seizure-Induced+Excitoxicity.">AAV Vector-Mediated Overexpression of CB1 Cannabinoid Receptor in Pyramidal Neurons of the Hippocampus Protects against Seizure-Induced Excitoxicity.</a> PLoS One. 5, e15707-e15707 (2010).</li><li>Lawlor, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+delivery+and+selective+transduction+of+glial+cells+in+the+mammalian+brain+by+AAV+serotypes+isolated+from+nonhuman+primates.">Efficient gene delivery and selective transduction of glial cells in the mammalian brain by AAV serotypes isolated from nonhuman primates.</a> Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 17, 1692-1702 (2009).</li><li>Chtarto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetracycline-inducible+transgene+expression+mediated+by+a+single+AAV+vector.">Tetracycline-inducible transgene expression mediated by a single AAV vector.</a> Gene Therapy. 10, 84-94 (2003).</li><li>Han, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+humoral+immune+response+to+the+tetracycline+(Tet)+activator+in+rats+injected+intracranially+with+Tet-off+rAAV+vectors.">Lack of humoral immune response to the tetracycline (Tet) activator in rats injected intracranially with Tet-off rAAV vectors.</a> Gene Therapy. 17, 616-625 (2010).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

vectores rAAV son cada vez más valioso para los estudios in vivo en animales. Aquí, hemos descrito un protocolo sencillo y barato para rAAVs producción, lo que puede facilitar la aplicación generalizada de este vector útil al evitar la costosa subcontratación de la producción del virus a las empresas. El protocolo (basado en la referencia 1) describe la producción de quimérico rAAV1 / 2 vectores que contienen proteínas de la cápside de los dos serotipos de los padres en proporciones iguales 4. La purificación de los vectores rAAV uniéndose a las columnas de la heparina se basa en la expresión de proteínas de la cápside AAV2, pero se puede combinar con otros serotipos de AAV1 descritos aquí. Además, AAV6 Se ha informado que se unen a la heparina, aunque con una menor afinidad, y podría ser purificado con columnas de heparina con este procedimiento 5,6. Cabe señalar sin embargo, que otros serotipos se requieren diferentes concentraciones de NaCl de elución de la columna de heparina 5,7. Embalaje rAAV genomas ha demostrado ser óptimo entre 4,1 y 4,9 kb con una fuerte reducción en la eficiencia de envases de hasta 5,2 kb 8. Este límite de embalaje puede ser considerado como la mayor desventaja del sistema de rAAV, puesto que el tipo específico de células regulación de la expresión del transgen se suele conseguir grandes cis actuando elementos que no pueden tener cabida dentro de las partículas de AAV pequeños. Para superar los lotes de baja titulación, tales como las resultantes del intento de genes paquete que se encuentran cerca del límite de embalaje AAV que se combinan distintos lotes viral concentrada a 250 l en un lote de 500 l, en lugar de añadir PBS como se describe en el paso 6.3. Fiables del tipo de células específicas de transducción se puede lograr mediante la combinación de Cre-driver ratones y cassettes condicional rAAV (ver abajo) para evitar estirar el límite de embalaje. Es de destacar que mientras que este protocolo pretende proporcionar fácil de seguir las instrucciones en la producción de t de altaiter rAAV, se requiere la presencia de restos de AAV2 proteína de la cápside para la purificación por cromatografía de afinidad con heparina. Otros serotipos de AAV2 debe ser purificado mediante procedimientos alternativos 9. Una de las ventajas de la purificación columna de heparina es que se cree que produce vectores AAV que tienen una mayor tasa de infectividad de los producidos con un gradiente de cloruro de cesio 10. Sin embargo, también existen algunas desventajas de este método. Por ejemplo, otras proteínas que se unen a la heparina también pueden estar presentes en la población viral purificada. Mientras que el tropismo de heparina purificada vectores pueden ser influenciados por el título vector 10, nuestro enfoque para apuntar específicamente a cualquiera de excitación 20 o neuronas inhibitorias (Fig. 2) emplea a Cre-inducida por la activación de la expresión del transgen AAV-mediada y es independiente del título. Una alternativa a la purificación de columna de heparina es el uso de un gradiente de densidad iodixanol, que produce un título viral más alta y más pura que la preparación de la utilización deun gradiente de cloruro de cesio 10. Este método también se puede combinar con la purificación columna de heparina para producir un vector que es mayor que 99% 11. Por lo tanto, la consideración cuidadosa debe ser tomada por los distintos grupos en cuanto a qué método de purificación viral es la mejor para su aplicación posterior en particular. El problema más común asociado con este protocolo es título viral baja. En nuestra experiencia, esto se puede remontar a la eficacia de transfección de baja, o la elución del virus de las columnas de la heparina. Todos los materiales de la transfección debe estar a temperatura ambiente antes de la transfección, y transfections prueba se debe realizar para encontrar las condiciones óptimas en cada laboratorio. Otros métodos de transfección, como lipofectamina, son muy eficientes, pero puede ser muy caro. Además, la concentración y el pH de las soluciones de elución heparina columna es fundamental para la elución completa de los viriones de witho columnas heparinaut daños. Otro punto importante es que las células de envasado deben adherirse bien a la superficie de los platos de cultivo de tejidos. Si las células se separan en algún momento durante el procedimiento se recomienda dar por terminado el experimento y descongelar un nuevo vial de las células. Espacio-temporales de control de la expresión del transgen en los roedores es fácil de lograr por objetivo anatómica precisa y la etapa de desarrollo del animal. Eficiente AAV-mediada por la transferencia de genes se ha demostrado en el útero 12,13. En el cerebro adulto, el área infectada con partículas rAAV después de la inyección estereotáxica puede ser ajustado de las regiones objetivo muy pequeño, a áreas mucho más grandes no sólo por los cambios en el título viral, sino también mediante la alteración de los parámetros de inyección. Estos incluyen el volumen y la velocidad de las inyecciones y la inclusión de los polioles manitol con la suspensión del virus 14. El manitol también se puede utilizar para mejorar la infección de una variedad de tejidos después de la inyección sistémica rAAV 15 &lt;/ Sup&gt;. La capacidad de envasado de rAAV (aproximadamente 4,7 kb) es probablemente el factor más limitante en términos de los genes que se pueden expresar de estos vectores virales. Sin embargo, estudios recientes han demostrado que esto puede ser parcialmente superada por los genes de la división más grande o casetes de expresión en distintos vectores rAAV y la introducción de una secuencia de transición, iniciando la expresión de genes en los viriones infectan la misma célula 16. Los niveles de expresión de los genes transportados por vectores rAAV también puede ser mucho mejor mediante el uso de auto-vectores gratis rAAV 17. Inyección estereotáxica de vectores rAAV proporciona un método rápido, barato y eficaz para inducir la expresión de genes de una manera específicos de la región. En combinación con dos estrategias de segunda generación de interferencia de ARN 18 rAAVs también se puede utilizar para la región-gen específico de derribar. rAAVs se puede combinar con Cre-ratones transgénicos o de tipo de células específicas para lograr los promotores del circuito y del tipo celularExpresión de genes específicos, lo que permite la manipulación genética con alta resolución espacial 2,19-21, mientras que rAAVs ajuste por ejemplo, con el sistema tet añade el control temporal sobre el virus de la expresión génica mediada 22,23. Estos ejemplos ilustran el enorme potencial combinatorio de estos vectores y predecir un aumento rápido en rAAV estudios basados ​​en los próximos años.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Amicon centrífugas filtros ultra </td><td> Millipore </td><td> UFC810024 </td><td> 100.000 MWCO </td></tr><tr><td> Benzonase nucleasa </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E1014 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbeco de Eagle modificado (DMEM) </td><td> Invitrogen </td><td> 10567014 </td><td> Suplemento con 10% de FCS y 10 unidades / ml estreptomicina penicillin/100 mg / ml </td></tr><tr><td> HEK293 </td><td> Tipo de la cultura estadounidense, la colección </td><td> CRL-1573 </td><td> Uso en el paso de menos de 30 </td></tr><tr><td> Solución salina tamponada con HEPES </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 51558 </td><td></td></tr><tr><td> HiTrap heparina cartucho </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 54836 </td><td></td></tr><tr><td> Medio Iscove modificado de Dulbecco </td><td> Invitrogen </td><td> 12440-053 </td><td> Suplemento con 5% FCS </td></tr><tr><td> Desoxicolato sódico </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D5670 </td><td> Haga una solución fresca para cada lote </td></tr><tr><td> 15 cm de platos de cultivo de tejidos </td><td> Fisher Scientific </td><td> 157150 </td><td></td></tr><tr><td> Stbl2 células competentes </td><td> Invitrogen </td><td> 10268-019 </td><td></td></tr><tr><td> Virkon solución </td><td> Fisher Scientific </td><td> NC9821357 </td><td> Deja para la desinfección de toda la noche antes de desechar el drenaje </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Reactivos específicos requeridos para el protocolo

production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors

En los últimos años recombinantes adeno-asociado vectores virales (AAV) se han convertido cada vez más valioso para los estudios in vivo en animales, y también se está probando en ensayos clínicos humanos. AAV de tipo salvaje es un miembro no patógena de la familia Parvoviridae e inherentemente replicación deficiente. El perfil de transducción amplia, baja respuesta inmune, así como la expresión del transgen fuerte y persistente logra con estos vectores ha hecho una herramienta popular y versátil para la in vitro e in vivo en la entrega de genes. rAAVs puede ser fácil y barato producir en el laboratorio y, en función de su perfil de seguridad favorable, generalmente se les da una clasificación de seguridad bajo. Aquí se describe un método para la producción y titulación de rAAVs quimérico que contiene las proteínas de cápside de ambos AAV1 y AAV2. El uso de estos vectores quiméricos llamado combina los beneficios de ambos serotipos los padres, tales como acciones títulos altos (AAV1) y la purificaciónpor cromatografía de afinidad (AAV2). Estos serotipos AAV son el mejor estudiado de todos los serotipos de AAV, y todos tienen un patrón de infectividad amplio. Los vectores quiméricos descritos aquí deben tener las propiedades infecciosas de AAV1 y AAV2 y por lo tanto se puede esperar para infectar una gran variedad de tejidos, incluyendo las neuronas, músculo esquelético, páncreas, riñón, entre otros. El método descrito aquí utiliza la purificación columna de heparina, un método que cree que dar un título viral más alta y más limpio preparación viral de los métodos de purificación, tales como la centrifugación a través de un gradiente de cloruro de cesio. Además, se describe cómo estos vectores pueden ser rápida y fácilmente titulación para dar una lectura exacta del número de partículas infecciosas producidas.

Watch this Scientific Journal Video about Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors at JoVE.com

Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors

Recombinante virus adeno-asociado (rAAVs) vectores son cada vez más valioso para<em&gt; En vivo</em&gt; Los estudios en animales. Se describe cómo rAAVs se pueden producir en el laboratorio y cómo estos vectores se puede titularse para obtener una lectura precisa del número de partículas infecciosas producidas.

Producción y Titulación de recombinantes adeno-asociado vectores virales

In recent years recombinant adeno-associated viral vectors (AAV) have become increasingly valuable for in vivo studies in animals, and are also currently ...

production-and-titering-of-recombinant-adeno-associated-viral-vectors

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Recombinant Retroviral Production and Infection of B Cells

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control of a heterologous expression system to facilitate the analysis of the resulting phenotype. This approach can be used to express a gene that is not normally found in the organism, to express a mutant form of a gene product, or to over-express a dominant-negative form of the gene product. It is particularly useful in the study of the hematopoetic system, where transcriptional regulation is a major control mechanism in the development and differentiation of B cells 1, reviewed in 2-4.
Mouse genetics is a powerful tool for the study of human genes and diseases. A comparative analysis of the mouse and human genome reveals conservation of synteny in over 90% of the genome 5. Also, much of the technology used in mouse models is applicable to the study of human genes, for example, gene disruptions and allelic replacement 6. However, the creation of a transgenic mouse requires a great deal of resources of both a financial and technical nature. Several projects have begun to compile libraries of knock out mouse strains (KOMP, EUCOMM, NorCOMM) or mutagenesis induced strains (RIKEN), which require large-scale efforts and collaboration 7. Therefore, it is desirable to first study the phenotype of a desired gene in a cell culture model of primary cells before progressing to a mouse model. 
Retroviral DNA integrates into the host DNA, preferably within or near transcription units or CpG islands, resulting in stable and heritable expression of the packaged gene of interest while avoiding transcriptional silencing 8 9. The genes are then transcribed under the control of a high efficiency retroviral promoter, resulting in a high efficiency of transcription and protein production. Therefore, retroviral expression can be used with cells that are difficult to transfect, provided the cells are in an active state during mitosis. Because the structural genes of the virus are contained within the packaging cell line, the expression vectors used to clone the gene of interest contain no structural genes of the virus, which both eliminates the possibility of viral revertants and increases the safety of working with viral supernatants as no infectious virions are produced 10. 
Here we present a protocol for recombinant retroviral production and subsequent infection of splenic B cells. After isolation, the cultured splenic cells are stimulated with Th derived lymphokines and anti-CD40, which induces a burst of B cell proliferation and differentiation 11. This protocol is ideal for the study of events occurring late in B cell development and differentiation, as B cells are isolated from the spleen following initial hematopoetic events but prior to antigenic stimulation to induce plasmacytic differentiation.

An efficient system of structure and function analysis of a gene in an ex vivo culture of splenic B-lymphocytes is described. This method takes advantage of recombinant retroviral production in a helper free, ecotrophic packaging cell line. Stable, heritable expression of a gene of interest within primary lymphocytes is achieved leading to generation of surface antibodies on B cells undergoing class switch recombination.

Recombinante de producción retrovirales y la infección de células B

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control ...

Investigación

Inmunología e Infección

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the generation of extreme population diversity that facilitates virus adaptation and evolution. Increasing evidence shows that the intrinsic error rates, and the resulting mutation frequencies, of RNA viruses can be modulated by subtle amino acid changes to the viral polymerase. Although biochemical assays exist for some viral RNA polymerases that permit quantitative measure of incorporation fidelity, here we describe a simple method of measuring mutation frequencies of RNA viruses that has proven to be as accurate as biochemical approaches in identifying fidelity altering mutations. The approach uses conventional virological and sequencing techniques that can be performed in most biology laboratories. Based on our experience with a number of different viruses, we have identified the key steps that must be optimized to increase the likelihood of isolating fidelity variants and generating data of statistical significance. The isolation and characterization of fidelity altering mutations can provide new insights into polymerase structure and function1-3. Furthermore, these fidelity variants can be useful tools in characterizing mechanisms of virus adaptation and evolution4-7.

The present article describes the steps required to isolate and characterize RNA polymerase fidelity variants of RNA viruses and how to use mutation frequency data to confirm fidelity changes in tissue culture.

El aislamiento de las variantes de los virus de ARN de fidelidad y caracterización de la frecuencia de mutación de virus

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

Efficient Recombinant Parvovirus Production with the Help of Adenovirus-derived Systems

Rodent parvoviruses (PV) such as rat H-1PV and MVM, are small icosahedral, single stranded, DNA viruses. Their genome includes two promoters P4 and P38 which regulate the expression of non-structural (NS1 and NS2) and capsid proteins (VP1 and VP2) respectively1. They attract high interest as anticancer agents for their oncolytic and oncosuppressive abilities while being non-pathogenic for humans2. NS1 is the major effector of viral cytotoxicity3. In order to further enhance their natural antineoplastic activities, derivatives from these vectors have been generated by replacing the gene encoding for the capsid proteins with a therapeutic transgene (e.g. a cytotoxic polypeptide, cytokine, chemokine, tumour suppressor gene etc.)4. The recombinant parvoviruses (recPVs) vector retains the NS1/2 coding sequences and the PV genome telomeres which are necessary for viral DNA amplification and packaging. Production of recPVs occurs only in the producer cells (generally HEK293T), by co-transfecting the cells with a second vector (pCMV-VP) expressing the gene encoding for the VP proteins (Fig. 1)4. The recPV vectors generated in this way are replication defective. Although recPVs proved to possess enhanced oncotoxic activities with respect to the parental viruses from which they have been generated, their production remains a major challenge and strongly hampers the use of these agents in anti-cancer clinical applications.
We found that introduction of an Ad-5 derived vector containing the E2a, E4(orf6) and the VA RNA genes (e.g. pXX6 plasmid) into HEK293T improved the production of recPVs by more than 10 fold in comparison to other protocols in use. Based on this finding, we have constructed a novel Ad-VP-helper that contains the genomic adenoviral elements necessary to enhance recPVs production as well as the parvovirus VP gene unit5. The use of Ad-VP-helper, allows production of rec-PVs using a protocol that relies entirely on viral infection steps (as opposed to plasmid transfection), making possible the use of cell lines that are difficult to transfect (e.g. NB324K) (Fig. 2). We present a method that greatly improves the amount of recombinant virus produced, reducing both the production time and costs, without affecting the quality of the final product5. In addition, large scale production of recPV (in suspension cells and bioreactors) is now conceivable.

Here we describe a protocol based only on cell infection, which improves the efficiency of recombinant parvovirus production by more than 100 fold in comparison to other protocols in use. This protocol relies on the use of a novel adenovirus 5-based helper containing the parvovirus VP transcription unit (Ad-VP).

Producción eficiente de parvovirus recombinante con la ayuda de derivados de adenovirus-Systems

Rodent parvoviruses (PV) such as rat H-1PV and MVM, are small icosahedral, single stranded, DNA viruses. Their genome includes two promoters P4 and P38 ...

Engineering and Evolution of Synthetic Adeno-Associated Virus (AAV) Gene Therapy Vectors via DNA Family Shuffling

Adeno-associated viral (AAV) vectors represent some of the most potent and promising vehicles for therapeutic human gene transfer due to a unique combination of beneficial properties1. These include the apathogenicity of the underlying wildtype viruses and the highly advanced methodologies for production of high-titer, high-purity and clinical-grade recombinant vectors2. A further particular advantage of the AAV system over other viruses is the availability of a wealth of naturally occurring serotypes which differ in essential properties yet can all be easily engineered as vectors using a common protocol1,2. Moreover, a number of groups including our own have recently devised strategies to use these natural viruses as templates for the creation of synthetic vectors which either combine the assets of multiple input serotypes, or which enhance the properties of a single isolate. The respective technologies to achieve these goals are either DNA family shuffling3, i.e. fragmentation of various AAV capsid genes followed by their re-assembly based on partial homologies (typically &gt;80% for most AAV serotypes), or peptide display4,5, i.e. insertion of usually seven amino acids into an exposed loop of the viral capsid where the peptide ideally mediates re-targeting to a desired cell type. For maximum success, both methods are applied in a high-throughput fashion whereby the protocols are up-scaled to yield libraries of around one million distinct capsid variants. Each clone is then comprised of a unique combination of numerous parental viruses (DNA shuffling approach) or contains a distinctive peptide within the same viral backbone (peptide display approach). The subsequent final step is iterative selection of such a library on target cells in order to enrich for individual capsids fulfilling most or ideally all requirements of the selection process. The latter preferably combines positive pressure, such as growth on a certain cell type of interest, with negative selection, for instance elimination of all capsids reacting with anti-AAV antibodies. This combination increases chances that synthetic capsids surviving the selection match the needs of the given application in a manner that would probably not have been found in any naturally occurring AAV isolate. Here, we focus on the DNA family shuffling method as the theoretically and experimentally more challenging of the two technologies. We describe and demonstrate all essential steps for the generation and selection of shuffled AAV libraries (Fig. 1), and then discuss the pitfalls and critical aspects of the protocols that one needs to be aware of in order to succeed with molecular AAV evolution.

Engineering and Evolution of Synthetic Adeno-Associated Virus AAV Gene Therapy Vectors via DNA Family Shuffling

We demonstrate the basic technique to molecularly engineer and evolve synthetic Adeno-associated viral (AAV) gene therapy vectors via DNA family shuffling. Moreover, we provide general guidelines and representative examples for selection and analysis of individual chimeric capsids with enhanced properties on target cells in culture or in mice.

Ingeniería y Evolución de la sintética virus adeno-asociado (AAV) vectores de terapia génica a través de la familia transposición de ADN

Adeno-associated viral (AAV) vectors represent some of the most potent and promising vehicles for therapeutic human gene transfer due to a unique ...

Production and Purification of Non Replicative Canine Adenovirus Type 2 Derived Vectors

Adenovirus (Ad) derived vectors have been widely used for short or long-term gene transfer, both for gene therapy and vaccine applications. Because of the frequent pre-existing immunity against the classically used human adenovirus type 5, canine adenovirus type 2 (CAV2) has been proposed as an alternative vector for human gene transfer. The well-characterized biology of CAV2, together with its ease of genetic manipulation, offer major advantages, notably for gene transfer into the central nervous system, or for inducing a wide range of protective immune responses, from humoral to cellular immunity. Nowadays, CAV2 represents one of the most appealing nonhuman adenovirus for use as a vaccine vector. This protocol describes a simple method to construct, produce and titer recombinant CAV2 vectors. After cloning the expression cassette of the gene of interest into a shuttle plasmid, the recombinant genomic plasmid is obtained by homologous recombination in the E. coli BJ5183 bacterial strain. The resulting genomic plasmid is then transfected into canine kidney cells expressing the complementing CAV2-E1 genes (DK-E1). A viral amplification enables the production of a large viral stock, which is purified by ultracentrifugation through cesium chloride gradients and desalted by dialysis. The resulting viral suspension routinely has a titer of over 1010 infectious particles per ml and can be directly administrated in vivo.

These past 15 years, canine adenovirus type 2 (CAV2)-derived vectors have proven their efficiency to transduce cells in vitro&#160;and in vivo and are widely used for vaccination and gene therapy. Here, we describe a procedure to construct, produce and purify CAV2 vectors, giving rise to high-titer viral suspensions.

Producción y purificación de no replicativa adenovirus canino tipo 2 vectores derivados

Adenovirus (Ad) derived vectors have been widely used for short or long-term gene transfer, both for gene therapy and vaccine applications. Because of the ...

Dissecting Innate Immune Signaling in Viral Evasion of Cytokine Production

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. Conversely, viruses have evolved intricate strategies to evade and exploit host immune signaling for survival and propagation. Viral immune evasion, entailing host defense and viral evasion, provides one of the most fascinating and dynamic interfaces to discern the host-virus interaction. These studies advance our understanding in innate immune regulation and pave our way to develop novel antiviral therapies.
Murine &#947;HV68 is a natural pathogen of murine rodents. &#947;HV68 infection of mice provides a tractable small animal model to examine the antiviral response to human KSHV and EBV of which perturbation of in vivo virus-host interactions is not applicable. Here we describe a protocol to determine the antiviral cytokine production. This protocol can be adapted to other viruses and signaling pathways.
Recently, we have discovered that &#947;HV68 hijacks MAVS and IKK&#946;, key innate immune signaling components downstream of the cytosolic RIG-I and MDA5, to abrogate NF&#922;B activation and antiviral cytokine production. Specifically, &#947;HV68 infection activates IKK&#946; and that activated IKK&#946; phosphorylates RelA to accelerate RelA degradation. As such, &#947;HV68 efficiently uncouples NF&#922;B activation from its upstream activated IKK&#946;, negating antiviral cytokine gene expression. This study elucidates an intricate strategy whereby the upstream innate immune activation is intercepted by a viral pathogen to nullify the immediate downstream transcriptional activation and evade antiviral cytokine production.

We describe a protocol to measure the antiviral cytokine production in mice infected with a model herpesvirus, murine gamma herpesvirus 68 (&#947;HV68) that is closely-related to human Kaposi&#8217;s sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) and Epstein-Barr virus (EBV). Utilizing genetically modified mouse strains and mouse embryonic fibroblasts (MEFs), we assessed the antiviral cytokine production both in vivo and ex vivo. &#8220;Reconstituting&#8221; the expression of innate immune components in knockout embryonic fibroblasts by lentiviral transduction, we further pinpoint specific innate immune molecules and dissect the key signaling events that differentially regulate the antiviral cytokine production.

La disección de señalización inmune innata en Evasion Viral de la producción de citoquinas

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. burnetii DNA in cell cultures and clinical samples. PCR requires specialized equipment and extensive end user training, and therefore, it is not suitable for routine work especially in a resource-constrained area. We have developed a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay to detect the presence of C. burnetii in patient samples. This method is performed at a single temperature around 60 &#176;C in a water bath or heating block. The sensitivity of this LAMP assay is very similar to PCR with a detection limit of about 25 copies per reaction. This report describes the preparation of the reaction using lyophilized reagents and visualization of results using hydroxynaphthol blue (HNB) or a UV lamp with fluorescent intercalating dye in the reaction. The LAMP reagents were lyophilized and stored at room temperature (RT) for one month without loss of detection sensitivity. This LAMP assay is particularly robust because the reaction mixture preparation does not involve complex steps. This method is ideal for use in resource-limited settings where Q fever is endemic.

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

We described here a simple loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method using lyophilized reagents for the detection of C. burnetii in patient samples.

El desarrollo de la mediación de la Loop liofilizada amplificación isotérmica reactivos para la detección de<em&gt; Coxiella burnetii</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional methods to measure NA inhibiting (NI) antibody titers are not practical for routine serology. This protocol describes the enzyme-linked lectin assay (ELLA), a practical alternative method to measure NI titers that is performed in 96 well plates coated with a large glycoprotein substrate, fetuin. NA cleaves terminal sialic acids from fetuin, exposing the penultimate sugar, galactose. Peanut agglutinin (PNA) is a lectin with specificity for galactose and therefore the extent of desialylation can be quantified using a PNA-horseradish peroxidase conjugate, followed by addition of a chromogenic peroxidase substrate. The optical density that is measured is proportional to NA activity. To measure NI antibody titers, serial dilutions of sera are incubated at 37 &#176;C O/N on fetuin-coated plates with a fixed amount of NA. The reciprocal of the highest serum dilution that results in &#8805;50% inhibition of NA activity is designated as the NI antibody titer. The ELLA provides a practical format for routine evaluation of human antibody responses following influenza infection or vaccination.

We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.

La medición de la influenza neuraminidasa inhibición títulos de anticuerpos mediante un ensayo de lectina ligado a enzimas

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the person-to-person route or indirectly through environmental surfaces or food, contaminated fomites and inanimate surfaces are important vehicles for the spread of the virus during norovirus outbreaks.
We developed and evaluated a protocol using macrofoam swabs for the detection and typing of human noroviruses from hard surfaces. Compared with fiber-tipped swabs or antistatic wipes, macrofoam swabs allow virus recovery (range 1.2-33.6%) from toilet seat surfaces of up to 700 cm2. The protocol includes steps for the extraction of the virus from the swabs and further concentration of the viral RNA using spin columns. In total, 127 (58.5%) of 217 swab samples that had been collected from surfaces in cruise ships and long-term care facilities where norovirus gastroenteritis had been reported tested positive for GII norovirus by RT-qPCR. Of these 29 (22.8%) could be successfully genotyped. In conclusion, detection of norovirus on environmental surfaces using the protocol we developed may assist in determining the level of environmental contamination during outbreaks as well as detection of virus when clinical samples are not available; it may also facilitate monitoring of effectiveness of remediation strategies.

A macrofoam based sampling methodology was developed and evaluated for the detection and quantification of norovirus on environmental hard surfaces.

Método de muestreo hisopo para la Detección de norovirus humano en superficies

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and cellular proteins by mass spectrometry. Although proteins that interact with viral genomes play major roles in determining the outcome of infection, a comprehensive analysis of viral genome associated proteins was not previously feasible. Here we demonstrate a method that enables the direct purification of HSV-1 genomes from infected cells. Replicating viral DNA is selectively labeled with modified nucleotides that contain an alkyne functional group. Labeled DNA is then specifically and irreversibly tagged via the covalent attachment of biotin azide via a copper(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition or click reaction. Biotin-tagged DNA is purified on streptavidin-coated beads and associated proteins are eluted and identified by mass spectrometry. This method enables the selective targeting and isolation of HSV-1 replication forks or whole genomes from complex biological environments. Furthermore, adaptation of this approach will allow for the investigation of various aspects of herpesviral infection, as well as the examination of the genomes of other DNA viruses.

The goal of this protocol is to specifically tag and selectively isolate viral DNA from infected cells for the characterization of viral genome associated proteins.